Summary
La présente étude montre la mise en place de trois modèles différents de don pulmonaire (don post-mort cérébrale, don post-mort circulatoire et don post-choc hémorragique). Il compare les processus inflammatoires et les troubles pathologiques associés à ces événements.
Abstract
Les modèles expérimentaux sont des outils importants pour comprendre les phénomènes étiologiques impliqués dans divers événements physiopathologiques. Dans ce contexte, différents modèles animaux sont utilisés pour étudier les éléments déclenchant la physiopathologie du dysfonctionnement primaire du greffon après transplantation afin d’évaluer les traitements potentiels. À l’heure actuelle, nous pouvons diviser les modèles expérimentaux de don en deux grands groupes : le don après mort cérébrale et le don après arrêt circulatoire. De plus, les effets délétères associés au choc hémorragique doivent être pris en compte lors de l’examen des modèles animaux de don d’organes. Nous décrivons ici la mise en place de trois modèles de don pulmonaire différents (don post-mort cérébrale, don post-mort circulatoire et don post-choc hémorragique) et comparons les processus inflammatoires et les troubles pathologiques associés à ces événements. L’objectif est de fournir à la communauté scientifique des modèles animaux fiables de don de poumons pour étudier les mécanismes pathologiques associés et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’optimiser le nombre de greffons viables pour la transplantation.
Introduction
Pertinence clinique
La transplantation d’organes est une option thérapeutique bien établie pour plusieurs pathologies graves. Au cours des dernières années, de nombreuses avancées ont été réalisées dans les domaines cliniques et expérimentaux de la transplantation d’organes, telles qu’une meilleure connaissance de la physiopathologie de la dysfonction primaire du greffon (DPI) et des avancées dans les domaines des soins intensifs, de l’immunologie et de la pharmacologie 1,2,3. Malgré les réalisations et les améliorations de la qualité des procédures chirurgicales et pharmacologiques associées, la relation entre le nombre d’organes disponibles et le nombre de receveurs sur la liste d’attente reste l’un des principaux défis 2,4. À cet égard, la littérature scientifique a proposé des modèles animaux pour l’étude de thérapies qui peuvent être appliquées aux donneurs d’organes pour traiter et/ou conserver les organes jusqu’au moment de la transplantation 5,6,7,8.
En mimant les différents événements observés en pratique clinique, les modèles animaux permettent d’étudier les mécanismes pathologiques associés et leurs approches thérapeutiques respectives. L’induction expérimentale de ces événements, dans la plupart des cas isolés, a généré des modèles expérimentaux de don d’organes et de tissus qui sont largement étudiés dans la littérature scientifique sur la transplantation d’organes 6,7,8,9. Ces études emploient différentes stratégies méthodologiques, telles que celles induisant la mort cérébrale (BD), le choc hémorragique (HS) et la mort circulatoire (CD), car ces événements sont associés à différents processus délétères qui compromettent la fonctionnalité des organes et tissus donnés.
Mort cérébrale (BD)
La BD est associée à une série d’événements qui conduisent à la détérioration progressive de différents systèmes. Elle survient généralement lorsqu’une augmentation aiguë ou progressive de la pression intracrânienne (PIC) se produit en raison d’un traumatisme cérébral ou d’une hémorragie. Cette augmentation de la PIC favorise une augmentation de la pression artérielle dans le but de maintenir un flux sanguin cérébral stable dans un processus connu sous le nom de réflexe de Cushing10,11. Ces changements aigus peuvent entraîner des dysfonctionnements cardiovasculaires, endocriniens et neurologiques qui compromettent la quantité et la qualité des organes donnés, en plus d’avoir un impact sur la morbidité et la mortalité post-transplantation 10,11,12,13.
Choc hémorragique (HS)
L’HS, quant à elle, est souvent associée aux donneurs d’organes, car la plupart d’entre eux sont victimes de traumatismes avec une perte importante de volume sanguin. Certains organes, tels que les poumons et le cœur, sont particulièrement vulnérables à l’HS en raison de l’hypovolémie et de l’hypoperfusion tissulaire qui en résulte14. L’HS induit des lésions pulmonaires par une augmentation de la perméabilité capillaire, un œdème et une infiltration de cellules inflammatoires, des mécanismes qui, ensemble, compromettent les échanges gazeux et conduisent à une détérioration progressive des organes, faisant ainsi dérailler le processus de don 6,14.
Mort circulatoire (MC)
L’utilisation du don post-MC a connu une croissance exponentielle dans les grands centres mondiaux, contribuant ainsi à l’augmentation du nombre d’organes collectés. Les organes prélevés sur des donneurs post-MC sont vulnérables aux effets de l’ischémie chaude, qui survient après un intervalle de faible (phase agonique) ou d’absence d’apport sanguin (phase asystolique)8,15. L’hypoperfusion ou l’absence de circulation sanguine entraînera une hypoxie tissulaire associée à la perte brutale d’ATP et à l’accumulation de toxines métaboliques dans les tissus15. Malgré son utilisation actuelle pour la transplantation en pratique clinique, de nombreux doutes subsistent quant à l’impact de l’utilisation de ces organes sur la qualité du greffon post-greffe et sur la survie des patients15. Ainsi, l’utilisation de modèles expérimentaux pour une meilleure compréhension des facteurs étiologiques associés à la MC est également en croissance 8,15,16,17.
Modèles expérimentaux
Il existe différents modèles expérimentaux de don d’organes (BD, HS et CD). Cependant, les études se concentrent souvent sur une seule stratégie à la fois. Il y a une lacune notable dans les études qui combinent ou comparent deux stratégies ou plus. Ces modèles sont très utiles dans le développement de thérapies qui cherchent à augmenter le nombre de dons et, par conséquent, à réduire la liste d’attente des receveurs potentiels. Les espèces animales utilisées à cette fin varient d’une étude à l’autre, les modèles porcins étant plus souvent sélectionnés lorsque l’objectif est une traduction plus directe avec la physiologie morpho humaine et moins de difficulté technique dans l’acte chirurgical en raison de la taille de l’animal. Malgré les avantages, des difficultés logistiques et des coûts élevés sont associés au modèle porcin. D’autre part, le faible coût et la possibilité de manipulation biologique favorisent l’utilisation de modèles de rongeurs, permettant au chercheur de partir d’un modèle fiable pour reproduire et traiter les lésions, ainsi que d’intégrer les connaissances acquises dans le domaine de la transplantation d’organes.
Nous présentons ici un modèle de rongeur de mort cérébrale, de mort circulatoire et de don de choc hémorragique. Nous décrivons les processus inflammatoires et les états pathologiques associés à chacun de ces modèles.
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Protocol
L’expérimentation animale s’est conformée au Comité d’éthique pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire de la Faculté de médecine de l’Université de São Paulo (numéro de protocole 112/16).
1. Regroupement d’animaux
- Assigner au hasard douze rats Sprague Dawley mâles (250 à 300 g) à l’un des trois groupes expérimentaux (n = 4) afin d’analyser et de comparer les effets associés aux modèles animaux.
- Assigner les animaux au groupe choc hémorragique (HS, n=4) : animaux soumis à un cathétérisme vasculaire avec induction d’un choc hémorragique + entretien pendant 360 min + extraction du bloc cardiopulmonaire + préparation de l’échantillon pour analyse.
- Assigner les animaux au groupe de mort cérébrale (BD, n=4) : animaux soumis à la mort cérébrale + entretien pendant 360 min + extraction du bloc cardiopulmonaire + préparation de l’échantillon pour analyse.
- Assigner les animaux au groupe de mort circulatoire (CD, n=4) : animaux soumis à un cathétérisme vasculaire + induction de la mort circulatoire + suspension de la ventilation + ischémie à température ambiante pendant 180 min + préparation de l’échantillon pour analyse.
2. Anesthésie et préparation préopératoire
- Placez le rat dans une chambre fermée avec 5% d’isoflurane pendant 1 à 4 min. Confirmez l’anesthésie appropriée en vérifiant le réflexe de pincement des orteils. En l’absence de réactions réflexes (pas de rétraction de la patte), réaliser une intubation orotrachéale (angiocathe 14-G) à l’aide d’un laryngoscope pédiatrique.
- À l’aide d’un ventilateur mécanique préalablement réglé (FiO2 100 %, volume courant 10 mL/kg, 90 cycles/min et PEEP 3,0 cmH2O), connectez le cathéter trachéal au ventilateur et ajustez la concentration d’anesthésique à 2 %.
REMARQUE : Toutes les procédures liées aux modèles animaux ont suivi le même protocole d’anesthésie que celui décrit dans cette section. - Retirez la fourrure des régions d’intérêt (tête, cou, poitrine et abdomen). Ensuite, à l’aide d’une gaze, désinfectez le champ opératoire et la queue de l’animal. La désinfection est effectuée avec trois cycles alternés d’une solution alcoolique de gommage au digluconate de chlorhexidine.
- Coupez le bout de la queue de l’animal, placez le pouce et l’index sur la base de la queue, puis appuyez et faites-les glisser loin de la base. Prélever un échantillon de sang périphérique (20 μL) par la queue pour obtenir le nombre total de leucocytes8.
REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée avant le début de la trachéotomie et immédiatement à la fin de chaque protocole (BD et HS - après 360 min). - À l’aide d’une pipette de précision, diluer le sang recueilli dans 380 μL (1 :20) de solution de Turk (acide acétique glacial 99 %). Une fois dilué, pipetez l’échantillon de sang dans une chambre Neubauer et placez-le sous un microscope (40x). Effectuez la numération leucocytaire totale dans les quatre quadrants latéraux de la chambre.
3. Trachéotomie
- À l’aide de ciseaux et de pinces appropriés, effectuez une dissection longitudinale de la trachée cervicale, en partant du tiers médian du cou jusqu’à l’encoche sus-sternale (
incision de 1,5 cm). Après l’incision de la peau et du tissu sous-cutané, disséquez les muscles cervicaux jusqu’à ce que la trachée soit exposée. - Placez une ligature de soie 2-0 sous la trachée.
- À l’aide de microciseaux, trachéotomisez le tiers supérieur de la trachée pour obtenir une ventilation uniforme. Coupez horizontalement la trachée entre deux anneaux cartilagineux pour s’adapter au diamètre d’une canule métallique (3,5 cm).
- Insérez le tube de ventilation et fixez-le avec des ligatures préparées.
- Connectez le tube de ventilation au système de ventilation pour petits animaux.
- Ventiler le rat avec un volume courant de 10 mL/kg, un débit de 70 cycles/min et une PEEP de 3 cmH2O.
incision de 1,5 cm). Après l’incision de la peau et du tissu sous-cutané, disséquez les muscles cervicaux jusqu’à ce que la trachée soit exposée.4. Cathétérisme de l’artère fémorale et des veines
- Exposez le triangle fémoral par une petite incision (1,5 cm) dans la région inguinale. Identifier et isoler les vaisseaux fémoraux. Pour cette procédure, utilisez un stéréomicroscope (grossissement 3,2x).
- Placez deux ligatures de soie 4-0 sous les vaisseaux sanguins (veine ou artère), l’une distale et l’autre proximale. Fermez la ligature la plus distale, puis placez un nœud préajusté dans la ligature proximale et tirez.
- Insérez le cathéter à travers une petite incision préformée dans les vaisseaux. Fixez la canule pour éviter la luxation.
REMARQUE : Faire en sorte que les cathéters d’une rallonge néonatale de 20 cm soudés par chauffage à un cathéter intraveineux périphérique adapté au calibre du réseau veineux de l’animal, empêchant ainsi la régurgitation du contenu sanguin. Lubrifiez la canule avec de l’héparine, en évitant la formation de thrombus et de complications lors de la mesure de la pression artérielle moyenne (MAP). - Connectez le cathéter artériel à un transducteur de pression et à un système de surveillance des signes vitaux pour enregistrer la pression artérielle moyenne (MAP). Le transducteur doit être positionné au niveau du cœur de l’animal. Enregistrez la carte toutes les 10 minutes.
- Placez le cathéter seringue (3 ml) dans la veine, en visant l’hydratation et l’exsanguination si nécessaire.
5. Induction d’un choc hémorragique
- Par voie veineuse et à l’aide d’une seringue héparinisée, prélever de petits volumes de sang jusqu’à ce que des valeurs de MAP de 50 mmHg soient atteintes, établissant ainsi un choc hémorragique.
REMARQUE : Prélever une aliquote de 2 mL de sang toutes les 10 minutes au cours de la première heure de l’expérience et toutes les 30 minutes au cours des heures suivantes. - Maintenez la pression stable à environ 50 mmHg pendant une période de 360 min. Pour ce faire, retirez ou ajoutez des aliquotes de sang si la pression augmente ou diminue, respectivement.
- Placez une source de chaleur à proximité pour éviter l’hypothermie.
REMARQUE : Ici, une lampe chauffante est utilisée. - À la fin du protocole, prélevez le bloc pulmonaire à la capacité pulmonaire totale (CCM) et congelez-le rapidement dans de l’azote liquide ou placez-le dans une solution de fixation pour des études ultérieures.
REMARQUE : À l’aide d’un ventilateur pour petit animal, les paramètres ventilatoires sont accessibles pendant le protocole. Dans la présente étude, ces paramètres ont été évalués immédiatement avant l’induction de l’HS (ligne de base) et 360 minutes plus tard (finale).
6. Induction de la mort circulatoire
- Pour induire la mort circulatoire, administrer 150 mg/kg de thiopental de sodium par voie veineuse. Éteignez ensuite le système de ventilation.
- Notez la diminution progressive de la MAP jusqu’à ce qu’elle atteigne 0 mmHg. À partir de ce point, considérez le début de la période d’ischémie chaude et commencez le décompte du temps. L’animal doit rester à température ambiante (environ 22 °C) pendant 180 min.
- À la fin du protocole, rebranchez les poumons au ventilateur mécanique et prélevez le bloc pulmonaire à TLC pour le prélèvement. Soit la congélation éclair à l’aide d’azote liquide, soit la placer dans la solution de fixation pour des études plus approfondies.
7. Induction de la mort cérébrale
- Placez le rat en position couchée.
- Retirez la peau du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Percer un trou de forage de calibre 1 mm, 2,80 mm à l’avant et 10,0 mm ventral à bregma et 1,5 mm latéral à la suture sagittale.
- Insérez l’ensemble du cathéter à ballonnet dans la cavité crânienne et assurez-vous que le ballonnet est prérempli de solution saline (500 μL).
- À l’aide d’une seringue, gonflez rapidement le cathéter.
- Confirmez la mort cérébrale en observant une élévation brutale de la MAP (réflexe de Cushing), l’absence de réflexes, la mydriase bilatérale et l’apnée. Après confirmation, arrêtez l’anesthésie et maintenez l’animal sous ventilation mécanique pendant 360 minutes.
- Placez une source de chaleur à proximité pour éviter l’hypothermie.
- À la fin du protocole, prélever le bloc pulmonaire à TLC pour le prélèvement et soit le congeler dans de l’azote liquide, soit le placer dans une solution de fixation pour des études plus approfondies.
REMARQUE : À l’aide d’un ventilateur pour petit animal, les paramètres ventilatoires sont accessibles pendant le protocole. Dans la présente étude, nous avons évalué ces paramètres immédiatement avant l’induction de la BD (ligne de base) et après 360 minutes (finale).
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Representative Results
Pression artérielle moyenne (MAP)
Pour déterminer les répercussions hémodynamiques de la BD et de l’HS, la MAP a été évaluée sur les 360 minutes du protocole. La mesure de base a été recueillie après l’ablation de la peau et le forage du crâne et avant le prélèvement d’aliquotes sanguines pour les animaux soumis à la BD ou à l’HS, respectivement. Avant l’induction de BD et d’HS, la MAP de base des deux groupes était similaire (BD : 110,5 ± 6,1 vs HS : 105,8 ± 2,3 mmHg ; p = 0,5 ; ANOVA à deux facteurs). Après l’insufflation du cathéter, le groupe BD a connu une augmentation soudaine de la pression artérielle (138,7 ± 10,1 mmHg). Le pic hypertensif est un événement particulier lié à l’augmentation de la pression intracrânienne et peut être considéré comme la première preuve de l’établissement de la BD. De plus, nous avons observé l’absence de réflexes, la mydriase bilatérale et l’apnée post-inflation chez tous les animaux. Ce pic de pression a été suivi d’une diminution rapide de la MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). L’hypotension a persisté pendant environ 50 minutes, après quoi les taux de MAP sont revenus à des valeurs proches de celles de la ligne de base (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (Figure 1).
Contrairement au groupe BD, la diminution de la MAP dans le groupe HS est associée au retrait des aliquotes sanguines dans les 10 premières minutes de l’expérience. Le choc hypovolémique a été maintenu pendant 360 min (variation moyenne tout au long du protocole de 52,3 ± 1,2 mmHg). Après la fin du protocole, le groupe BD a montré un schéma MAP significativement différent au cours du suivi de 6 heures par rapport au groupe HS (BD : 93,7 ± 4,5 vs HS : 52,3 ± 0,5 mmHg ; p<0,0001 ; Test t de l’étudiant).
Mécanique pulmonaire
Afin d’évaluer les paramètres élastiques et résistifs du système respiratoire, une analyse de la mécanique pulmonaire des animaux soumis à la BD et à l’HS a été réalisée. 360 min après le début et après le maintien de l’hypotension, le groupe HS a montré une résistance accrue du tissu pulmonaire (G) (HS : Ligne de base - 0,26 ± 0,02 vs. Finale - 0,51 ± 0,05 cmH2O.mL-1 ; p = 0,03 ; bidirectionnel ANOVA), suivie d’une réduction de l’observance de l’appareil respiratoire (Crs) (HS : Ligne de base - 0,64 ± 0,05 vs Finale - 0,23 ± 0,004 cmH2O/mL ; p = 0,001 ; bidirectionnel ANOVA) (Figure 2A,B).
Œdème pulmonaire
À la fin du protocole, le lobe moyen du poumon droit a été prélevé pour tous les groupes, et son poids a été mesuré pour analyser le rapport poids humide/sec, qui a été utilisé comme indice d’œdème pulmonaire. Le poids humide a été évalué immédiatement après l’extraction de l’organe, et le poids sec a été mesuré après 24 h dans un four à 80 °C. Selon ce rapport, le groupe BD (2,32 ± 0,1) présentait un œdème plus important que le groupe HS (1,97 ± 0,03) et le groupe CD (2,04 ± 0,02) (Figure 3).
Paramètres inflammatoires systémiques et tissulaires
À la fin du protocole, il y a eu une augmentation significative du nombre total de leucocytes systémiques dans le groupe qui a subi une HS (ligne de base - 13888 ± 887,3 vs finale - 35263 ± 4076 mm3 ; p = 0,0189) ; bidirectionnel ANOVA) (Figure 4). Le groupe HS a également montré une augmentation du nombre de leucocytes à la fois par rapport aux valeurs initiales et par rapport au groupe BD (p = 0,0132).
L’inflammation tissulaire a été évaluée en quantifiant les marqueurs inflammatoires dans le tissu pulmonaire. À cette fin, des échantillons de biopsie de tissu pulmonaire ont été homogénéisés dans un tampon phosphate, puis envoyés pour analyse de l’expression du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et de l’interleukine 1 bêta (IL1-β). Les niveaux d’expression de l’IL1-β étaient plus élevés dans le groupe BD (304,4 ± 91 pg/mg) et le groupe HS (327,5 ± 25,2 pg/mg) que dans le groupe CD (8 ± 2,3 pg/mg ; p = 0,004 ; à sens unique ANOVA) (figure 5B). Le groupe HS a également montré des niveaux plus élevés de TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg ; p<0,0001 ; à sens unique ANOVA) que le groupe BD (1,3 ± 0,3 pg/mg) et le groupe CD (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Figure 5B).
Figure 1 : Évolution temporelle de la pression artérielle moyenne (MAP) dans les groupes de mort cérébrale (BD) et de choc hémorragique (HS). Les valeurs de toutes les mesures sont exprimées sous forme de moyennes ± d’erreurs-types des moyennes (MEB). MAP, pression artérielle moyenne ; BD, mort cérébrale ; HS, choc hémorragique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mécanique pulmonaire. La mécanique pulmonaire telle que déterminée par (A) la compliance du système respiratoire et (B) la résistance tissulaire dans le groupe de mort cérébrale (BD) et le groupe de choc hémorragique (HS). * indique des différences significatives entre les valeurs initiales et finales dans le groupe SH (p<0,05). Les valeurs de toutes les mesures sont exprimées sous forme de moyennes ± d’erreurs-types des moyennes (MEB), et l’ANOVA à deux facteurs a été utilisée pour les comparaisons. Crs, compliance du système respiratoire ; G, résistance des tissus ; BD, mort cérébrale ; HS, choc hémorragique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Œdème pulmonaire déterminé par le rapport poids humide/sec des poumons dans le groupe mort cérébrale (BD) et le groupe choc hémorragique (HS). Les valeurs de toutes les mesures sont exprimées sous forme de moyennes ± d’erreurs-types des moyennes (MEB), et des comparaisons ont été faites avec l’ANOVA à un facteur. BD, mort cérébrale ; HS, choc hémorragique ; CD, mort circulatoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Leucogramme du groupe choc hémorragique (HS) et du groupe mort cérébrale (BD). * indique des différences significatives entre les valeurs initiales et finales dans le groupe HS (p<0,05). Les valeurs de toutes les mesures sont exprimées sous forme de moyennes ± erreurs types de la moyenne (MEB), et des comparaisons ont été faites avec l’ANOVA à deux facteurs. BD, mort cérébrale ; HS, choc hémorragique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les réponses inflammatoires locales étaient moins importantes dans le groupe mort circulatoire (MC). (A) Expression de l’IL-1β dans les tissus pulmonaires ; (B) Expression du TNF-α dans les tissus pulmonaires. Les valeurs de toutes les mesures sont exprimées sous forme de moyennes ± erreurs types de la moyenne (MEB), et des comparaisons ont été faites avec l’ANOVA à un facteur. BD, mort cérébrale ; HS, choc hémorragique ; CD, mort circulatoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ces dernières années, le nombre croissant de diagnostics de mort cérébrale l’a conduit à devenir le plus grand fournisseur d’organes et de tissus destinés à la transplantation. Cette croissance s’est toutefois accompagnée d’une augmentation incroyable des dons après la mort circulatoire. Malgré sa nature multifactorielle, la plupart des mécanismes déclencheurs des causes de décès commencent après ou accompagnent un traumatisme avec une perte importante de la teneur en sang 4,18.
Dans ce contexte, les modèles expérimentaux de mort cérébrale, d’arrêt circulatoire et de choc hémorragique sont des outils importants pour l’étude prospective des complications associées à la cause du décès du donneur et de leur impact sur la viabilité des organes potentiels destinés à la transplantation 6,8,10. Plusieurs lignées animales ont été suggérées pour l’établissement de modèles, tels que le porc, le lapin, le rat et la souris. Les modèles de rats et de souris sont plus fréquents dans la littérature car ils ne sont pas très coûteux et impliquent une faible difficulté logistique tout en reproduisant de manière satisfaisante les événements physiopathologiques étudiés 8,13,14,15.
Nous tenons à souligner que des lignes directrices et des études récentes ont approuvé l’utilisation de l’analgésie pré-anesthésique comme partie intégrante des protocoles chirurgicaux, même dans les situations aiguës, visant une prise en charge plus complète de la douleur périopératoire et du bien-être des animaux. Nous recommandons aux chercheurs d’évaluer une telle approche dans de futures études.
Mort cérébrale (BD)
Le modèle BD s’est avéré reproductible au moyen d’une augmentation brutale de la PIC. L’utilisation d’instruments appropriés et d’un personnel formé permet le succès chirurgical et la reproduction de la technique avec quelques semaines de formation. Au cours du développement de la technique BD, la trépanation doit être effectuée avec une perceuse motorisée appropriée afin qu’il n’y ait pas de mou dans le cathéter, empêchant ainsi la projection de tissu cérébral hors du trou. De plus, pendant le forage, le mouvement vers l’avant de la perceuse doit être arrêté dès que la résistance initiale offerte par le crâne est surmontée.
Les chercheurs doivent rester vigilants et veiller à ce que le cathéter soit rapidement gonflé, car le gonflage progressif favorise des réponses inflammatoires et hémodynamiques distinctes21. Les changements de pression artérielle, à leur tour, doivent être surveillés en permanence tout au long du protocole, en particulier pendant l’insufflation du cathéter, qui doit s’accompagner d’une augmentation brutale de la MAP et pendant la première heure suivant l’établissement de la BD (période d’hypotension post-gonflage). Ces résultats sont en accord avec la littérature, qui montre l’établissement d’un pic hypertensif immédiatement après l’insufflation du cathéter, suivi d’une diminution des niveaux de pression, en réponse probable à l’augmentation transitoire des taux de catécholamines circulantes22.
Le maintien de l’animal dans la BD pendant des périodes prolongées peut entraîner une hypotension suivie d’une mort circulatoire, ce qui rend l’expérience irréalisable. En conséquence, la plupart des protocoles utilisés dans la littérature établissent une période de suivi qui varie de 4 à 6 heures, après quoi les médicaments vasoactifs doivent être administrés 12,13,21,22,23.
En plus des changements hémodynamiques, l’infarctus cérébral et l’ischémie favorisent une augmentation de la circulation systémique des facteurs pro-inflammatoires qui, lorsqu’ils atteignent les poumons, contribuent à la lésion du parenchyme pulmonaire 24,25,26.
Dans notre étude, la BD s’est accompagnée d’une augmentation significative de l’expression tissulaire de l’IL-1β (par rapport à la MC) et du rapport poids humide/sec, un indice d’œdème pulmonaire. Des études antérieures ont indiqué une augmentation des niveaux circulants de cytokines pro-inflammatoires après un événement BD, ce qui peut finalement favoriser la modulation de l’expression des molécules d’adhésion, l’augmentation de la perméabilité vasculaire et la migration des leucocytes qui en résulte 27,28,29,30.
Choc hémorragique (HS)
Établi par le retrait ou la réinjection d’aliquotes sanguines dans le but d’un maintien prolongé de l’hypotension (≤ 50 mmHg), le modèle de pression fixe de l’HS vise à imiter la diminution du volume sanguin causée par le processus hémorragique et, par conséquent, l’atténuation de la pression de remplissage systémique. Ces événements entraînent une diminution de la MAP, accompagnée d’une diminution de la pression de perfusion pulmonaire 31,32.
Parmi les avantages de ce modèle HS, il y a la possibilité de contrôler le degré et la durée de l’hypotension, en plus de la plus grande reproductibilité de la technique par rapport aux modèles basés sur un volume sanguin préfixé. En conséquence, la plupart des protocoles utilisés dans la littérature établissent une période de protocole qui varie de 15 min à plus de 180 min, avec des niveaux moyens de pression artérielle allant de 20 à 55 mmHg, selon l’analyse choisie dans l’étude 6,32. Dans la présente étude, l’hypotension a été maintenue pendant 3 heures, ce qui a entraîné une augmentation de la résistance des tissus, suivie d’une diminution de la compliance pulmonaire chez les animaux soumis à l’HS. Pour corroborer cette affirmation, différentes études dans la littérature ont indiqué une relation proportionnelle entre le temps passé en HS et les impacts de l’hypovolémie sur la résistance des voies respiratoires et la compliance pulmonaire 6,33,34.
De plus, dans la présente étude, l’HS s’est accompagnée d’une leucocytose significative et d’une augmentation de l’expression tissulaire de l’IL-1β (par rapport à la MC) et du TNF-α. La lésion de l’endothélium microvasculaire pulmonaire, induite par la libération d’espèces réactives de l’oxygène par le processus primaire d’hypoxie et d’ischémie établie, augmentera la perméabilité vasculaire, ce qui, avec l’augmentation de la pression artérielle pulmonaire, agira comme un facteur chimiotactique pour les leucocytes et la libération ultérieure de médiateurs inflammatoires 6,20,31,35,36, 37 et 38.
Mort circulatoire (MC)
La principale différence entre les greffons marginaux issus des processus BD et CD est le temps d’ischémie chaude (WIT) auquel le greffon sera soumis, défini par certains chercheurs comme le temps entre l’absence de pouls périphériques et l’interruption du flux sanguin due au retrait de l’équipement de maintien de la vie jusqu’à la perfusion froide ou régionale de l’organe17, 39,40.
Dans la présente étude, les organes et les tissus d’animaux dérivés du modèle CD ont été soumis à une période WIT de 180 min. Plusieurs études dans la littérature ont révélé une relation proportionnelle entre le WIT et le dysfonctionnement post-transplantation, suggérant que le temps d’ischémie devrait varier en fonction des particularités et de l’intégrité de chaque organe. Dans ce contexte, il a été démontré que les greffes de poumons de rats tolèrent jusqu’à 3 heures de périodes d’ischémie chaude41,42.
Avec des preuves de lésions tissulaires causées par la phase sympathique prédominante, d’instabilité hémodynamique et d’inflammation systémique résultant du processus de BD, les dons après arrêt circulatoire ont été reconsidérés comme une stratégie potentielle pour réduire les complications associées à la transplantation 41,42,43. En ce sens, nos données indiquent une diminution spectaculaire des niveaux d’IL-1β et de TNF-α dans le modèle CD par rapport aux deux autres modèles étudiés. Pour corroborer cette affirmation, Iskender et al.4 ont noté les faibles niveaux de cytokines tissulaires dans un modèle de reperfusion pulmonaire chez le rat avec des tissus donnés après le WIT par des mécanismes encore mal compris.
Sur la base de ce qui précède, le choix de la méthodologie et de ses adaptations devrait dépendre des objectifs développés par le chercheur. Une fois déterminés, ces objectifs devraient guider le type de modèle de don, la durée du protocole et les analyses à effectuer. Il est également possible de mettre en relation le type de don avec des modèles animaux de reconditionnement et de reperfusion pulmonaires.
Conclusions
En conclusion, les modèles de donneurs d’organes décrits ici sont des outils potentiels dans l’étude des changements associés aux différentes méthodologies de prélèvement de greffons et pourraient fournir des moyens permettant d’obtenir une compréhension complète de l’impact de la qualité de ces organes sur les résultats post-transplantation, compte tenu de la reproductibilité et de la fiabilité des méthodologies présentées ici.
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Disclosures
Nous tenons à confirmer qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts connus associés à cette publication et qu’il n’y a pas eu de soutien financier important pour ce travail qui aurait pu influencer son résultat.
Acknowledgments
Nous remercions la FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pour son soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
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