Summary
Bu çalışma, üç farklı akciğer bağışı modelinin (beyin ölümü sonrası bağış, dolaşım sonrası ölüm bağışı ve hemorajik şok sonrası bağış) kurulduğunu göstermektedir. Bu olaylarla ilişkili enflamatuar süreçleri ve patolojik bozuklukları karşılaştırır.
Abstract
Deneysel modeller, çeşitli patofizyolojik olaylarda yer alan etiyolojik fenomenleri anlamak için önemli araçlardır. Bu bağlamda, transplantasyon sonrası primer greft disfonksiyonunun patofizyolojisini tetikleyen unsurları incelemek ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için farklı hayvan modelleri kullanılmıştır. Şu anda, deneysel bağış modellerini iki büyük gruba ayırabiliriz: beyin ölümünden sonra bağış ve dolaşım durmasından sonra bağış. Ek olarak, organ bağışının hayvan modelleri göz önüne alındığında hemorajik şokla ilişkili zararlı etkiler de göz önünde bulundurulmalıdır. Burada, üç farklı akciğer bağışı modelinin (beyin ölümü sonrası bağış, dolaşım sonrası ölüm bağışı ve hemorajik şok sonrası bağış) oluşturulmasını anlatıyor ve bu olaylarla ilişkili inflamatuar süreçleri ve patolojik bozuklukları karşılaştırıyoruz. Amaç, bilimsel topluluğa, ilişkili patolojik mekanizmaları incelemek ve transplantasyon için uygun greft sayısını optimize etmek için yeni terapötik hedefler aramak için güvenilir hayvan akciğer bağışı modelleri sağlamaktır.
Introduction
Klinik uygunluk
Organ nakli, birçok ciddi patoloji için iyi bilinen bir terapötik seçenektir. Son yıllarda, organ transplantasyonunun klinik ve deneysel alanlarında, primer greft disfonksiyonunun (PGT) patofizyolojisi hakkında daha fazla bilgi sahibi olmak ve yoğun bakım, immünoloji ve farmakoloji alanlarındaki ilerlemeler gibi birçok ilerleme kaydedilmiştir 1,2,3. İlgili cerrahi ve farmakolojik prosedürlerin kalitesindeki başarılara ve gelişmelere rağmen, mevcut organ sayısı ile bekleme listesindeki alıcı sayısı arasındaki ilişki ana zorluklardan biri olmaya devam etmektedir 2,4. Bu bağlamda, bilimsel literatür, organ bağışçılarına organ nakli zamanına kadar organları tedavi etmek ve/veya korumak için uygulanabilecek tedavileri incelemek için hayvan modelleri önermiştir 5,6,7,8.
Klinik uygulamada gözlemlenen farklı olayları taklit ederek, hayvan modelleri, ilişkili patolojik mekanizmaların ve bunların ilgili terapötik yaklaşımlarının incelenmesine izin verir. Bu olayların deneysel indüksiyonu, çoğu izole vakada, organ nakli ile ilgili bilimsel literatürdegeniş çapta araştırılan deneysel organ ve doku bağışı modelleri oluşturmuştur 6,7,8,9. Bu çalışmalar, beyin ölümü (BH), hemorajik şok (HS) ve dolaşım ölümüne (CD) neden olanlar gibi farklı metodolojik stratejiler kullanır, çünkü bu olaylar bağışlanan organ ve dokuların işlevselliğini tehlikeye atan farklı zararlı süreçlerle ilişkilidir.
Beyin ölümü (BH)
BD, farklı sistemlerin ilerleyici bozulmasına yol açan bir dizi olayla ilişkilidir. Genellikle beyin travması veya kanama nedeniyle kafa içi basıncında (ICP) akut veya kademeli bir artış meydana geldiğinde ortaya çıkar. ICP'deki bu artış, Cushing refleksi10,11 olarak bilinen bir süreçte stabil bir serebral kan akışını sürdürmek amacıyla kan basıncında bir artışı teşvik eder. Bu akut değişiklikler, nakil sonrası morbidite ve mortaliteyi etkilemenin yanı sıra, bağışlanan organların miktarını ve kalitesini tehlikeye atan kardiyovasküler, endokrin ve nörolojik işlev bozukluklarına neden olabilir 10,11,12,13.
Hemorajik şok (HS)
HS, sırayla, çoğu organ bağışçıları ile ilişkilidir, çünkü bunların çoğu önemli kan hacmi kaybına neden olan travma kurbanlarıdır. Akciğerler ve kalp gibi bazı organlar, hipovolemi ve bunun sonucunda ortaya çıkan doku hipoperfüzyonu nedeniyle HS'ye karşı özellikle savunmasızdır14. HS, artan kılcal geçirgenlik, ödem ve enflamatuar hücrelerin infiltrasyonu yoluyla akciğer hasarına neden olur, birlikte gaz değişimini tehlikeye atan ve ilerleyici organ bozulmasına yol açan mekanizmalar, sonuç olarak bağış sürecini raydan çıkarır 6,14.
Dolaşım ölümü (CD)
CD sonrası bağışın kullanımı büyük dünya merkezlerinde katlanarak artmakta ve böylece toplanan organ sayısının artmasına katkıda bulunmaktadır. CD sonrası donörlerden elde edilen organlar, düşük (agonik faz) veya kan akışı (asistolik faz) aralığından sonra ortaya çıkan sıcak iskeminin etkilerine karşı savunmasızdır8,15. Hipoperfüzyon veya kan akışının olmaması, ani ATP kaybı ve dokularda metabolik toksinlerin birikmesi ile ilişkili doku hipoksisine yol açacaktır15. Klinik uygulamada transplantasyon için mevcut kullanımına rağmen, bu organların kullanımının transplantasyon sonrası greftin kalitesi ve hasta sağkalımı üzerindeki etkisi hakkında birçok şüphe devam etmektedir15. Bu nedenle, ÇH ile ilişkili etiyolojik faktörlerin daha iyi anlaşılması için deneysel modellerin kullanımı da artmaktadır 8,15,16,17.
Deneysel modeller
Çeşitli deneysel organ bağışı modelleri (BD, HS ve CD) vardır. Bununla birlikte, çalışmalar genellikle bir seferde yalnızca bir stratejiye odaklanır. İki veya daha fazla stratejiyi birleştiren veya karşılaştıran çalışmalarda gözle görülür bir boşluk vardır. Bu modeller, bağış sayısını artırmayı ve sonuç olarak potansiyel alıcıların bekleme listesini azaltmayı amaçlayan tedavilerin geliştirilmesinde çok faydalıdır. Bu amaçla kullanılan hayvan türleri, çalışmadan çalışmaya değişir, amaç insan morfo fizyolojisi ile daha doğrudan bir çeviri olduğunda ve hayvanın büyüklüğü nedeniyle cerrahi prosedürde daha az teknik zorluk olduğunda domuz modelleri daha yaygın olarak seçilir. Faydalarına rağmen, lojistik zorluklar ve yüksek maliyetler domuz modeliyle ilişkilidir. Öte yandan, düşük maliyet ve biyolojik manipülasyon olasılığı, kemirgen modellerinin kullanımını destekleyerek, araştırmacının lezyonları çoğaltmak ve tedavi etmek için güvenilir bir modelden başlamasına ve ayrıca organ nakli alanında edinilen bilgileri entegre etmesine olanak tanır.
Burada, beyin ölümü, dolaşım ölümü ve hemorajik şok bağışının kemirgen bir modelini sunuyoruz. Bu modellerin her biri ile ilişkili enflamatuar süreçleri ve patolojik durumları tanımladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulu'na (protokol numarası 112/16) uygundur.
1. Hayvan gruplaması
- Hayvan modelleriyle ilişkili etkileri analiz etmek ve karşılaştırmak için on iki erkek Sprague Dawley sıçanı (250-300 g) rastgele üç deney grubundan birine (n = 4) atayın.
- Hayvanları hemorajik şok grubuna atayın (HS, n=4): hemorajik şok indüksiyonu + 360 dakika bakım + kardiyopulmoner blok ekstraksiyonu + analiz için numune hazırlama ile vasküler kateterizasyona tabi tutulan hayvanlar.
- Hayvanları beyin ölümü grubuna atayın (BD, n=4): beyin ölümüne maruz kalan hayvanlar + 360 dakika bakım + kardiyopulmoner blok ekstraksiyonu + analiz için numune hazırlama.
- Hayvanları dolaşım ölüm grubuna atayın (CD, n=4): vasküler kateterizasyon + dolaşım ölümü indüksiyonu + ventilasyonun askıya alınması + 180 dakika oda sıcaklığında iskemi + analiz için numune hazırlamaya tabi tutulan hayvanlar.
2. Anestezi ve cerrahi öncesi hazırlık
- Sıçanı 1-4 dakika boyunca% 5 izofluran içeren kapalı bir odaya yerleştirin. Ayak parmağı sıkıştırma refleksini kontrol ederek uygun anesteziyi onaylayın. Refleks reaksiyonlarının yokluğunda (pençe retraksiyonu yok), pediatrik laringoskop yardımıyla orotrakeal entübasyon (14-G anjiyokat) yapın.
- Önceden ayarlanmış bir mekanik ventilatör ile (FiO2 %100, tidal hacim 10 mL/kg, 90 döngü/dak ve PEEP 3.0 cmH2O), trakeal kateteri ventilatöre bağlayın ve anestezik konsantrasyonu %2'ye ayarlayın.
NOT: Hayvan modelleriyle ilgili tüm prosedürler, bu bölümde açıklanan aynı anestezi protokolünü izlemiştir. - İlgilenilen bölgelerden (baş, boyun, göğüs ve karın) kürkü çıkarın. Daha sonra gazlı bez kullanarak cerrahi alanı ve hayvanın kuyruğunu dezenfekte edin. Dezenfeksiyon, üç alternatif tur alkollü bir klorheksidin diglukonat ovma çözeltisi ile gerçekleştirilir.
- Hayvanın kuyruğunun ucunu kesin, başparmağınızı ve işaret parmağınızı kuyruğun tabanına yerleştirin ve ardından bastırıp tabandan uzağa kaydırın. Toplam lökosit sayısı8 için kuyruktan periferik kan örneği (20 μL) alın.
NOT: Bu prosedür trakeostomi başlamadan önce ve her protokolün hemen sonunda yapılmalıdır (BD ve HS - 360 dakika sonra). - Toplanan kanı 380 μL (1:20) Turk çözeltisinde (Buzlu asetik asit %99) seyreltmek için hassas bir pipet kullanın. Seyreltildikten sonra, kan örneğini bir Neubauer odasına pipetleyin ve mikroskop altına (40x) yerleştirin. Toplam lökosit sayımını odanın dört yan çeyreğinde gerçekleştirin.
3. Trakeostomi
- Uygun makas ve forseps yardımıyla, boynun orta üçte birinden başlayarak suprasternal çentiğe (
1.5 cm insizyon) kadar servikal trakeanın uzunlamasına diseksiyonunu gerçekleştirin. Deri ve deri altı dokusunun kesilmesinden sonra, trakea açığa çıkana kadar servikal kasları inceleyin. - Soluk borusunun altına bir adet 2-0 ipek bağ yerleştirin.
- Mikromakas kullanarak, düzgün ventilasyon elde etmek için trakeanın üst üçte birini trakeostistize edin. Metal bir kanülün çapını (3,5 cm) karşılamak için trakeayı iki kıkırdaklı halka arasında yatay olarak kesin.
- Havalandırma tüpünü yerleştirin ve hazırlanan ligatürlerle sabitleyin.
- Havalandırma tüpünü küçük hayvan havalandırma sistemine bağlayın.
- Sıçanı 10 mL / kg tidal hacim, 70 döngü / dak hız ve 3 cmH2O PEEP ile havalandırın.
1.5 cm insizyon) kadar servikal trakeanın uzunlamasına diseksiyonunu gerçekleştirin. Deri ve deri altı dokusunun kesilmesinden sonra, trakea açığa çıkana kadar servikal kasları inceleyin.4. Femoral arter ve ven kateterizasyonu
- Femoral üçgeni kasık bölgesinde küçük bir kesiden (1,5 cm) ortaya çıkarın. Femoral damarları tanımlayın ve izole edin. Bu prosedür için bir stereomikroskop (3,2x büyütme) kullanın.
- Kan damarlarının (ven veya arter) altına, biri distal ve diğeri proksimal olmak üzere iki adet 4-0 ipek ligatür yerleştirin. En distal ligatürü kapatın, ardından proksimal ligatüre önceden ayarlanmış bir düğüm yerleştirin ve çekin.
- Kateteri damarlarda küçük, önceden oluşturulmuş bir kesiden yerleştirin. Çıkığı önlemek için kanülü sabitleyin.
NOT: Kateterleri, 20 cm'lik bir yenidoğan genişleticiden, hayvanın venöz ağının kalibresine uygun bir periferik intravenöz katetere ısıtılarak kaynak yapın, böylece kan içeriğinin yetersizliğini önleyin. Ortalama arter basıncı (MAP) ölçümü sırasında trombüs oluşumunu ve komplikasyonları önleyerek kanülü heparin ile yağlayın. - Ortalama arter basıncını (MAP) kaydetmek için arter kateterini bir basınç dönüştürücüsüne ve bir yaşamsal belirti izleme sistemine bağlayın. Dönüştürücü, hayvanın kalbi seviyesine yerleştirilmelidir. MAP'ı her 10 dakikalık periyotta kaydedin.
- Şırınga kateterini (3 mL) damar içine yerleştirin, gerektiğinde hidrasyon ve kan kaybını hedefleyin.
5. Hemorajik şok indüksiyonu
- Venöz erişim yoluyla ve heparinize bir şırınga ile, 50 mmHg'lik MAP değerlerine ulaşılana kadar küçük hacimlerde kanı çıkarın, böylece hemorajik şok oluşturun.
NOT: Deneyin ilk saatinde her 10 dakikada bir ve sonraki saatlerde her 30 dakikada bir 2 mL alikot kan toplayın. - Basıncı 360 dakikalık bir süre boyunca yaklaşık 50 mmHg'de sabit tutun. Bunu yapmak için, basınç sırasıyla artar veya azalırsa kan alikotlarını çıkarın veya ekleyin.
- Hipotermiyi önlemek için yakına bir ısı kaynağı koyun.
NOT: Burada bir ısı lambası kullanılır. - Protokolün sonunda, pulmoner bloğu toplam akciğer kapasitesinde (TLC) hasat edin ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun veya daha ileri çalışmalar için bir sabitleme solüsyonuna yerleştirin.
NOT: Küçük bir hayvan ventilatörü yardımıyla, protokol sırasında ventilasyon parametrelerine erişilebilir. Bu çalışmada, bu parametreler HS indüksiyonundan hemen önce (Başlangıç) ve 360 dakika sonra (Final) değerlendirildi.
6. Dolaşım ölümü indüksiyonu
- Dolaşım ölümünü indüklemek için, venöz hattan 150 mg / kg sodyum tiyopental uygulayın. Ardından havalandırma sistemini kapatın.
- 0 mmHg'ye ulaşana kadar MAP'deki aşamalı azalmaya dikkat edin. Bu noktadan itibaren, sıcak iskemi döneminin başlangıcını düşünün ve zaman sayımına başlayın. Hayvan oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) 180 dakika kalmalıdır.
- Protokolün sonunda, akciğerleri mekanik ventilatöre yeniden bağlayın ve toplama için TLC'de pulmoner bloğu toplayın. Sıvı nitrojen kullanarak hızlı dondurma yapın veya daha ileri çalışmalar için fiksasyon çözeltisine yerleştirin.
7. Beyin ölümü indüksiyonu
- Fareyi yüzüstü pozisyona getirin.
- Cerrahi makas kullanarak cildi kafatasından çıkarın. 1 mm kalibreli bir sondaj deliği 2.80 mm anterior ve 10.0 mm ventral bregma ve 1.5 mm lateral sagital sütür açın.
- Tüm balon kateterini kraniyal boşluğa yerleştirin ve balonun salinle (500 μL) önceden doldurulduğundan emin olun.
- Bir şırınga yardımıyla, kateteri hızla şişirin.
- Ani bir MAP yükselmesi (Cushing refleksi), reflekslerin yokluğu, bilateral midriyazis ve apne gözlemleyerek beyin ölümünü doğrulayın. Onaylandıktan sonra anesteziyi bırakın ve hayvanı 360 dakika mekanik ventilasyonda tutun.
- Hipotermiyi önlemek için yakına bir ısı kaynağı yerleştirin.
- Protokolün sonunda, toplama için TLC'de pulmoner bloğu hasat edin ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun veya daha ileri çalışmalar için bir sabitleme solüsyonuna yerleştirin.
NOT: Küçük bir hayvan ventilatörü yardımıyla, protokol sırasında ventilasyon parametrelerine erişilebilir. Bu çalışmada, bu parametreler BD indüksiyonundan hemen önce (Başlangıç) ve 360 dakika sonra (Final) değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortalama arter basıncı (MAP)
Behçet hastalığı ve HS'nin hemodinamik yansımalarını belirlemek için protokolün 360 dakikası boyunca MAP değerlendirildi. Başlangıç ölçümü, sırasıyla BD veya HS'ye maruz kalan hayvanlar için deri çıkarma ve kafatası sondajından sonra ve kan alikotu toplanmadan önce toplandı. Behçet hastalığı ve HS indüksiyonundan önce, iki grubun başlangıç haritası benzerdi (BD: 110.5 ± 6.1'e karşı HS: 105.8 ± 2.3 mmHg; p=0.5; iki yönlü ANOVA). Kateter insüflasyonundan sonra, Behçet hastalığı grubu kan basıncı seviyelerinde ani bir artış yaşadı (138.7 ± 10.1 mmHg). Hipertansif pik, artmış intrakraniyal basınçla ilgili tuhaf bir olaydır ve Behçet hastalığının oluşumunun ilk kanıtı olarak kabul edilebilir. Ayrıca tüm hayvanlarda refleks, bilateral midriyazis ve post-şişirme apnesinin olmadığını gözlemledik. Bu pik basıncı, MAP'de hızlı bir düşüş izledi (10 dakika - 81.2 ± 10 mmHg). Hipotansiyon yaklaşık 50 dakika devam etti, daha sonra MAP seviyeleri başlangıçtakilere yakın değerlere (120 dakika - 120.7 ± 7.5 mmHg) geri döndü (Şekil 1).
Behçet grubundan farklı olarak, HS grubundaki MAP'deki azalma, deneyin ilk 10 dakikasında kan alikotlarının çekilmesi ile ilişkilidir. Hipovolemik şok 360 dakika boyunca korundu (protokol boyunca ortalama varyasyon 52.3 ± 1.2 mmHg). Protokolün bitiminden sonra, Behçet grubu, HS grubundan 6 saatlik takipte önemli ölçüde farklı bir MAP paterni gösterdi (BD: 93.7 ± 4.5'e karşı HS: 52.3 ± 0.5 mmHg; p<0.0001; Öğrenci t testi).
Pulmoner mekanik
Solunum sisteminin elastik ve dirençli parametrelerini değerlendirmek için, BD ve HS'ye maruz kalan hayvanların akciğer mekaniğinin bir analizi yapıldı. Başlangıçtan 360 dakika sonra ve hipotansiyon idamesinden sonra, HS grubu artmış akciğer dokusu direnci (G) sergiledi (HS: Başlangıç - 0.26 ± 0.02 vs. Final - 0.51 ± 0.05 cmH2O.mL-1; p=0.03; Iki yönlü ANOVA), ardından azalmış solunum sistemi kompliyansı (Crs) izledi (HS: Başlangıç - 0.64 ± 0.05 vs. Final - 0.23 ± 0.004 cmH2O/mL; p=0.001; Iki yönlü ANOVA) (Şekil 2A,B).
Pulmoner ödem
Protokol sonunda tüm gruplardan sağ akciğer orta lobu toplandı ve pulmoner ödem indeksi olarak kullanılan ıslak/kuru ağırlık oranını analiz etmek için ağırlığı ölçüldü. Islak ağırlık, organın çıkarılmasından hemen sonra değerlendirildi ve kuru ağırlık, 80 ° C'lik bir fırında 24 saat sonra ölçüldü. Bu orana göre Behçet grubu (2,32 ± 0,1) HS (1,97 ± 0,03) ve CD gruplarına (2,04 ± 0,02) göre daha fazla ödem göstermiştir (Şekil 3).
Sistemik ve doku inflamatuar parametreleri
Protokolün sonunda, HS uygulanan gruptaki toplam sistemik lökosit sayısında önemli bir artış vardı (Başlangıç - 13888 ± 887.3 vs. Final - 35263 ± 4076 mm3; p = 0.0189); Iki yönlü ANOVA) (Şekil 4). HS grubu ayrıca hem başlangıç değerlerine kıyasla hem de Behçet grubuna göre lökosit sayısında bir artış gösterdi (p = 0.0132).
Doku iltihabı, akciğer dokusundaki inflamatuar belirteçlerin ölçülmesiyle değerlendirildi. Bu amaçla, akciğer dokusu biyopsi örnekleri fosfat tamponunda homojenize edildikten sonra tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve interlökin 1 beta (IL1-β) ekspresyonu için analize gönderildi. IL1-β ekspresyon düzeyleri Behçet grubunda (304.4 ± 91 pg/mg) ve HS grubunda (327.5 ± 25.2 pg/mg) CD grubuna göre (8 ± 2.3 pg/mg; p=0.004; Tek yönlü ANOVA) (Şekil 5B). HS grubu ayrıca daha yüksek TNF-α seviyeleri gösterdi (4.7 ± 0.3 pg / mg; p<0.0001; Tek yönlü ANOVA) BD grubundan (1.3 ± 0.3 pg / mg) ve CD grubundan (0.4 ± 0.2 pg / mg) daha fazladır (Şekil 5B).
Şekil 1: Beyin ölümü (BH) ve hemorajik şok (HS) gruplarında ortalama arter basıncının (MAP) zaman seyri. Tüm ölçümlerin değerleri, ortalamaların standart hataları (SEM'ler) ± ortalamaları olarak ifade edilir. MAP, ortalama arter basıncı; Behçet hastalığı, beyin ölümü; HS, hemorajik şok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akciğer mekaniği. Beyin ölümü (BH) grubunda ve hemorajik şok (HS) grubunda (A) solunum sistemi uyumu ve (B) doku direnci ile belirlenen akciğer mekaniği. * HS grubunda başlangıç ve nihai değerler arasında anlamlı farklılıklar olduğunu gösterir (p<0.05). Tüm ölçümler için değerler, ortalamaların standart hataları (SEM'ler) ± ortalamaları olarak ifade edildi ve karşılaştırmalar için iki yönlü ANOVA kullanıldı. Crs, solunum sisteminin uyumu; G, doku direnci; Behçet hastalığı, beyin ölümü; HS, hemorajik şok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyin ölümü (BH) grubunda ve hemorajik şok (HS) grubunda akciğer ıslak-kuru ağırlık oranına göre belirlenen akciğer ödemi. Tüm ölçümler için değerler, ortalamaların standart hataları (SEM'ler) ± ortalamalar olarak ifade edildi ve karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ile yapıldı. Behçet hastalığı, beyin ölümü; HS, hemorajik şok; CD, dolaşım ölümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hemorajik şok (HS) grubu ve beyin ölümü (BH) grubunun lökogramı. * HS grubunda başlangıç ve son değerler arasında anlamlı farklılıklar olduğunu gösterir (p<0.05). Tüm ölçümler için değerler, ortalamanın standart hataları (SEM'ler) ± ortalamaları olarak ifade edildi ve karşılaştırmalar iki yönlü ANOVA ile yapıldı. Behçet hastalığı, beyin ölümü; HS, hemorajik şok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Lokal inflamatuar yanıtlar dolaşım ölümü (CD) grubunda daha az belirgindi. (A) IL-1β'nın akciğer dokusu ekspresyonu; (B) TNF-α'in akciğer dokusu ekspresyonu. Tüm ölçümler için değerler, ortalamanın standart hataları (SEM'ler) ± ortalamalar olarak ifade edildi ve karşılaştırmalar tek yönlü varyans analizi ile yapıldı. Behçet hastalığı, beyin ölümü; HS, hemorajik şok; CD, dolaşım ölümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, beyin ölümü tanılarının sayısının artması, nakil amaçlı organ ve dokuların en büyük sağlayıcısı haline gelmesine neden olmuştur. Ancak bu büyümeye, dolaşım ölümünden sonra bağışlarda inanılmaz bir artış eşlik etti. Multifaktöriyel doğasına rağmen, ölüm nedenlerini tetikleyen mekanizmaların çoğu, yoğun kan içeriği kaybı ile travmadan sonra başlar veya travmaya eşlik eder 4,18.
Bu bağlamda, beyin ölümü, dolaşım durması ve hemorajik şokun deneysel modelleri, donör ölümünün nedeni ile ilişkili komplikasyonların ve bunların transplantasyona yönelik potansiyel organların canlılığı üzerindeki etkilerinin prospektif çalışması için önemli araçlardır 6,8,10. Model oluşturma için domuz, tavşan, sıçan ve fare gibi çeşitli hayvan soyları önerilmiştir. Sıçan ve fare modelleri, çok pahalı olmamaları ve incelenen patofizyolojik olayları tatmin edici bir şekilde yeniden üretirken düşük lojistik zorluk içermeleri nedeniyle literatürde daha yaygındır 8,13,14,15.
Son kılavuzların ve çalışmaların, perioperatif ağrı ve hayvan refahının daha kapsamlı yönetimini amaçlayan, akut durumlarda bile cerrahi protokollerin ayrılmaz bir parçası olarak preanestezik analjezinin kullanımını onayladığını vurgulamak isteriz. Araştırmacıların gelecekteki çalışmalarda böyle bir yaklaşımı değerlendirmelerini öneriyoruz.
Beyin ölümü (BH)
Behçet modeli, ICP'deki ani bir artışla tekrarlanabilir bulundu. Uygun aletlerin ve eğitimli personelin kullanılması, birkaç haftalık eğitimle cerrahi başarıya ve tekniğin çoğaltılmasına olanak sağlar. Behçet tekniğinin geliştirilmesi sırasında kateterde gevşeklik olmayacak şekilde uygun bir motorlu matkap ile trepanasyon yapılmalı, böylece beyin dokusunun delikten dışarı çıkması engellenmelidir. Ek olarak, delme sırasında, kafatasının sunduğu ilk direnç aşılır aşılmaz matkabın ileri hareketi durdurulmalıdır.
Araştırmacılar tetikte kalmalı ve kateterin hızlı bir şekilde şişmesini sağlamalıdır, çünkü kademeli şişirme farklı inflamatuar ve hemodinamik tepkileri teşvik eder21. Kan basıncı değişiklikleri, protokol boyunca, özellikle kateter insüflasyonu sırasında, MAP'de ani bir artışın eşlik etmesi gereken ve Behçet hastalığının kurulmasından sonraki ilk saat boyunca (enflasyon sonrası hipotansiyon dönemi) sürekli olarak izlenmelidir. Bu sonuçlar, kateter insüflasyonundan hemen sonra hipertansif bir pikin kurulduğunu ve ardından dolaşımdaki katekolamin seviyelerindeki geçici artışa olası bir yanıt olarak basınç seviyelerinde bir azalma olduğunu gösteren literatürle uyumludur22.
Hayvanı uzun süre Behçet hastalığında tutmak, hipotansiyona ve ardından dolaşım ölümüne yol açarak deneyi olanaksız hale getirebilir. Buna göre, literatürde kullanılan çoğu protokol 4 ila 6 saat arasında değişen bir takip süresi belirlemekte ve bu süreden sonra vazoaktif ilaçların verilmesi gerekmektedir 12,13,21,22,23.
Hemodinamik değişikliklere ek olarak, serebral enfarktüs ve iskemi, akciğerlere ulaştıklarında akciğer parankimi hasarına katkıda bulunan proinflamatuar faktörlerin sistemik dolaşımında bir artışı teşvik eder 24,25,26.
Çalışmamızda, Behçet hastalığına doku IL-1β ekspresyonunda (CD üzerinden) ve pulmoner ödem indeksi olan ıslak/kuru ağırlık oranında anlamlı bir artış eşlik etti. Önceki çalışmalar, bir Behçet hastalığından sonra dolaşımdaki proinflamatuar sitokin seviyelerinde bir artış olduğunu göstermiştir, bu da sonuçta adezyon moleküllerinin ekspresyonunun modülasyonunu, artmış vasküler geçirgenliği ve bunun sonucunda lökosit göçünü destekleyebilir 27,28,29,30.
Hemorajik şok (HS)
Uzun süreli hipotansiyon bakımı (≤ 50 mmHg) amacıyla kan alikotlarının geri çekilmesi veya yeniden infüzyonu yoluyla kurulan HS'nin sabit basınç modeli, hemorajik sürecin neden olduğu kan hacmindeki azalmayı ve sonuç olarak sistemik dolum basıncının zayıflamasını taklit etmeyi amaçlar. Bu olaylar, pulmoner perfüzyon basıncında bir azalmaya eşlik eden MAP'de bir azalmaya yol açar31,32.
Bu HS modelinin avantajları arasında, önceden sabitlenmiş bir kan hacmine dayalı modellere kıyasla tekniğin daha fazla tekrarlanabilirliğine ek olarak, hipotansiyonun derecesini ve süresini kontrol etme olasılığı vardır. Buna göre, literatürde kullanılan çoğu protokol, çalışmada seçilen analize bağlı olarak ortalama kan basıncı seviyeleri 20-55 mmHg arasında değişen, 15 dakika ile 180 dakika arasında değişen bir protokol süresi belirlemektedir 6,32. Bu çalışmada, HS'ye maruz kalan hayvanlarda hipotansiyon 3 saat boyunca korunmuş, doku direncinin artmasına ve ardından akciğer kompliyansının azalmasına neden olmuştur. Bunu doğrulayan literatürdeki farklı çalışmalar, HS'de geçirilen süre ile hipovoleminin hava yolu direnci ve akciğer kompliyansı üzerindeki etkileri arasında orantılı bir ilişki olduğunu göstermiştir 6,33,34.
Ek olarak, bu çalışmada HS'ye belirgin lökositoz ve IL-1β (CD'ye göre) ve TNF-α'nin artmış doku ekspresyonu eşlik etti. Birincil hipoksi ve yerleşik iskemi sürecinden reaktif oksijen türlerinin salınmasıyla indüklenen pulmoner mikrovasküler endotel yaralanması, pulmoner arter basıncındaki artışla birlikte lökositler için kemotaktik bir faktör olarak hareket edecek vasküler geçirgenliği artıracak ve daha sonra inflamatuar mediatörlerin salınması 6,20,31,35,36, 37,38.
Dolaşım ölümü (CD)
Behçet ve ÇH işlemlerinden kaynaklanan marjinal greftler arasındaki temel fark, bazı araştırmacılar tarafından periferik nabızların yokluğu ile yaşam destek ekipmanının çıkarılması nedeniyle kan akışının kesilmesi arasında geçen süre olarak tanımlanan, greftin maruz kalacağı sıcak iskemi zamanıdır (WIT) organın soğuk veya bölgesel perfüzyonunakadar geçen süre 17, 39,40.
Bu çalışmada, CD modelinden elde edilen hayvanların organ ve dokuları 180 dakikalık bir WIT periyoduna tabi tutulmuştur. Literatürdeki birçok çalışma, WIT ile transplantasyon sonrası disfonksiyon arasında orantılı bir ilişki olduğunu ortaya koymuştur, bu da iskemi süresinin her organın özelliklerine ve bütünlüğüne göre değişmesi gerektiğini düşündürmektedir. Bu bağlamda, sıçanlardan alınan akciğer greftlerinin 3 saate kadar sıcak iskemiyi tolere ettiği gösterilmiştir41,42.
Baskın sempatik fazın neden olduğu doku hasarı, hemodinamik instabilite ve Behçet hastalığından kaynaklanan sistemik inflamasyon kanıtları ile, dolaşım durması sonrası bağışlar, transplantasyonla ilişkili komplikasyonları azaltmak için potansiyel bir strateji olarak yeniden gözden geçirilmiştir 41,42,43. Bu anlamda, verilerimiz, incelenen diğer iki modele göre CD modelinde IL-1β ve TNF-α seviyelerinde dramatik bir düşüşe işaret etmektedir. Bunu doğrulayan Iskender ve ark.4, WIT'den sonra hala tam olarak anlaşılamayan mekanizmalar yoluyla bağışlanan dokulara sahip sıçanlarda bir akciğer reperfüzyonu modelinde düşük doku sitokin seviyelerine dikkat çekti.
Yukarıdakilere dayanarak, metodoloji seçimi ve uyarlamaları araştırmacı tarafından geliştirilen hedeflere bağlı olmalıdır. Bu hedefler belirlendikten sonra bağış modelinin türünü, protokol süresini ve yapılacak analizleri yönlendirmelidir. Bağış türünü, akciğer yenileme ve reperfüzyonun hayvan modelleriyle ilişkilendirmek de mümkündür.
Sonuç
Sonuç olarak, burada açıklanan organ bağışı modelleri, farklı greft toplama metodolojileri ile ilişkili değişikliklerin incelenmesinde potansiyel araçlardır ve burada sunulan metodolojilerin tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği göz önüne alındığında, bu organların kalitesinin nakil sonrası sonuçlar üzerindeki etkisinin tam olarak anlaşılmasını sağlayacak araçlar sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu yayınla ilişkili bilinen herhangi bir çıkar çatışması olmadığını ve bu çalışma için sonucunu etkileyebilecek önemli bir mali destek olmadığını teyit etmek istiyoruz.
Acknowledgments
FAPESP'e (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) finansal destek sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
