Summary
Den aktuella studien visar etableringen av tre olika modeller för lungdonation (donation efter hjärndöd, donation efter cirkulationsdöd och donation efter hemorragisk chock). Den jämför de inflammatoriska processer och patologiska störningar som är förknippade med dessa händelser.
Abstract
Experimentella modeller är viktiga verktyg för att förstå de etiologiska fenomen som är involverade i olika patofysiologiska händelser. I detta sammanhang används olika djurmodeller för att studera de faktorer som utlöser patofysiologin vid primär transplantatdysfunktion efter transplantation för att utvärdera potentiella behandlingar. För närvarande kan vi dela in experimentella donationsmodeller i två stora grupper: donation efter hjärndöd och donation efter cirkulationsstopp. Dessutom bör de skadliga effekter som är förknippade med hemorragisk chock beaktas när man överväger djurmodeller för organdonation. Här beskriver vi etableringen av tre olika lungdonationsmodeller (donation efter hjärndöd, donation efter cirkulationsdöd och donation efter hemorragisk chock) och jämför de inflammatoriska processer och patologiska störningar som är förknippade med dessa händelser. Målet är att förse det vetenskapliga samfundet med tillförlitliga djurmodeller för lungdonation för att studera de associerade patologiska mekanismerna och söka efter nya terapeutiska mål för att optimera antalet livskraftiga transplantat för transplantation.
Introduction
Klinisk relevans
Organtransplantation är ett väletablerat behandlingsalternativ för flera allvarliga patologier. Under de senaste åren har många framsteg gjorts inom de kliniska och experimentella områdena organtransplantation, såsom ökad kunskap om patofysiologin vid primär transplantatdysfunktion (PGD) och framsteg inom områdena intensivvård, immunologi och farmakologi 1,2,3. Trots de framsteg som gjorts och förbättringarna av kvaliteten på de kirurgiska och farmakologiska ingreppen är förhållandet mellan antalet tillgängliga organ och antalet mottagare på väntelistan fortfarande en av de största utmaningarna 2,4. I detta avseende har den vetenskapliga litteraturen föreslagit djurmodeller för att studera terapier som kan tillämpas på organdonatorer för att behandla och/eller bevara organen fram till tidpunkten för transplantation 5,6,7,8.
Genom att efterlikna de olika händelser som observerats i klinisk praxis gör djurmodeller det möjligt att studera de associerade patologiska mekanismerna och deras respektive terapeutiska metoder. Den experimentella induktionen av dessa händelser har, i de flesta isolerade fall, genererat experimentella modeller för organ- och vävnadsdonation som är allmänt undersökta i den vetenskapliga litteraturen om organtransplantation 6,7,8,9. Dessa studier använder olika metodologiska strategier, såsom de som inducerar hjärndöd (BD), hemorragisk chock (HS) och cirkulationsdöd (CD), eftersom dessa händelser är förknippade med olika skadliga processer som äventyrar funktionaliteten hos de donerade organen och vävnaderna.
Hjärndöd (BD)
BD är förknippat med en serie händelser som leder till en gradvis försämring av olika system. Det inträffar vanligtvis när en akut eller gradvis ökning av intrakraniellt tryck (ICP) inträffar på grund av hjärntrauma eller blödning. Denna ökning av ICP främjar en ökning av blodtrycket i ett försök att upprätthålla ett stabilt cerebralt blodflöde i en process som kallas Cushings reflex10,11. Dessa akuta förändringar kan leda till kardiovaskulära, endokrina och neurologiska dysfunktioner som äventyrar kvantiteten och kvaliteten på de donerade organen, förutom att de påverkar morbiditeten och mortaliteten efter transplantation 10,11,12,13.
Hemorragisk chock (HS)
HS förknippas i sin tur ofta med organdonatorer, eftersom de flesta av dem är offer för trauma med betydande förlust av blodvolym. Vissa organ, såsom lungor och hjärta, är särskilt sårbara för HS på grund av hypovolemi och därav följande vävnadshypoperfusion14. HS inducerar lungskada genom ökad kapillärpermeabilitet, ödem och infiltration av inflammatoriska celler, mekanismer som tillsammans äventyrar gasutbytet och leder till progressiv organförsämring, vilket följaktligen får donationsprocessen att spåra ur 6,14.
Cirkulationsdöd (CD)
Användningen av post-CD-donation har ökat exponentiellt i stora världscentra, vilket har bidragit till ökningen av antalet insamlade organ. Organ som tillvaratagits från post-CD-donatorer är sårbara för effekterna av varm ischemi, som inträffar efter ett intervall med låg (agonisk fas) eller ingen blodtillförsel (asystolisk fas)8,15. Hypoperfusion eller frånvaro av blodflöde kommer att leda till vävnadshypoxi i samband med plötslig förlust av ATP och ackumulering av metaboliska toxiner i vävnader15. Trots att dessa organ för närvarande används för transplantation i klinisk praxis kvarstår många tvivel om hur användningen av dessa organ påverkar kvaliteten på transplantatet efter transplantationen och patienternas överlevnad15. Således ökar också användningen av experimentella modeller för en bättre förståelse av de etiologiska faktorer som är associerade med CD 8,15,16,17.
Experimentella modeller
Det finns olika experimentella modeller för organdonation (BD, HS och CD). Studier fokuserar dock ofta på endast en strategi i taget. Det finns en märkbar lucka i studier som kombinerar eller jämför två eller flera strategier. Dessa modeller är mycket användbara vid utveckling av behandlingar som syftar till att öka antalet donationer och därmed minska väntelistan för potentiella mottagare. De djurarter som används för detta ändamål varierar från studie till studie, där svinmodeller oftare väljs när målet är en mer direkt översättning med mänsklig morfofysiologi och mindre tekniska svårigheter vid det kirurgiska ingreppet på grund av djurets storlek. Trots fördelarna är det förknippat med svinmodellen logistiska svårigheter och höga kostnader. Å andra sidan gynnar den låga kostnaden och möjligheten till biologisk manipulation användningen av gnagarmodeller, vilket gör det möjligt för forskaren att utgå från en tillförlitlig modell för att reproducera och behandla lesioner, samt att integrera den kunskap som förvärvats inom området organtransplantation.
Här presenterar vi en gnagarmodell för hjärndöd, cirkulationsdöd och hemorragisk chockdonation. Vi beskriver inflammatoriska processer och patologiska tillstånd som är förknippade med var och en av dessa modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken uppfyllde kraven i den etiska kommittén för användning och skötsel av försöksdjur vid medicinska fakulteten vid universitetet i São Paulo (protokollnummer 112/16).
1. Gruppering av djur
- Tilldela slumpmässigt tolv hanråttor av Sprague Dawley (250-300 g) till en av tre experimentgrupper (n=4) för att analysera och jämföra effekterna i samband med djurmodellerna.
- Klassificera djuren i hemorragisk chockgrupp (HS, n=4): djur som utsätts för vaskulär kateterisering med hemorragisk chockinduktion + underhåll i 360 minuter + kardiopulmonell blockadextraktion + provberedning för analys.
- Tilldela djur till hjärndödsgrupp (BD, n=4): djur som utsätts för hjärndöd + underhåll i 360 minuter + hjärt-lungblockadextraktion + provberedning för analys.
- Klassificera djuren i gruppen cirkulatorisk död (CD, n=4): djur som utsätts för vaskulär kateterisering + induktion av cirkulationsdöd + andningsuppehåll + ischemi vid rumstemperatur i 180 minuter + provberedning för analys.
2. Anestesi och prekirurgisk förberedelse
- Placera råttan i en sluten kammare med 5% isofluran i 1 - 4 min. Bekräfta korrekt bedövning genom att kontrollera tånypreflexen. I frånvaro av reflexreaktioner (ingen indragning av tassen), utför orotrakeal intubation (14-G angiocath) med hjälp av ett pediatriskt laryngoskop.
- Med en tidigare justerad mekanisk ventilator (FiO2 100 %, tidalvolym 10 ml/kg, 90 cykler/min och PEEP 3,0 cmH2O), anslut trakealkatetern till ventilatorn och justera anestesikoncentrationen till 2 %.
OBS: Alla procedurer relaterade till djurmodeller följde samma anestesiprotokoll som beskrivs i detta avsnitt. - Ta bort päls från de intressanta områdena (huvud, nacke, bröst och buk). Desinficera sedan det kirurgiska området och djurets svans med gasbinda. Desinfektion utförs med tre omväxlande omgångar av en alkohollösning av klorhexidindiglukonatskrubb.
- Klipp av spetsen på djurets svans, placera tummen och pekfingret över svansroten och tryck sedan på och skjut bort dem från basen. Ta ett perifert blodprov (20 μL) genom svansen för det totala leukocytantalet8.
OBS: Denna procedur måste utföras innan trakeostomin påbörjas och omedelbart i slutet av varje protokoll (BD och HS - efter 360 min). - Använd en precisionspipett för att späda det uppsamlade blodet i 380 μL (1:20) Turks lösning (isättika 99 %). När blodprovet är utspätt pipetterar du det i en Neubauer-kammare och placerar det i ett mikroskop (40 gånger). Utför det totala leukocytantalet i de fyra laterala kvadranterna i kammaren.
3. Trakeostomi
- Med hjälp av lämplig sax och pincett, utför längsgående dissektion av livmoderhalsen luftstrupen, från den mellersta tredjedelen av halsen till den suprasternala skåran (
1,5 cm snitt). Efter snittet av huden och subkutan vävnad, dissekera livmoderhalsmusklerna tills luftstrupen är exponerad. - Placera en 2-0 silkesligatur under luftstrupen.
- Använd en mikrosax och trakeostomera den övre tredjedelen av luftstrupen för att uppnå jämn ventilation. Skär luftstrupen horisontellt mellan två broskringar för att rymma diametern på en metallkanyl (3,5 cm).
- Sätt i ventilationsröret och fixera det med förberedda ligaturer.
- Anslut ventilationsslangen till ventilationssystemet för smådjur.
- Ventilera råttan med en tidalvolym på 10 ml/kg, en hastighet på 70 cykler/min och en PEEP på 3 cmH2O.
1,5 cm snitt). Efter snittet av huden och subkutan vävnad, dissekera livmoderhalsmusklerna tills luftstrupen är exponerad.4. Lårbensartär- och venkateterisering
- Exponera lårbenstriangeln genom ett litet snitt (1,5 cm) i ljumskregionen. Identifiera och isolera lårbenskärlen. Använd ett stereomikroskop (3,2x förstoring för denna procedur).
- Placera två 4-0 silkesligaturer under blodkärlen (ven eller artär), en distalt och den andra proximalt. Stäng den mest distala ligaturen, placera sedan en förjusterad knut i den proximala ligaturen och dra.
- För in katetern genom ett litet, förformat snitt i kärlen. Fixera kanylen för att undvika luxation.
OBS: Gör katetrarna från en 20 cm neonatal extender svetsad genom upphettning till en perifer intravenös kateter som är lämplig för kalibern på djurets venösa nätverk, och på så sätt förhindra uppstötningar av blodinnehåll. Smörj kanylen med heparin och undvik trombi och komplikationer vid mätning av medelartärtryck (MAP). - Anslut artärkatetern till en tryckgivare och ett system för övervakning av vitala tecken för att registrera det genomsnittliga artärtrycket (MAP). Givaren ska placeras i höjd med djurets hjärta. Spela in MAP var 10:e minut.
- Placera sprutkatetern (3 ml) i venen, sträva efter hydrering och blodförbränning vid behov.
5. Induktion av hemorragisk chock
- Genom venös åtkomst och med en hepariniserad spruta avlägsnas små volymer blod tills MAP-värden på 50 mmHg uppnås, vilket etablerar hemorragisk chock.
OBS: Samla upp en 2 ml alikvot blod var 10:e minut under den första timmen av experimentet och var 30:e minut under de följande timmarna. - Håll trycket stabilt på cirka 50 mmHg under en period av 360 minuter. För att göra det, ta bort eller tillsätt alikvoter av blod om trycket ökar respektive minskar.
- Placera en värmekälla i närheten för att undvika hypotermi.
OBS: Här används en värmelampa. - I slutet av protokollet, skörda lungblockaden vid total lungkapacitet (TLC) och antingen snabbfrysa i flytande kväve eller placera den i en fixeringslösning för vidare studier.
OBS: Med hjälp av en ventilator för smådjur kan ventilationsparametrarna nås under protokollet. I den aktuella studien utvärderades dessa parametrar omedelbart före HS-induktion (Baseline) och 360 minuter senare (Final).
6. Induktion av cirkulationsdöd
- För att inducera cirkulatorisk död, administrera 150 mg/kg natriumtiopental genom venkatet. Stäng sedan av ventilationssystemet.
- Notera den progressiva minskningen av MAP tills den når 0 mmHg. Från denna punkt, överväg början av den varma ischemi perioden och börja tidsräkningen. Djuret ska förvaras i rumstemperatur (cirka 22 °C) i 180 minuter.
- I slutet av protokollet, återanslut lungorna till den mekaniska ventilatorn och skörda lungblockaden vid TLC för uppsamling. Antingen snabbfryser du med flytande kväve eller lägger det i fixeringslösningen för vidare studier.
7. Induktion av hjärndöd
- Placera råttan i bukläge.
- Ta bort huden från skallen med en kirurgisk sax. Borra ett borrhål med 1 mm kaliber 2,80 mm främre och 10,0 mm ventralt till bregma och 1,5 mm lateralt om sagittalsuturen.
- För in hela ballongkatetern i hjärnskålen och se till att ballongen är förfylld med koksaltlösning (500 μL).
- Blås snabbt upp katetern med hjälp av en spruta.
- Bekräfta hjärndöd genom att observera en plötslig MAP-höjning (Cushings reflex), frånvaro av reflexer, bilateral mydriasis och apné. Efter bekräftelse, avbryt bedövningen och håll djuret i mekanisk ventilation i 360 minuter.
- Placera en värmekälla i närheten för att undvika hypotermi.
- I slutet av protokollet, skörda lungblockaden vid TLC för uppsamling och antingen snabbfrysa i flytande kväve eller placera den i en fixeringslösning för vidare studier.
OBS: Med hjälp av en ventilator för smådjur kan ventilationsparametrarna nås under protokollet. I den aktuella studien utvärderade vi dessa parametrar omedelbart före BD-induktion (Baseline) och efter 360 minuter (Final).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomsnittligt artärtryck (MAP)
För att bestämma de hemodynamiska konsekvenserna av BD och HS utvärderades MAP under de 360 minuter som protokollet pågick. Baslinjemätningen samlades in efter avlägsnande av hud och borrning av skallen och före insamling av alikvot av blod för djur som utsatts för BD respektive HS. Före BD- och HS-induktion var baslinje-MAP för de två grupperna liknande (BD: 110,5 ± 6,1 jämfört med HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; tvåvägs ANOVA). Efter kateterinsufflation upplevde BD-gruppen en plötslig ökning av blodtrycksnivåerna (138,7 ± 10,1 mmHg). Den hypertensiva toppen är en märklig händelse relaterad till ökat intrakraniellt tryck och kan betraktas som det första beviset på etablering av BS. Dessutom observerade vi frånvaron av reflexer, bilateral mydriasis och apné efter inflation hos alla djur. Detta topptryck följdes av en snabb minskning av MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). Hypotonin kvarstod i cirka 50 minuter, varefter MAP-nivåerna återgick till värden nära de vid baslinjen (120 minuter - 120,7 ± 7,5 mmHg) (figur 1).
Till skillnad från i BD-gruppen är minskningen av MAP i HS-gruppen förknippad med utsättning av alikvoter i blodet under de första 10 minuterna av experimentet. Hypovolemisk chock bibehölls i 360 minuter (genomsnittlig variation i hela protokollet 52,3 ± 1,2 mmHg). Efter protokollets slut visade BD-gruppen ett signifikant annorlunda MAP-mönster under 6-timmarsuppföljningen jämfört med HS-gruppen (BD: 93,7 ± 4,5 jämfört med HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; s<0,0001; Elevens t-test).
Lungmekanik
För att utvärdera andningsorganens elastiska och resistiva parametrar utfördes en analys av lungmekaniken hos de djur som utsattes för BD och HS. 360 minuter efter debut och efter underhåll av hypotoni uppvisade HS-gruppen ökad lungvävnadsresistens (G) (HS: Baslinje - 0,26 ± 0,02 vs. Final - 0,51 ± 0,05 cmH2O.ml-1; p=0,03; dubbelriktad ANOVA), följt av minskad följsamhet till andningsorganen (CRS) (HS: Baslinje - 0,64 ± 0,05 jämfört med Final - 0,23 ± 0,004 cmH2O/ml; p=0,001; dubbelriktad ANOVA) (figur 2A,B).
Lungödem
I slutet av protokollet samlades den mellersta loben i höger lunga in för alla grupper, och dess vikt mättes för att analysera förhållandet mellan våt och torr vikt, vilket användes som lungödemindex. Våtvikten bedömdes omedelbart efter extraktion av orgeln och torrvikten mättes efter 24 timmar i en 80 °C ugn. Enligt detta förhållande uppvisade BD-gruppen (2,32 ± 0,1) större ödem än HS-gruppen (1,97 ± 0,03) och CD-gruppen (2,04 ± 0,02) (figur 3).
Systemiska och vävnadsinflammatoriska parametrar
I slutet av protokollet sågs en signifikant ökning av det totala antalet systemiska leukocyter i gruppen som genomgick HS (baslinje - 13888 ± 887,3 jämfört med Final - 35263 ± 4076 mm3; p=0,0189); dubbelriktad ANOVA) (figur 4). HS-gruppen visade också en ökning av antalet leukocyter både jämfört med utgångsvärdena och i förhållande till BD-gruppen (p = 0,0132).
Vävnadsinflammation bedömdes genom att kvantifiera inflammatoriska markörer i lungvävnaden. För detta ändamål homogeniserades lungvävnadsbiopsiprover i fosfatbuffert och skickades sedan för analys med avseende på tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α) och interleukin 1 beta (IL1-β) uttryck. IL1-β-uttrycksnivåerna var högre i BD-gruppen (304,4 ± 91 pg/mg) och HS-gruppen (327,5 ± 25,2 pg/mg) än i CD-gruppen (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; enkelriktad ANOVA) (figur 5B). HS-gruppen uppvisade också högre nivåer av TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p<0,0001; enkelriktad ANOVA) än BD-gruppen (1,3 ± 0,3 pg/mg) och CD-gruppen (0,4 ± 0,2 pg/mg) (figur 5B).
Figur 1: Tidsförlopp för medelartärtryck (MAP) i grupperna hjärndöd (BD) och hemorragisk chock (HS). Värdena för alla mätningar uttrycks som medelvärden ± medelvärdenas standardfel (SEM). MAP, medelartärtryck; BD, hjärndöd; HS, hemorragisk chock. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Lungmekanik. Lungmekanik bestämd av (A) följsamhet till andningsorganen och (B) vävnadsresistens i hjärndödsgruppen (BD) och hemorragisk chockgrupp (HS). * indikerar signifikanta skillnader mellan baslinje- och slutvärdena i HS-gruppen (p<0,05). Värdena för alla mätningar uttrycks som medelvärden ± medelvärdenas standardfel (SEM), och tvåvägs ANOVA användes för jämförelser. CRS, överensstämmelse med andningsorganen; G, vävnadsresistens; BD, hjärndöd; HS, hemorragisk chock. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Lungödem bestäms av förhållandet mellan våt och torr vikt i lungorna i hjärndödsgruppen (BD) och gruppen med hemorragisk chock (HS). Värdena för alla mätningar uttrycks som medelvärden ± medelvärdenas standardfel (SEM), och jämförelser gjordes med envägs ANOVA. BD, hjärndöd; HS, hemorragisk chock; CD, cirkulationsdöd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Leukogram av hemorragisk chock (HS) och hjärndöd (BD). * indikerar signifikanta skillnader mellan baslinje- och slutvärden i HS-gruppen (p<0,05). Värdena för samtliga mätningar uttrycks som medelvärdet ± medelvärdet av medelvärdet (SEM) och jämförelser har gjorts med tvåvägs ANOVA. BD, hjärndöd; HS, hemorragisk chock. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Lokala inflammatoriska svar var mindre framträdande i gruppen med cirkulatorisk död (CD). (A) Lungvävnadsuttryck av IL-1β; (B) Lungvävnadsuttryck av TNF-α. Värdena för samtliga mätningar uttrycks som medelvärden ± medelvärden (SEM) och jämförelser har gjorts med envägs ANOVA. BD, hjärndöd; HS, hemorragisk chock; CD, cirkulationsdöd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har det ökande antalet diagnoser av hjärndöd lett till att man blivit den största leverantören av organ och vävnader avsedda för transplantation. Denna tillväxt har dock åtföljts av en otrolig ökning av donationer efter cirkulationsdöd. Trots sin multifaktoriella natur börjar de flesta av de utlösande mekanismerna för dödsorsaker efter eller åtföljer trauma med omfattande förlust av blodinnehåll 4,18.
I detta sammanhang är experimentella modeller av hjärndöd, cirkulationsstillestånd och hemorragisk chock viktiga verktyg för prospektiva studier av komplikationer i samband med orsaken till donatordöd och deras inverkan på livsdugligheten hos potentiella organ avsedda för transplantation 6,8,10. Flera djurlinjer har föreslagits för modelletablering, såsom svin, kanin, råtta och mus. Rått- och musmodeller är vanligare i litteraturen eftersom de inte är särskilt dyra och innebär låga logistiska svårigheter samtidigt som de på ett tillfredsställande sätt reproducerar de patofysiologiska händelser som studeras 8,13,14,15.
Vi vill betona att nya riktlinjer och studier har godkänt användningen av pre-anestesismärtlindring som en integrerad del av kirurgiska protokoll, även i akuta situationer, i syfte att uppnå en mer omfattande hantering av perioperativ smärta och djurens välbefinnande. Vi rekommenderar att forskare utvärderar ett sådant tillvägagångssätt i framtida studier.
Hjärndöd (BD)
BD-modellen visade sig vara reproducerbar genom en plötslig ökning av ICP. Användningen av lämpliga instrument och utbildad personal möjliggör kirurgisk framgång och reproduktion av tekniken med några veckors träning. Under utvecklingen av BD-tekniken bör trepanation utföras med en lämplig motoriserad borr så att det inte finns något slack i katetern, vilket förhindrar att hjärnvävnad projiceras ut ur hålet. Dessutom, under borrning, bör borrens framåtrörelse stoppas så snart det initiala motståndet som erbjuds av skallen har övervunnits.
Forskare bör vara uppmärksamma och se till att katetern blåses upp snabbt, eftersom gradvis uppblåsning främjar distinkta inflammatoriska och hemodynamiska reaktioner. Blodtrycksförändringar bör i sin tur övervakas kontinuerligt under hela protokollet, särskilt under kateterinsufflation, vilket bör åtföljas av en plötslig ökning av MAP och under den första timmen efter BD-etablering (hypotoniperiod efter inflation). Dessa resultat överensstämmer med litteraturen, som visar att en hypertensiv topp etablerades omedelbart efter kateterinsufflation, följt av en minskning av trycknivåerna, som ett troligt svar på den övergående ökningen av cirkulerande katekolaminnivåer22.
Att hålla djuret i BS under längre perioder kan leda till hypotoni följt av cirkulationsdöd, vilket gör försöket ogenomförbart. Följaktligen fastställer de flesta protokoll som används i litteraturen en uppföljningsperiod som varierar från 4 till 6 timmar, varefter vasoaktiva läkemedel måste administreras 12,13,21,22,23.
Förutom hemodynamiska förändringar främjar hjärninfarkt och ischemi en ökning av den systemiska cirkulationen av proinflammatoriska faktorer, som, när de når lungorna, bidrar till lungparenkymskada 24,25,26.
I vår studie åtföljdes BD av en signifikant ökning av vävnadens IL-1β-uttryck (över CD) och våt/torrviktsförhållandet, ett index för lungödem. Tidigare studier har indikerat en ökning av cirkulerande nivåer av proinflammatoriska cytokiner efter en BD-händelse, vilket i slutändan kan gynna moduleringen av uttrycket av adhesionsmolekyler, ökad vaskulär permeabilitet och därmed leukocytmigration 27,28,29,30.
Hemorragisk chock (HS)
Den fasta tryckmodellen för HS etablerades genom tillbakadragning eller reinfusion av alikvoter i blodet med målet att förlänga hypotoniunderhållet (≤ 50 mmHg) och syftar till att efterlikna minskningen av blodvolymen som orsakas av den hemorragiska processen och följaktligen dämpningen av det systemiska fyllnadstrycket. Dessa händelser leder till en minskning av MAP, åtföljd av en minskning av lungperfusionstrycket31,32.
Bland fördelarna med denna HS-modell är möjligheten att kontrollera graden och varaktigheten av hypotoni, förutom teknikens större reproducerbarhet jämfört med modeller baserade på en förhöjd blodvolym. Följaktligen fastställer de flesta protokoll som används i litteraturen en protokollperiod som varierar från 15 minuter till mer än 180 minuter, med genomsnittliga blodtrycksnivåer som sträcker sig från 20-55 mmHg, beroende på vilken analys som valts i studien 6,32. I den aktuella studien bibehölls hypotoni i 3 timmar, vilket ledde till ökad vävnadsresistens, följt av minskad lungföljsamhet hos djur som utsattes för HS. Som stöd för detta har olika studier i litteraturen indikerat ett proportionellt samband mellan den tid som tillbringas i HS och effekterna av hypovolemi på luftvägsmotstånd och lungföljsamhet 6,33,34.
Dessutom, i den aktuella studien, åtföljdes HS av signifikant leukocytos och ökat vävnadsuttryck av IL-1β (med avseende på CD) och TNF-α. Skada på endotelet i lungmikrovaskulaturen, inducerad av frisättning av reaktiva syrearter från den primära processen hypoxi och etablerad ischemi, kommer att öka vaskulär permeabilitet, vilket tillsammans med ökningen av lungartärtrycket kommer att fungera som en kemotaktisk faktor för leukocyter och den efterföljande frisättningen av inflammatoriska mediatorer 6,20,31,35,36, 37,38.
Cirkulationsdöd (CD)
Den största skillnaden mellan de marginella transplantaten som härrör från BD- och CD-processerna är den varma ischemi (WIT) som transplantatet kommer att utsättas för, definierat av vissa forskare som tiden mellan frånvaron av perifera pulser och avbrott i blodflödet på grund av avlägsnande av livsuppehållande utrustning tills kall eller regional perfusion av organet17, 39,40.
I den aktuella studien utsattes organ och vävnader från djur som härrörde från CD-modellen för en WIT-period på 180 minuter. Flera studier i litteraturen har avslöjat ett proportionellt förhållande mellan WIT och dysfunktion efter transplantation, vilket tyder på att ischemitiden bör variera beroende på varje organs särdrag och integritet. I detta sammanhang har lungtransplantat från råttor visat sig tolerera upp till 3-timmarsperioder av varm ischemi41,42.
Med bevis på vävnadsskada orsakad av den dominerande sympatiska fasen, hemodynamisk instabilitet och systemisk inflammation till följd av BD-processen, har donationer efter cirkulationsstillestånd omprövats som en potentiell strategi för att minska komplikationer i samband med transplantation 41,42,43. I detta avseende indikerar våra data en dramatisk minskning av IL-1β- och TNF-α-nivåerna i CD-modellen jämfört med de andra två studerade modellerna. Som bekräftelse på detta noterade Iskender et al.4 de låga nivåerna av vävnadscytokiner i en modell av lungreperfusion hos råttor med vävnader donerade efter WIT genom mekanismer som fortfarande är dåligt förstådda.
Mot bakgrund av ovanstående bör valet av metod och dess anpassningar vara beroende av de mål som forskaren tar fram. När dessa mål väl har fastställts bör de vara vägledande för vilken typ av donationsmodell det rör sig om, hur lång tid det ska tas fram och vilka analyser som ska utföras. Det är också möjligt att relatera typen av donation till djurmodeller av lungrekonditionering och reperfusion.
Slutsatser
Sammanfattningsvis är de organdonatormodeller som beskrivs här potentiella verktyg i studiet av de förändringar som är förknippade med olika metoder för transplantationsskörd och kan ge en fullständig förståelse för hur kvaliteten på dessa organ påverkar resultaten efter transplantation, med tanke på reproducerbarheten och tillförlitligheten hos de metoder som presenteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi vill bekräfta att det inte finns några kända intressekonflikter förknippade med denna publikation och att det inte har funnits något betydande ekonomiskt stöd för detta arbete som skulle ha kunnat påverka dess resultat.
Acknowledgments
Vi tackar FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) för att ha beviljat ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
