Summary
Die vorliegende Studie zeigt die Etablierung von drei verschiedenen Lungenspendemodellen (Post-Hirntod-Spende, Post-Kreislauftod-Spende und Post-Hämorrhagische Schockspende). Sie vergleicht die mit diesen Ereignissen verbundenen entzündlichen Prozesse und pathologischen Störungen.
Abstract
Experimentelle Modelle sind wichtige Werkzeuge, um die ätiologischen Phänomene zu verstehen, die an verschiedenen pathophysiologischen Ereignissen beteiligt sind. In diesem Zusammenhang werden verschiedene Tiermodelle verwendet, um die Elemente zu untersuchen, die die Pathophysiologie der primären Transplantatdysfunktion nach Transplantation auslösen, um mögliche Behandlungen zu bewerten. Derzeit können wir experimentelle Spendemodelle in zwei große Gruppen einteilen: Spende nach Hirntod und Spende nach Kreislaufstillstand. Darüber hinaus sollten die schädlichen Auswirkungen eines hämorrhagischen Schocks berücksichtigt werden, wenn Tiermodelle für Organspenden in Betracht gezogen werden. Hier beschreiben wir die Etablierung von drei verschiedenen Lungenspendemodellen (Post-Hirntod-Spende, Post-Kreislauf-Todesspende und Post-Hämorrhagische Schockspende) und vergleichen die mit diesen Ereignissen verbundenen entzündlichen Prozesse und pathologischen Störungen. Ziel ist es, der wissenschaftlichen Gemeinschaft zuverlässige Tiermodelle der Lungenspende zur Verfügung zu stellen, um die damit verbundenen pathologischen Mechanismen zu untersuchen und nach neuen therapeutischen Zielen zu suchen, um die Anzahl der lebensfähigen Transplantate für die Transplantation zu optimieren.
Introduction
Klinische Relevanz
Die Organtransplantation ist eine etablierte therapeutische Option für verschiedene schwere Erkrankungen. In den letzten Jahren wurden viele Fortschritte auf dem klinischen und experimentellen Gebiet der Organtransplantation erzielt, wie z. B. ein besseres Wissen über die Pathophysiologie der primären Transplantatdysfunktion (PID) und Fortschritte in den Bereichen Intensivmedizin, Immunologie und Pharmakologie 1,2,3. Trotz der Errungenschaften und Verbesserungen bei der Qualität der damit verbundenen chirurgischen und pharmakologischen Verfahren bleibt das Verhältnis zwischen der Anzahl der verfügbaren Organe und der Anzahl der Empfänger auf der Warteliste eine der größten Herausforderungen 2,4. In diesem Zusammenhang wurden in der wissenschaftlichen Literatur Tiermodelle für die Untersuchung von Therapien vorgeschlagen, die bei Organspendern angewendet werden können, um die Organe bis zum Zeitpunkt der Transplantation zu behandeln und/oder zu erhalten 5,6,7,8.
Durch die Nachahmung der verschiedenen in der klinischen Praxis beobachteten Ereignisse ermöglichen Tiermodelle die Untersuchung der damit verbundenen pathologischen Mechanismen und ihrer jeweiligen therapeutischen Ansätze. Die experimentelle Induktion dieser Ereignisse hat in den meisten Einzelfällen experimentelle Modelle der Organ- und Gewebespende hervorgebracht, die in der wissenschaftlichen Literatur zur Organtransplantation umfassend untersucht werden 6,7,8,9. Diese Studien verwenden unterschiedliche methodische Strategien, wie z. B. die Induktion des Hirntods (BD), des hämorrhagischen Schocks (HS) und des Kreislauftodes (CD), da diese Ereignisse mit verschiedenen schädlichen Prozessen verbunden sind, die die Funktionalität der gespendeten Organe und Gewebe beeinträchtigen.
Hirntod (BD)
BD ist mit einer Reihe von Ereignissen verbunden, die zu einer fortschreitenden Verschlechterung verschiedener Systeme führen. Sie tritt in der Regel auf, wenn ein akuter oder allmählicher Anstieg des Hirndrucks (ICP) aufgrund eines Hirntraumas oder einer Blutung auftritt. Dieser Anstieg des ICP fördert einen Anstieg des Blutdrucks, um einen stabilen zerebralen Blutfluss aufrechtzuerhalten, ein Prozess, der als Cushing-Reflex bekannt ist10,11. Diese akuten Veränderungen können zu kardiovaskulären, endokrinen und neurologischen Funktionsstörungen führen, die die Quantität und Qualität der gespendeten Organe beeinträchtigen und sich auf die Morbidität und Mortalität nach der Transplantation auswirken 10,11,12,13.
Hämorrhagischer Schock (HS)
HS wiederum wird oft mit Organspendern in Verbindung gebracht, da die meisten von ihnen Opfer eines Traumas mit erheblichem Verlust des Blutvolumens sind. Einige Organe, wie die Lunge und das Herz, sind aufgrund von Hypovolämie und daraus resultierender Gewebehypoperfusion besonders anfällig für HS14. HS induziert Lungenschäden durch erhöhte Kapillarpermeabilität, Ödeme und Infiltration von Entzündungszellen, Mechanismen, die zusammen den Gasaustausch beeinträchtigen und zu einer fortschreitenden Verschlechterung der Organe führen, wodurch der Spendeprozess entgleist 6,14.
Kreislauftod (CD)
Die Verwendung von Post-CD-Spenden hat in den großen Zentren der Welt exponentiell zugenommen und trägt so zur Zunahme der Anzahl der gesammelten Organe bei. Organe, die von Post-CD-Spendern gewonnen wurden, sind anfällig für die Auswirkungen einer warmen Ischämie, die nach einem Intervall niedriger (agonische Phase) oder keiner Blutversorgung (asystostolische Phase) auftritt8,15. Eine Hypoperfusion oder das Fehlen eines Blutflusses führt zu einer Gewebehypoxie, die mit dem abrupten Verlust von ATP und der Ansammlung von Stoffwechseltoxinen im Gewebe einhergeht15. Trotz der derzeitigen Verwendung für die Transplantation in der klinischen Praxis bestehen nach wie vor viele Zweifel an den Auswirkungen der Verwendung dieser Organe auf die Qualität des Transplantats nach der Transplantation und auf das Überleben der Patienten15. Sonimmt auch die Verwendung von experimentellen Modellen für ein besseres Verständnis der ätiologischen Faktoren, die mit Zöliakie assoziiert sind, zu 8,15,16,17 zu.
Experimentelle Modelle
Es gibt verschiedene experimentelle Organspendemodelle (BD, HS und CD). Studien konzentrieren sich jedoch oft nur auf jeweils eine Strategie. Es gibt eine auffällige Lücke bei Studien, die zwei oder mehr Strategien kombinieren oder vergleichen. Diese Modelle sind sehr nützlich bei der Entwicklung von Therapien, die darauf abzielen, die Anzahl der Spenden zu erhöhen und damit die Warteliste potenzieller Empfänger zu verkürzen. Die Tierarten, die für diesen Zweck verwendet werden, variieren von Studie zu Studie, wobei Schweinemodelle häufiger ausgewählt werden, wenn das Ziel eine direktere Translation mit der menschlichen Morphophysiologie und weniger technische Schwierigkeiten beim chirurgischen Eingriff aufgrund der Größe des Tieres ist. Trotz der Vorteile sind mit dem Schweinemodell logistische Schwierigkeiten und hohe Kosten verbunden. Auf der anderen Seite begünstigen die niedrigen Kosten und die Möglichkeit der biologischen Manipulation die Verwendung von Nagetiermodellen, die es dem Forscher ermöglichen, von einem zuverlässigen Modell auszugehen, um Läsionen zu reproduzieren und zu behandeln sowie das im Bereich der Organtransplantation erworbene Wissen zu integrieren.
Hier stellen wir ein Nagetiermodell für Hirntod, Kreislauftod und hämorrhagische Schockspende vor. Wir beschreiben Entzündungsprozesse und pathologische Zustände, die mit jedem dieser Modelle verbunden sind.
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Protocol
Die Tierversuche entsprachen der Ethikkommission für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren der Medizinischen Fakultät der Universität von São Paulo (Protokollnummer 112/16).
1. Gruppierung von Tieren
- Zwölf männliche Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g) wurden nach dem Zufallsprinzip einer von drei Versuchsgruppen (n=4) zugeteilt, um die mit den Tiermodellen verbundenen Effekte zu analysieren und zu vergleichen.
- Zuordnung der Tiere zur hämorrhagischen Schockgruppe (HS, n=4): Tiere, die einer Gefäßkatheterisierung mit hämorrhagischer Schockinduktion + Aufrechterhaltung für 360 min + Herz-Lungen-Blockextraktion + Probenvorbereitung für die Analyse unterzogen wurden.
- Zuordnung der Tiere zur Hirntodgruppe (BD, n=4): Tiere, die dem Hirntod ausgesetzt sind + Wartung für 360 min + Herz-Lungen-Blockextraktion + Probenvorbereitung für die Analyse.
- Zuordnung der Tiere zur Kreislauftodgruppe (CD, n=4): Tiere, die einer Gefäßkatheterisierung unterzogen wurden + Induktion des Kreislauftodes + Unterbrechung der Beatmung + Ischämie bei Raumtemperatur für 180 min + Probenvorbereitung für die Analyse.
2. Anästhesie und präoperative Vorbereitung
- Legen Sie die Ratte für 1 - 4 min in eine geschlossene Kammer mit 5% Isofluran. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Zehenkneifreflex überprüfen. Wenn keine Reflexreaktionen auftreten (kein Pfotenretraktion), ist eine orotracheale Intubation (14-G-Angiocath) mit Hilfe eines pädiatrischen Laryngoskops durchzuführen.
- Schließen Sie den Trachealkatheter mit einem zuvor eingestellten mechanischen Beatmungsgerät (FiO2 100 %, Tidalvolumen 10 ml/kg, 90 Zyklen/min und PEEP 3,0 cmH2O) an das Beatmungsgerät an und stellen Sie die Anästhesiekonzentration auf 2 % ein.
HINWEIS: Alle Verfahren, die sich auf Tiermodelle beziehen, folgten dem gleichen Anästhesieprotokoll, das in diesem Abschnitt beschrieben wird. - Entfernen Sie das Fell aus den interessierenden Regionen (Kopf, Hals, Brust und Bauch). Desinfizieren Sie dann mit Gaze das Operationsfeld und den Schwanz des Tieres. Die Desinfektion erfolgt mit drei abwechselnden Runden einer alkoholischen Lösung des Chlorhexidin-Digluconat-Peelings.
- Schneiden Sie die Schwanzspitze des Tieres ab, legen Sie den Daumen und den Zeigefinger über den Schwanzansatz und drücken Sie sie dann von der Basis weg und schieben Sie sie weg. Entnehmen Sie eine periphere Blutprobe (20 μl) durch den Schwanz für die Gesamtleukozytenzahl8.
HINWEIS: Dieses Verfahren muss vor Beginn der Tracheostomie und unmittelbar am Ende jedes Protokolls (BD und HS - nach 360 min) durchgeführt werden. - Verwenden Sie eine Präzisionspipette, um das gesammelte Blut in 380 μl (1:20) Turk-Lösung (Eisessig 99%) zu verdünnen. Nach der Verdünnung wird die Blutprobe in eine Neubauer-Kammer pipettiert und unter ein Mikroskop gelegt (40x). Führen Sie die Gesamtleukozytenzahl in den vier seitlichen Quadranten der Kammer durch.
3. Tracheostomie
- Führen Sie mit Hilfe einer geeigneten Schere und Pinzette eine Längsdissektion der zervikalen Luftröhre durch, beginnend mit dem mittleren Drittel des Halses bis zur suprasternalen Kerbe (
1,5 cm Schnitt). Nach dem Schnitt der Haut und des Unterhautgewebes wird die Halsmuskulatur präpariert, bis die Luftröhre freiliegt. - Platzieren Sie eine 2-0-Seidenligatur unter der Luftröhre.
- Mit einer Mikroschere wird das obere Drittel der Luftröhre tracheotomiert, um eine gleichmäßige Belüftung zu erreichen. Schneiden Sie die Luftröhre horizontal zwischen zwei Knorpelringen, um den Durchmesser einer Metallkanüle (3,5 cm) aufzunehmen.
- Führen Sie den Belüftungsschlauch ein und fixieren Sie ihn mit vorbereiteten Ligaturen.
- Schließen Sie den Beatmungsschlauch an das Belüftungssystem für Kleintiere an.
- Die Ratte wird mit einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg, einer Rate von 70 Zyklen/min und einem PEEP von 3 cmH2O beatmet.
1,5 cm Schnitt). Nach dem Schnitt der Haut und des Unterhautgewebes wird die Halsmuskulatur präpariert, bis die Luftröhre freiliegt.4. Katheterisierung der Oberschenkelarterie und -vene
- Legen Sie das Oberschenkeldreieck durch einen kleinen Schnitt (1,5 cm) in der Leistenregion frei. Identifizieren und isolieren Sie die Oberschenkelgefäße. Verwenden Sie für diesen Eingriff ein Stereomikroskop (3,2-fache Vergrößerung).
- Platzieren Sie zwei 4-0-Seidenligaturen unter den Blutgefäßen (Vene oder Arterie), eine distal und die andere proximal. Schließen Sie die am weitesten entfernte Ligatur, setzen Sie dann einen voreingestellten Knoten in die proximale Ligatur und ziehen Sie daran.
- Führen Sie den Katheter durch einen kleinen, vorgeformten Schnitt in die Gefäße ein. Fixieren Sie die Kanüle, um eine Verrenkung zu vermeiden.
HINWEIS: Stellen Sie die Katheter aus einem 20 cm langen Neugeborenen-Extender, der durch Erhitzen mit einem peripheren intravenösen Katheter verschweißt wird, her, der für das Kaliber des venösen Netzwerks des Tieres geeignet ist, um so das Aufstoßen des Blutinhalts zu verhindern. Schmieren Sie die Kanüle mit Heparin, um die Bildung von Thromben und Komplikationen bei der Messung des mittleren arteriellen Drucks (MAP) zu vermeiden. - Schließen Sie den Arterienkatheter an einen Druckwandler und ein Vitalparameterüberwachungssystem an, um den mittleren arteriellen Druck (MAP) aufzuzeichnen. Der Schallkopf sollte auf Höhe des Herzens des Tieres positioniert werden. Zeichnen Sie den MAP alle 10 Minuten auf.
- Führen Sie den Spritzenkatheter (3 ml) in die Vene ein und zielen Sie bei Bedarf auf Flüssigkeitszufuhr und Blutausblutung ab.
5. Induktion des hämorrhagischen Schocks
- Durch venösen Zugang und mit einer heparinisierten Spritze werden kleine Blutmengen entnommen, bis MAP-Werte von 50 mmHg erreicht sind, wodurch ein hämorrhagischer Schock hergestellt wird.
HINWEIS: Entnehmen Sie in der ersten Stunde des Experiments alle 10 Minuten und in den folgenden Stunden alle 30 Minuten ein 2-ml-Aliquot Blut. - Halten Sie den Druck 360 Minuten lang stabil bei ca. 50 mmHg. Um dies zu tun, entfernen oder fügen Sie Aliquots des Blutes hinzu, wenn der Druck steigt bzw. sinkt.
- Stellen Sie eine Wärmequelle in die Nähe, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
HINWEIS: Hier wird eine Wärmelampe verwendet. - Am Ende des Protokolls wird der Lungenblock bei der Gesamtlungenkapazität (DC) entnommen und entweder in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für weitere Untersuchungen in eine Fixierlösung gelegt.
HINWEIS: Mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgeräts können die Beatmungsparameter während des Protokolls abgerufen werden. In der vorliegenden Studie wurden diese Parameter unmittelbar vor der HS-Induktion (Baseline) und 360 min später (Final) evaluiert.
6. Induktion des Kreislauftodes
- Um den Kreislauftod herbeizuführen, verabreichen Sie 150 mg/kg Natriumthiopental durch den venösen Zugang. Schalten Sie dann die Lüftungsanlage aus.
- Man beachte die fortschreitende Abnahme des MAP-Wertes, bis er 0 mmHg erreicht. Betrachten Sie von diesem Punkt aus den Beginn der warmen Ischämieperiode und beginnen Sie mit der Zeitzählung. Das Tier sollte 180 Minuten lang bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) bleiben.
- Am Ende des Protokolls schließen Sie die Lunge wieder an das mechanische Beatmungsgerät an und entnehmen Sie den Lungenblock bei TLC zur Entnahme. Entweder mit flüssigem Stickstoff schockgefrieren oder für weitere Studien in die Fixierungslösung geben.
7. Induktion des Hirntods
- Setze die Ratte in die Bauchlage.
- Entfernen Sie die Haut vom Schädel mit einer chirurgischen Schere. Bohren Sie ein Bohrloch im Kaliber 1 mm, 2,80 mm anterior und 10,0 mm ventral zum Bregma und 1,5 mm lateral zur sagittalen Naht.
- Führen Sie den gesamten Ballonkatheter in die Schädelhöhle ein und stellen Sie sicher, dass der Ballon mit Kochsalzlösung (500 μl) vorgefüllt ist.
- Mit Hilfe einer Spritze wird der Katheter schnell aufgeblasen.
- Bestätigen Sie den Hirntod, indem Sie eine abrupte MAP-Erhöhung (Cushing-Reflex), das Fehlen von Reflexen, bilaterale Mydriasis und Apnoe beobachten. Nach der Bestätigung ist die Narkose abzubrechen und das Tier 360 Minuten lang mechanisch zu beatmen.
- Stellen Sie eine Wärmequelle in die Nähe, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
- Am Ende des Protokolls wird der Lungenblock bei TLC zur Entnahme entnommen und entweder in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder für weitere Untersuchungen in eine Fixierlösung gelegt.
HINWEIS: Mit Hilfe eines Kleintierbeatmungsgeräts können die Beatmungsparameter während des Protokolls abgerufen werden. In der vorliegenden Studie haben wir diese Parameter unmittelbar vor der BD-Induktion (Baseline) und nach 360 Minuten (Final) evaluiert.
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Representative Results
Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP)
Um die hämodynamischen Auswirkungen von BD und HS zu bestimmen, wurde MAP über die 360 Minuten des Protokolls ausgewertet. Die Baseline-Messung wurde nach Hautentfernung und Schädelbohrung sowie vor der Blutaliquotentnahme bei Tieren erhoben, die einer BD bzw. HS unterzogen wurden. Vor der BD- und HS-Induktion war die Baseline-MAP der beiden Gruppen ähnlich (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; Zwei-Wege-ANOVA). Nach Katheterinsufflation kam es in der BD-Gruppe zu einem abrupten Anstieg des Blutdrucks (138,7 ± 10,1 mmHg). Der hypertensive Peak ist ein besonderes Ereignis, das mit einem erhöhten Hirndruck zusammenhängt und als erster Nachweis für die Etablierung von BD angesehen werden kann. Darüber hinaus beobachteten wir bei allen Tieren das Fehlen von Reflexen, bilateraler Mydriasis und Postinflationsapnoe. Auf diesen Spitzendruck folgte ein rascher Abfall des MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). Die Hypotonie hielt etwa 50 Minuten an, danach kehrten die MAP-Spiegel auf Werte zurück, die denen des Ausgangswerts (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) nahe kamen (Abbildung 1).
Anders als in der BD-Gruppe ist die Abnahme des MAP in der HS-Gruppe mit der Entnahme von Blutaliquoten in den ersten 10 Minuten des Experiments verbunden. Der hypovolämische Schock wurde 360 min lang aufrechterhalten (mittlere Variation während des gesamten Protokolls 52,3 ± 1,2 mmHg). Nach dem Ende des Protokolls zeigte die BD-Gruppe ein signifikant anderes MAP-Muster als die HS-Gruppe (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; p<0,0001; Student's t Test).
Lungenmechanik
Um die elastischen und resistiven Parameter des Atmungssystems zu bewerten, wurde eine Analyse der Lungenmechanik der Tiere durchgeführt, die BD und HS ausgesetzt waren. 360 Minuten nach Beginn und nach Aufrechterhaltung der Hypotonie zeigte die HS-Gruppe einen erhöhten Lungengewebewiderstand (G) (HS: Ausgangswert - 0,26 ± 0,02 vs. Finale - 0,51 ± 0,05 cmH2O.mL-1; p=0,03; wechselseitig ANOVA), gefolgt von einer reduzierten Compliance des Atmungssystems (Crs) (HS: Ausgangswert - 0,64 ± 0,05 vs. Finale - 0,23 ± 0,004 cmH2O/ml; p=0,001; wechselseitig ANOVA) (Abbildung 2A,B).
Lungenödem
Am Ende des Protokolls wurde der Mittellappen der rechten Lunge für alle Gruppen entnommen und sein Gewicht gemessen, um das Verhältnis von Nass- und Trockengewicht zu analysieren, das als Lungenödemindex verwendet wurde. Das Nassgewicht wurde unmittelbar nach der Entnahme des Organs bestimmt, das Trockengewicht wurde nach 24 h in einem 80 °C warmen Ofen gemessen. Nach diesem Verhältnis wies die BD-Gruppe (2,32 ± 0,1) größere Ödeme auf als die HS- (1,97 ± 0,03) und CD-Gruppen (2,04 ± 0,02) (Abbildung 3).
Systemische und Gewebe-Entzündungsparameter
Am Ende des Protokolls gab es einen signifikanten Anstieg der Gesamtzahl der systemischen Leukozyten in der Gruppe, die sich einer HS unterzogen hatte (Baseline - 13888 ± 887,3 vs. Final - 35263 ± 4076 mm3; p=0,0189); wechselseitig ANOVA) (Abbildung 4). Die HS-Gruppe zeigte auch einen Anstieg der Leukozytenzahl sowohl im Vergleich zu den Ausgangswerten als auch in Bezug auf die BD-Gruppe (p = 0,0132).
Die Gewebeentzündung wurde durch die Quantifizierung von Entzündungsmarkern im Lungengewebe beurteilt. Zu diesem Zweck wurden Lungengewebebiopsieproben in Phosphatpuffer homogenisiert und anschließend zur Analyse auf Expression des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α) und des Interleukin-1-beta-Faktors (IL1-β) geschickt. Die IL1-β-Expressionsniveaus waren in der BD-Gruppe (304,4 ± 91 pg/mg) und der HS-Gruppe (327,5 ± 25,2 pg/mg) höher als in der CD-Gruppe (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; Einweg ANOVA) (Abbildung 5B). Die HS-Gruppe zeigte auch höhere Konzentrationen von TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p<0,0001; Einweg ANOVA) als die BD-Gruppe (1,3 ± 0,3 pg/mg) und die CD-Gruppe (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Abbildung 5B).
Abbildung 1: Zeitlicher Verlauf des mittleren arteriellen Drucks (MAP) in den Gruppen Hirntod (BD) und hämorrhagischer Schock (HS). Die Werte für alle Messungen werden als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEMs) ausgedrückt. MAP, mittlerer arterieller Druck; BD, Hirntod; HS, hämorrhagischer Schock. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Lungenmechanik. Lungenmechanik, bestimmt durch (A) Compliance des Atmungssystems und (B) Geweberesistenz in der Hirntodgruppe (BD) und der Gruppe mit hämorrhagischem Schock (HS). * zeigt signifikante Unterschiede zwischen dem Ausgangswert und dem Endwert in der HS-Gruppe an (p<0,05). Die Werte für alle Messungen werden als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEMs) ausgedrückt, und für Vergleiche wurde eine Zwei-Wege-ANOVA verwendet. Crs, Compliance des Atmungssystems; G, Gewebewiderstand; BD, Hirntod; HS, hämorrhagischer Schock. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lungenödeme, bestimmt durch das Verhältnis von Lungenfeuchte zu Trockengewicht in der Hirntodgruppe (BD) und der Gruppe mit hämorrhagischem Schock (HS). Die Werte für alle Messungen werden als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEMs) ausgedrückt, und es wurden Vergleiche mit der unidirektionalen ANOVA durchgeführt. BD, Hirntod; HS, hämorrhagischer Schock; Zöliakie, Kreislauftod. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Leukogramm der Gruppe mit hämorrhagischem Schock (HS) und Hirntod (BD). * zeigt signifikante Unterschiede zwischen Ausgangs- und Endwerten in der HS-Gruppe (p<0,05). Die Werte für alle Messungen werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEMs) ausgedrückt, und es wurden Vergleiche mit der Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt. BD, Hirntod; HS, hämorrhagischer Schock. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Lokale Entzündungsreaktionen waren in der Gruppe mit Kreislauftod (CD) weniger ausgeprägt. (A) Expression von IL-1β im Lungengewebe; (B) Expression von TNF-α im Lungengewebe. Die Werte für alle Messungen werden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEMs) ausgedrückt, und es wurden Vergleiche mit der unidirektionalen ANOVA durchgeführt. BD, Hirntod; HS, hämorrhagischer Schock; Zöliakie, Kreislauftod. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In den letzten Jahren hat die steigende Zahl von Hirntoddiagnosen dazu geführt, dass es zum größten Anbieter von Organen und Geweben für Transplantationen geworden ist. Dieses Wachstum ging jedoch mit einem unglaublichen Anstieg der Spenden nach dem Kreislauftod einher. Trotz seiner multifaktoriellen Natur beginnen die meisten Auslösemechanismen der Todesursachen nach einem Trauma oder begleiten es mit einem ausgedehnten Verlust des Blutgehalts 4,18.
In diesem Zusammenhang sind experimentelle Modelle des Hirntods, des Kreislaufstillstands und des hämorrhagischen Schocks wichtige Werkzeuge für die prospektive Untersuchung von Komplikationen im Zusammenhang mit der Todesursache des Spenders und deren Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit potenzieller Organe, die für eine Transplantation bestimmt sind 6,8,10. Für die Etablierung von Modellen wurden mehrere Tierlinien vorgeschlagen, wie z. B. Schweine, Kaninchen, Ratten und Mäuse. Ratten- und Mausmodelle sind in der Literatur häufiger anzutreffen, da sie nicht sehr teuer sind und nur geringe logistische Schwierigkeiten mit sich bringen, während sie die pathophysiologischen Ereignisse in der Studie zufriedenstellend reproduzieren 8,13,14,15.
Wir möchten betonen, dass die jüngsten Leitlinien und Studien die Verwendung der präanästhetischen Analgesie als integralen Bestandteil der chirurgischen Protokolle auch in akuten Situationen befürwortet haben, um eine umfassendere Behandlung der perioperativen Schmerzen und des Wohlbefindens der Tiere zu erreichen. Wir empfehlen den Forschern, einen solchen Ansatz in zukünftigen Studien zu evaluieren.
Hirntod (BD)
Das BD-Modell erwies sich durch einen abrupten Anstieg des ICP als reproduzierbar. Der Einsatz geeigneter Instrumente und geschultes Personal ermöglicht den Operationserfolg und die Reproduktion der Technik mit wenigen Wochen Einarbeitung. Während der Entwicklung der BD-Technik sollte die Trepanation mit einem geeigneten motorisierten Bohrer durchgeführt werden, damit der Katheter nicht locker bleibt und somit das Herausragen von Hirngewebe aus dem Loch verhindert wird. Darüber hinaus sollte während des Bohrens die Vorwärtsbewegung des Bohrers gestoppt werden, sobald der anfängliche Widerstand, den der Schädel bietet, überwunden ist.
Forscher sollten wachsam bleiben und ein schnelles Aufblasen des Katheters sicherstellen, da ein allmähliches Aufblasen unterschiedliche entzündliche und hämodynamische Reaktionen fördert21. Blutdruckänderungen wiederum sollten während des gesamten Protokolls ständig überwacht werden, insbesondere während der Katheterinsufflation, die mit einem abrupten Anstieg des MAPs einhergehen sollte, und in der ersten Stunde nach der Etablierung der BD (Hypotonieperiode nach der Inflation). Diese Ergebnisse stimmen mit der Literatur überein, die die Etablierung eines hypertensiven Peaks unmittelbar nach der Katheterinsufflation, gefolgt von einer Abnahme des Druckniveaus, als wahrscheinliche Reaktion auf den vorübergehenden Anstieg der zirkulierenden Katecholaminspiegelzeigt 22.
Wenn das Tier über einen längeren Zeitraum in der BD gehalten wird, kann dies zu einer Hypotonie mit anschließendem Kreislauftod führen, wodurch das Experiment nicht durchführbar ist. Dementsprechend legen die meisten in der Literatur verwendeten Protokolle eine Nachbeobachtungszeit fest, die zwischen 4 und 6 Stunden variiert, nach der vasoaktive Medikamente verabreicht werden müssen 12,13,21,22,23.
Zusätzlich zu den hämodynamischen Veränderungen fördern Hirninfarkt und Ischämie eine Zunahme der systemischen Zirkulation von proinflammatorischen Faktoren, die, wenn sie die Lunge erreichen, zur Schädigung des Lungenparenchyms beitragen 24,25,26.
In unserer Studie ging die BD mit einem signifikanten Anstieg der IL-1β-Expression im Gewebe (über Zöliakie) und des Nass-Trockengewichts-Verhältnisses, einem Index für Lungenödeme, einher. Frühere Studien haben auf einen Anstieg der zirkulierenden Spiegel proinflammatorischer Zytokine nach einem BD-Ereignis hingewiesen, was letztendlich die Modulation der Expression von Adhäsionsmolekülen, eine erhöhte Gefäßpermeabilität und die daraus resultierende Leukozytenmigration begünstigenkann 27,28,29,30.
Hämorrhagischer Schock (HS)
Das Festdruckmodell der HS, das durch die Entnahme oder Reinfusion von Blutaliquoten mit dem Ziel einer verlängerten Aufrechterhaltung der Hypotonie (≤ 50 mmHg) etabliert wurde, zielt darauf ab, die durch den hämorrhagischen Prozess verursachte Abnahme des Blutvolumens und damit die Abschwächung des systemischen Fülldrucks nachzuahmen. Diese Ereignisse führen zu einer Abnahme des MAP, begleitet von einer Abnahme des pulmonalen Perfusionsdrucks31,32.
Zu den Vorteilen dieses HS-Modells gehört die Möglichkeit, den Grad und die Dauer der Hypotonie zu kontrollieren, sowie die größere Reproduzierbarkeit der Technik im Vergleich zu Modellen, die auf einem voreingestellten Blutvolumen basieren. Dementsprechend legen die meisten in der Literatur verwendeten Protokolle einen Protokollzeitraum fest, der von 15 Minuten bis zu mehr als 180 Minuten variiert, wobei der mittlere Blutdruck je nach der in der Studie gewählten Analyse zwischen 20 und 55 mmHg liegt 6,32. In der vorliegenden Studie wurde die Hypotonie für 3 Stunden aufrechterhalten, was zu einem erhöhten Gewebewiderstand führte, gefolgt von einer verminderten Lungencompliance bei Tieren, die einer HS unterzogen wurden. Um dies zu untermauern, haben verschiedene Studien in der Literatur einen proportionalen Zusammenhang zwischen der in HS verbrachten Zeit und den Auswirkungen einer Hypovolämie auf den Atemwegswiderstand und die Lungencompliance gezeigt 6,33,34.
Darüber hinaus ging die HS in der vorliegenden Studie mit einer signifikanten Leukozytose und einer erhöhten Gewebeexpression von IL-1β (in Bezug auf Zöliakie) und TNF-α einher. Eine Schädigung des pulmonalen Mikrogefäßendothels, die durch die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies aus dem primären Prozess der Hypoxie und der etablierten Ischämie induziert wird, erhöht die Gefäßpermeabilität, was zusammen mit dem Anstieg des Lungenarteriendrucks als chemotaktischer Faktor für Leukozyten und die anschließende Freisetzung von Entzündungsmediatoren wirkt 6,20,31,35,36, 37,38.
Kreislauftod (CD)
Der Hauptunterschied zwischen den marginalen Transplantaten, die aus dem BD- und dem CD-Prozess stammen, ist die warme Ischämiezeit (WIT), der das Transplantat unterworfen wird, die von einigen Forschern als die Zeit zwischen dem Fehlen peripherer Impulse und der Unterbrechung des Blutflusses aufgrund der Entfernung von lebenserhaltenden Geräten bis zur Erkältung oder regionalen Durchblutung des Organs definiertwird 17. 39,40.
In der vorliegenden Studie wurden die Organe und Gewebe von Tieren, die aus dem Zöliakie-Modell stammten, einer WIT-Periode von 180 Minuten ausgesetzt. Mehrere Studien in der Literatur haben einen proportionalen Zusammenhang zwischen dem WIT und der Dysfunktion nach der Transplantation gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Ischämiezeit je nach den Besonderheiten und der Integrität jedes Organs variieren sollte. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass Lungentransplantate von Ratten bis zu 3-stündige Perioden warmer Ischämie tolerieren41,42.
Mit Hinweisen auf eine Gewebeschädigung durch die vorherrschende sympathische Phase, hämodynamische Instabilität und systemische Entzündung infolge des BD-Prozesses wurden Spenden nach Kreislaufstillstand als mögliche Strategie zur Verringerung von Komplikationen im Zusammenhang mit der Transplantation neu in Betracht gezogen 41,42,43. In diesem Sinne deuten unsere Daten auf eine dramatische Abnahme der IL-1β- und TNF-α-Spiegel im CD-Modell im Vergleich zu den beiden anderen untersuchten Modellen hin. Um dies zu bestätigen, stellten Iskender et al.4 fest, dass die niedrigen Konzentrationen von Gewebezytokinen in einem Modell der Lungenreperfusion bei Ratten mit Geweben, die nach dem WIT gespendet wurden, durch Mechanismen verursacht wurden, die noch wenig verstanden sind.
Auf der Grundlage des oben Gesagten sollten die Wahl der Methodik und ihre Anpassungen von den vom Forscher entwickelten Zielen abhängen. Sobald diese Ziele festgelegt sind, sollten sie die Art des Spendenmodells, die Protokollzeit und die durchzuführenden Analysen bestimmen. Es ist auch möglich, die Art der Spende mit Tiermodellen der Lungenrekonditionierung und -reperfusion in Beziehung zu setzen.
Schlüsse
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebenen Organspendermodelle potenzielle Werkzeuge für die Untersuchung der Veränderungen im Zusammenhang mit verschiedenen Transplantatentnahmemethoden darstellen und angesichts der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der hier vorgestellten Methoden ein vollständiges Verständnis der Auswirkungen der Qualität dieser Organe auf die Ergebnisse nach der Transplantation liefern könnten.
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Disclosures
Wir möchten bestätigen, dass es keine bekannten Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Veröffentlichung gibt und dass es keine nennenswerte finanzielle Unterstützung für diese Arbeit gegeben hat, die ihr Ergebnis beeinflusst haben könnte.
Acknowledgments
Wir danken der FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
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