כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.
רקמת החניכיים היא המבנה הראשון המגן על רקמות חניכיים וממלא תפקידים משמעותיים בתפקודים אוראליים רבים. אפיתל חניכיים הוא מבנה חשוב של רקמת חניכיים, במיוחד בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לחקר הפונקציות של תאי אפיתל חניכיים יש ערך מדעי מכריע, כגון תיקון פגמים אוראליים וזיהוי התאימות של ביו-חומרים. מכיוון שתאי אפיתל חניכים אנושיים הם תאים קרטין מובחנים מאוד, תוחלת החיים שלהם קצרה, וקשה לעבור. עד כה, יש רק שתי דרכים לבודד לתרבות תאי אפיתל חניכיים, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית. עם זאת, הזמן הנדרש כדי להשיג תאי אפיתל באמצעות שיטת explant ישיר הוא ארוך יותר, ואת שיעור ההישרדות התא של השיטה אנזימטית נמוך יותר. מבחינה קלינית, רכישת רקמת חניך מוגבלת, ולכן יש צורך בבידוד ומערכת תרבות יציבה, יעילה ופשוטה. שיפרנו את השיטה האנזימטית המסורתית על ידי הוספת Y-27632, מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK), אשר יכול לקדם באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל. השיטה האנזימטית המותאמת שלנו מפשטת את צעדי השיטה האנזימטית המסורתית ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל פולחניים פולחניים, שיש לה יתרונות משמעותיים על פני שיטת ההסבר הישיר והשיטה האנזימטית.
הגינגיבה האנושית, מבנה ההגנה הקו הראשון המגן על רקמת חניכיים, הוא לא רקמחסוםפיזי וכימי 1 , אלא גם מפריש סוגים שונים של מתווכים דלקתיים המשתתפים בתגובות חיסוניות ומהוויםמחסוםחיסוני 2,3. האפיתל חניכיים ממלא תפקיד חשוב בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לכן, לימוד ההגנה והחסינות של האפיתל חניכיים הוא בעל משמעות רבה להבנת התרחשות, אבחון וטיפול של חניכיים. הבידוד והתרבות של תאי אפיתל חניך מרקמת חניך אנושית הוא הצעד הראשון הנדרש לחקר האפיתל חניך. הליך כזה דורש פעולות בסיסיות כגון ייצור תאי זרעים להנדסת רקמות, מודלים במבחנה של מחלות חניכיים, וחומרים לתיקון פגמים חניכיים.
תאי אפיתל חניכים ראשוניים מאופיינים בשיעור חלוקה נמוך במבחנה4 , חוקרים מחפשים שיטת בידוד וטיפוח אופטימלית במשךעשרותשנים. עד כה, שתי טכניקות שונות, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית, משמשים בדרך כלל במעבדות כדי להשיג תאי אפיתל חניכיים ראשוניים במבחנה4,5. לשיטת explant ישיר יש יתרונות כגון הדרישה של כמות נמוכה יותר של דגימות רקמה והליך בידוד פשוט, אבל יש לו את החסרונות של זמן תרבות ארוך יותר ורגישות לזיהום5. למרות שהשיטה האנזימטית מקצרת את זמן התרבות הנדרש, היעילות נמוכה יחסית ומשתנה בהתאם לאנזימים ובינוני המשמש. Kedjarune ואח‘ 6 הראה כי שיטת explant ישיר, אשר דורש יותר זמן לפני תת תרבות (2 שבועות), נראה מוצלח יותר עבור כת תאי אפיתל חניכיים לעומת השיטה אנזימטית. עם זאת, בהשוואה לשתי שיטות אלה, Klingbeil ואח‘7 מצא כי השיטה אנזימטית היו התוצאות הטובות ביותר עבור תרביות ראשוניות של תאי אפיתל אוראלי, וניתן היה להשיג את תפוקת התא האופטימלי בתוך פרק הזמן הקצר ביותר (11.9 ימים לעומת 14.2 ימים).
לכן, היה חשוב לפתח שיטה נוחה ויעילה יותר לבידוד ותרבות של תאי אפיתל אוראלי4. דיווחנו בעבר כי הוספת Y-27632, מעכב של קינאז חלבון הקשורים Rho (ROCK), מפשט את הליך הבידוד של תאי אפידרמיס ראשוניים אנושיים וקרטינוציטים מרקמות עור בוגרות8,9,10. פיתחנו G-medium, מדיום חיסון מותנה חדש המפריד באופן ספונטני אפידרמיס מתאי עור ותומך בצמיחה ובתשואה של תאי אפידרמיס ראשוניים8,9,10. במחקר הנוכחי, פיתחנו טכניקת בידוד ותרבות חדשה ללא סרום לתאי אפיתל חניך על ידי שילוב G-medium עם Y-27632. בעיקרו של דבר, השיטה שלנו מבוססת על פישוט של השיטה אנזימטית דו-שלבה המסורתית, ולכן השווינו את השיטה החדשה שלנו עם שיטת explant ישיר. שיטה אנזימטית שונה זו מקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להפריד תאי אפיתל חניכים מרקמת חניך ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל חניך פולחני.
רקמת החניכיים היא מבנה מפתח השומר על שלמות ובריאות חניכיים. לתאי אפיתל חניכיים יש תפקידים משמעותיים בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים וניתן להשתמש בהם במחקר מדעי וביישומים קליניים ובתחומים קשורים, כולל ביולוגיה אוראלית, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, וליקויים ברירית הפה18. לכן, יש ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית המרכזית של הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2019ZD36) ותוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) ל- X.W.; תוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2018GSF118240) לג’יי ג’י; פרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2018WS163) ל- Z.X., ופרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2019WS045) ל- J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |