هنا نقدم طريقة معدلة لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجيفال الإنسان عن طريق إضافة مثبط الصخرة، Y-27632، إلى الطريقة التقليدية. هذه الطريقة أسهل وأقل استهلاكا للوقت ، وتعزز خصائص الخلايا الجذعية ، وتنتج أعدادا أكبر من الخلايا الظهارية عالية الإمكانات لكل من المختبر والتطبيقات السريرية.
النسيج اللثة هو الهيكل الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ويلعب أدوارا ذات مغزى في العديد من الوظائف عن طريق الفم. الظهارة اللثة هي بنية مهمة من الأنسجة اللثة ، وخاصة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة. دراسة وظائف الخلايا الظهارية الغنجيفال له قيمة علمية حاسمة، مثل إصلاح العيوب الفموية والكشف عن توافق المواد الحيوية. كما الخلايا الظهارية الغنجية البشرية هي خلايا الكيراتينية متباينة للغاية، وعمرها قصير، وأنها من الصعب المرور. حتى الآن، هناك طريقتان فقط لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الغنجيفال، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية. ومع ذلك، فإن الوقت اللازم للحصول على الخلايا الظهارية باستخدام طريقة الزرع المباشر أطول، ومعدل بقاء الخلية من الطريقة الأنزيمية أقل. سريريا، الحصول على النسيج الغنجيفال محدودة، لذلك هناك حاجة إلى عزل مستقرة وفعالة وبسيطة في المختبر ونظام الثقافة. قمنا بتحسين الطريقة الأنزيمية التقليدية بإضافة Y-27632 ، وهو مثبط كيناز (ROCK) مرتبط ب Rho ، والذي يمكن أن يعزز بشكل انتقائي نمو الخلايا الظهارية. لدينا طريقة انزيمية معدلة يبسط خطوات الطريقة الأنزيمية التقليدية ويزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية، والتي لديها مزايا كبيرة على طريقة explant المباشرة وطريقة الأنزيمية.
اللثة البشرية ، وهي بنية الدفاع الخط الأول الذي يحمي الأنسجة اللثة ، ليس فقط حاجزا ماديا وكيميائية1، ولكن أيضا يفرز فئات مختلفة من الوسطاء الالتهابيين الذين يشاركون في الاستجابات المناعية ويشكلون حاجزا مناعيا2،3. تلعب ظهارة اللثة دورا مهما في إصلاح وتجديد أنسجة اللثة. لذلك ، فإن دراسة الدفاع والمناعة من ظهارة اللثة ذات أهمية كبيرة لفهم حدوث التهاب اللثة وتشخيصه وعلاجه. عزل وثقافة الخلايا الظهارية الغنجية من الأنسجة الغنجية البشرية هي الخطوة الأولى المطلوبة لدراسة ظهارة الغنجيفال. يتطلب هذا الإجراء عمليات أساسية مثل إنتاج خلايا البذور لهندسة الأنسجة ، والنماذج المختبرية للأمراض المرتبطة باللثة ، ومواد لإصلاح عيوب اللثة.
تتميز الخلايا الظهارية الغنجية الأولية بانخفاض معدل الانقسام في المختبر4، وقد بحث الباحثون عن طريقة عزل وزراعة مثالية لعقود. حتى الآن، اثنين من تقنيات مختلفة، وطريقة explant مباشرة وطريقة الأنزيمية، وتستخدم عادة في المختبرات للحصول على خلايا الظهارة gingival الأولية في المختبر4،5. طريقة explant المباشر له مزايا مثل شرط وجود كمية أقل من عينات الأنسجة وإجراءات العزل البسيطة ، ولكن لديها مساوئ وقت أطول للثقافة والتعرض للتلوث5. على الرغم من أن الأسلوب الأنزيمي يقصر وقت الثقافة المطلوب ، إلا أن الكفاءة منخفضة نسبيا وتختلف اعتمادا على الإنزيمات والمتوسطة المستخدمة. وأظهر Kedjarune وآخرون6 أن طريقة الزرع المباشر، التي تتطلب المزيد من الوقت قبل الثقافة الفرعية (أسبوعين)، تبدو أكثر نجاحا لزراعة الخلايا الظهارية الغنجية مقارنة بصورة الأنزيمية. ومع ذلك، وبمقارنة هاتين الطريقتين، وجد كلينغبيل وآخرون 7 أن الطريقة الأنزيمية كان لها أفضل النتائج للثقافات الأولية للخلايا الظهارية الفموية، وكان من الممكنالحصول على الغلة المثالية للخلايا في أقصر فترة زمنية (11.9 يوما مقابل 14.2 يوما).
لذلك ، كان من المهم تطوير طريقة أكثر ملاءمة وفعالية لعزل وثقافة الخلايا الظهارية الفموية4. كنا قد ذكرت سابقا أن إضافة Y-27632, مثبط كيناز البروتين المرتبطة رو (روك), يبسط إجراء العزل من خلايا البشرة الأولية الإنسان وخلايا القرنية منأنسجةالجلد الكبار 8,9,10. طورنا G-المتوسطة، وسيلة تلقيح مشروطة جديدة أن يفصل تلقائيا البشرة من الخلايا الجلدية ويدعم نمو وغلة الخلايا البشرةالأولية 8،9،10. في هذه الدراسة، طورنا تقنية جديدة للعزل والثقافة الخالية من المصل للخلايا الظهارية الغنجية من خلال الجمع بين G-medium وY-27632. في جوهرها ، ويستند أسلوبنا على تبسيط الطريقة الأنزيمية التقليدية من خطوتين ، لذلك قارنا طريقتنا الجديدة مع طريقة الزرع المباشر. هذه الطريقة الأنزيمية المعدلة تقصر بشكل كبير الوقت اللازم لفصل الخلايا الظهارية الغنجية عن الأنسجة الغنجيفالية وتزيد من كفاءة زراعة الخلايا الظهارية الغنجيفالية.
النسيج gingival هو هيكل رئيسي يحافظ على سلامة اللثة والصحة. الخلايا الظهارية Gingival لها أدوار هامة في إصلاح وتجديد الأنسجة اللثة ويمكن استخدامها في البحث العلمي والتطبيقات السريرية والمجالات ذات الصلة، بما في ذلك بيولوجيا الفم، وعلم الصيدلة، وعلم السموم، ونقص الغشاء المخاطي عن طريق الفم<sup class…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل البرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) والبرنامج الرئيسي للبحث والتطوير في مقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى X.W. برنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2018GSF118240) إلى J.G. مشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2018WS163) إلى Z.X. ومشروع تطوير العلوم الطبية والصحية والتكنولوجيا في مقاطعة شاندونغ (2019WS045) إلى J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |