Здесь мы представляем модифицированный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток реснь человека путем добавления ингибитора Породы, Y-27632, к традиционному методу. Этот метод проще, менее трудоемкий, усиливает свойства стволовых клеток и производит большее количество высокофомотриальных эпителиальных клеток как для лабораторных, так и для клинических применений.
Денцевая ткань является первой структурой, которая защищает ткани пародонта и играет значимую роль во многих функциях полости рта. Эпителий области енной области является важной структурой ткани енной области, особенно в восстановлении и регенерации ткани пародонта. Изучение функций эпителиальных клеток депо имеет решающее научное значение, такое как восстановление дефектов полости рта и выявление совместимости биоматериалов. Поскольку эпителиальные клетки ресничков человека являются высокодифференцированными ороговевших клетками, их продолжительность жизни коротка, и их трудно пройти. До сих пор существует только два способа выделения и культивирования эпителиальных клеток рысений: метод прямого эксплантата и ферментативный метод. Однако время, необходимое для получения эпителиальных клеток методом прямого эксплантата, больше, а выживаемость клеток ферментативным методом ниже. Клинически приобретение десочной ткани ограничено, поэтому необходима стабильная, эффективная и простая система изоляции и культивирования in vitro. Мы улучшили традиционный ферментативный метод, добавив Y-27632, ингибитор Rho-ассоциированной киназы (ROCK), который может избирательно способствовать росту эпителиальных клеток. Наш модифицированный ферментативный метод упрощает этапы традиционного ферментативного метода и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток, что имеет значительные преимущества перед методом прямого эксплантата и ферментативным методом.
Десна человека, первая линия защитной структуры, защищающей ткани пародонта, является не только физико-химическим барьером1,но и выделяет различные классы медиаторов воспалительного действия, которые участвуют в иммунных реакциях и составляют иммунный барьер2,3. Эпителий области ден играет важную роль в восстановлении и регенерации тканей пародонта. Поэтому изучение защиты и иммунитета эпителия депо имеет большое значение для понимания возникновения, диагностики и лечения пародонтита. Выделение и культивирование эпителиальных клеток области решетки человека является первым шагом, необходимым для изучения эпителия области решетки. Такая процедура требует основных операций, таких как производство семенных клеток для тканевой инженерии, моделей in vitro заболеваний, связанных с пародонтозом, и материалов для восстановления дефектов пародонта.
Первичные эпителиальные клетки депив характеризуются низкой скоростью деления in vitro4,исследователи десятилетиями искали оптимальный метод изоляции и культивирования. На сегодняшний день два различных метода, метод прямого эксплантата и ферментативный метод, обычно используются в лабораториях для получения первичных клеток эпителия десны in vitro4,5. Метод прямого эксплантирования имеет такие преимущества, как требование меньшего количества образцов тканей и простая процедура выделения, но он имеет недостатки в более длительном времени культивирования и восприимчивости к загрязнению5. Хотя ферментативный метод сокращает требуемое время культивирования, эффективность относительно низкая и варьируется в зависимости от используемых ферментов и среды. Kedjarune et al.6 показали, что метод прямого эксплантата, который требует больше времени до субкультуры (2 недели), оказался более успешным для культивирования эпителиальных клеток десны по сравнению с ферментативным методом. Однако, сравнивая эти два метода, Klingbeil et al.7 обнаружили, что ферментативный метод имел наилучшие результаты для первичных культур эпителиальных клеток полости рта, и можно было получить оптимальный выход клеток в течение кратчайшего периода времени (11,9 дня против 14,2 дня).
Поэтому важно было разработать более удобный и эффективный метод выделения и культивирования эпителиальных клеток полости рта4. Ранее мы сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK), упрощает процедуру выделения первичных клеток эпидермиса человека и кератиноцитов из тканей кожи взрослого человека8,9,10. Мы разработали G-среду, новую кондиционированную среду для прививки, которая спонтанно отделяет эпидермальные клетки от кожных и поддерживает рост и выход первичных эпидермальных клеток8,9,10. В настоящем исследовании мы разработали новую технику выделения и культивирования эпителиальных клеток без сыворотки без сыворотки путем объединения G-среды с Y-27632. По сути, наш метод основан на упрощении традиционного двухэтапного ферментативного метода, поэтому мы сравнили наш новый метод с методом прямого эксплантата. Этот модифицированный ферментативный метод значительно сокращает время, необходимое для отделения эпителиальных клеток деска от дежной ткани и повышает эффективность культивирования эпителиальных клеток деповидной.
Денцевая ткань является ключевой структурой, которая поддерживает целостность пародонта и здоровье. Эпителиальные клетки десна играют значительную роль в восстановлении и регенерации ткани пародонта и могут быть использованы в научных исследованиях и клинических применениях и смеж…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Ключевой программой Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ZR2019ZD36) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Шаньдун (2019GSF108107) для X.W.; Ключевая программа исследований и разработок провинции Шаньдун (2018GSF118240) для J.G.; Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2018WS163) для Z.X. и Проект развития науки и техники в области медицины и здравоохранения провинции Шаньдун (2019WS045) для J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |