Isolering och kultur av primära mänskliga gingival epitelceller med Y-27632
Summary
Här presenterar vi en modifierad metod för isolering och kultur av mänskliga gingival epitelceller genom att lägga till Rock-hämmaren, Y-27632, till den traditionella metoden. Denna metod är enklare, mindre tidskrävande, förbättrar stamcellsegenskaper och producerar ett större antal epitelceller med hög potential både för laboratoriet och för kliniska tillämpningar.
Abstract
Gingivalvävnaden är den första strukturen som skyddar parodontala vävnader och spelar meningsfulla roller i många muntliga funktioner. Gingival epitel är en viktig struktur av gingival vävnad, särskilt i reparation och regenerering av parodontala vävnad. Att studera funktionerna hos gingival epitelceller har avgörande vetenskapligt värde, såsom att reparera orala defekter och upptäcka biomaterialens kompatibilitet. Eftersom mänskliga gingival epitelceller är mycket differentierade keratiniserade celler, deras livslängd är kort, och de är svåra att passera. Hittills finns det bara två sätt att isolera och odla gingival epitelceller, en direkt explant metod och en enzymatisk metod. Den tid som krävs för att erhålla epitelceller med direkt explant-metod är dock längre och cellöverlevnaden för den enzymatiska metoden är lägre. Kliniskt är förvärvet av gingival vävnad begränsat, så ett stabilt, effektivt och enkelt in vitro isolering och kultursystem behövs. Vi förbättrade den traditionella enzymatiska metoden genom att lägga till Y-27632, en Rho-associerad kinas (ROCK) hämmare, som selektivt kan främja tillväxten av epitelceller. Vår modifierade enzymatiska metod förenklar stegen i den traditionella enzymatiska metoden och ökar effektiviteten hos odling av epitelceller, vilket har betydande fördelar jämfört med den direkta explantmetoden och den enzymatiska metoden.
Introduction
Den mänskliga gingiva, den första linjens försvarsstruktur som skyddar parodontal vävnad, är inte bara en fysisk och kemiskbarriär 1, men utsöndrar också olika klasser av inflammatoriska medlare som deltar i immunsvar och utgör enimmunbarriär 2,3. Gingival epitel spelar en viktig roll i reparation och regenerering av parodontala vävnad. Därför är studier av försvaret och immuniteten hos gingival epitel av stor betydelse för att förstå förekomsten, diagnosen och behandlingen av parodonit. Isolering och kultur av gingival epitelceller från mänskliga gingival vävnad är det första steget krävs för att studera gingival epitel. Ett sådant förfarande kräver grundläggande åtgärder som att producera fröceller för vävnadsteknik, in vitro-modeller av parodontala associerade sjukdomar och material för reparation av parodontala defekter.
Primära gingival epitelceller kännetecknas av en låg uppdelningshastighet in vitro4, forskare har letat efter en optimal isolerings- och odlingsmetod i årtionden. Hittills används två olika tekniker, en direkt explantmetod och en enzymatisk metod, ofta i laboratorier för att erhålla primära gingival epitelceller in vitro4,5. Den direkta explantmetoden har fördelar som kravet på en lägre mängd vävnadsprover och enkelt isoleringsförfarande, men det har nackdelarna med längre odlingstid och mottaglighet för kontaminering5. Även om den enzymatiska metoden förkortar den kulturtid som krävs, är effektiviteten relativt låg och varierar beroende på de enzymer och medium som används. Kedjarune et al.6 visade att den direkta explantmetoden, som kräver mer tid före subkultur (2 veckor), verkade vara mer framgångsrik för odling av gingival epitelceller jämfört med enzymatisk metod. Men genom att jämföra dessa två metoder fann Klingbeil et al.7 att den enzymatiska metoden hade de bästa resultaten för primära kulturer av orala epitelceller, och det var möjligt att få optimal cellutbyte inom den kortaste tidsperioden (11, 9 dagar jämfört med 14, 2 dagar).
Därför var det viktigt att utveckla en bekvämare och effektivare metod för isolering och kultur av muntliga epitelceller4. Vi rapporterade tidigare att tillsats av Y-27632, en hämmare av Rho-associerade proteinkinaser (ROCK), förenklar isoleringsförfarandet för mänskliga primära epidermal celler och keratinocyter från vuxnahudvävnader 8,9,10. Vi utvecklade G-medium, ett nytt konditionerat inokuleringsmedium som spontant separerar epidermal från hudceller och stöder tillväxt och utbyte av primära epidermalaceller 8,9,10. I den aktuella studien utvecklade vi en ny serumfri isolerings- och odlingsteknik för gingival epitelceller genom att kombinera G-medium med Y-27632. I huvudsak bygger vår metod på en förenkling av den traditionella tvåstegs enzymatiska metoden, så vi jämförde vår nya metod med den direkta explantmetoden. Denna modifierade enzymatiska metod förkortar avsevärt den tid som krävs för att separera gingival epitelceller från gingival vävnad och ökar effektiviteten av odling gingival epitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gingivalvävnaden är en nyckelstruktur som upprätthåller parodontala integritet och hälsa. Gingival epitelceller har betydande roller i reparation och regenerering av parodontala vävnad och kan användas i vetenskaplig forskning och kliniska tillämpningar och relaterade områden, inklusive muntlig biologi, farmakologi, toxikologi och muntliga slemhinnorbrister 18. Därför är det nödvändigt att utveckla en stabil och effektiv metod för att skörda orala epitelceller19</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) och nyckelprogrammet för forskning och utveckling i Shandongprovinsen (2019GSF108107) till X.W.; Det viktigaste forsknings- och utvecklingsprogrammet i provinsen Shandong (2018GSF118240) till J.G.; Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (2018WS163) till Z.X., och Medical and Health Science and Technology Development Project i Shandong Province (2019WS045) till J.S.
Materials
| Names | Abbreviations & Comments | ||
| Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
| 1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
| Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
| Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
| Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
| rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
References
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158 (2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
- Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766 (2014).
- Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
- Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
- Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
- Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
- Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
- Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
- Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
- Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
- Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
- Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
- Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
- Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
- Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
- Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
- Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
- Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
- Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
- Smola, H., Krieg, T., Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. . The keratinocyte handbook. 375, 311 (1994).
- Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
- Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651 (2015).
- Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
- Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780 (2020).
- Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).
