Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.
Diş eti dokusu periodontal dokuları koruyan ve birçok oral fonksiyonda anlamlı roller oynayan ilk yapıdır. Diş eti epitel, özellikle periodontal dokunun onarımı ve yenilenmesinde diş eti dokusunun önemli bir yapısıdır. Diş eti epitel hücrelerinin işlevlerini incelemek, oral kusurları onarmak ve biyomalzemelerin uyumluluğunu tespit etmek gibi çok önemli bilimsel değere sahiptir. İnsan dişeti epitel hücreleri son derece farklılaştırılmış keratinize hücreler olduğundan, ömürleri kısadır ve geçişleri zordur. Şimdiye kadar, diş eti epitel hücrelerini izole etmenin ve kültürlemenin sadece iki yolu vardır, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemini kullanarak epitel hücreleri elde etmek için gereken süre daha uzundur ve enzymatic yöntemin hücre sağkalım oranı daha düşüktür. Klinik olarak, diş eti dokusunun kazanımı sınırlıdır, bu nedenle istikrarlı, verimli ve basit bir in vitro izolasyon ve kültür sistemine ihtiyaç vardır. Epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik edebilecek Rho ile ilişkili bir kinaz (ROCK) inhibitörü olan Y-27632’yi ekleyerek geleneksel enzimmatik yöntemi geliştirdik. Modifiye enzymatic yöntemimiz, geleneksel enzymatic yöntemin adımlarını basitleştirir ve doğrudan eksplant yöntemine ve enzymatic yönteme göre önemli avantajlara sahip olan epitel hücrelerinin kült verimliliğini arttırır.
Periodontal dokuyu koruyan ilk hat savunma yapısı olan insan dişeti, sadece fiziksel ve kimyasal bir bariyer1değil, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarına katılan ve bağışıklık bariyeri oluşturan farklı inflamatuar mediatör sınıflarını salgılar2,3. Diş eti epitel, periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, diş eti epitelinin savunmasını ve bağışıklığını incelemek periodontitin oluşumunu, tanısını ve tedavisini anlamak için büyük öneme sahiptir. Diş eti epitel hücrelerinin insan dişeti dokusundan izolasyonu ve kültürü, diş eti epitelinin incelenmesi için gerekli ilk adımdır. Böyle bir prosedür, doku mühendisliği için tohum hücreleri üretmek, periodontal ilişkili hastalıkların in vitro modelleri ve periodontal kusurları onarmak için malzemeler gibi temel operasyonları gerektirir.
Primer diş eti epitel hücreleri düşük bölünme oranı in vitro4ile karakterizedir Araştırmacılar on yıllardır optimal bir izolasyon ve yetiştirme yöntemi aramaktadır. Bugüne kadar laboratuvarlarda primer diş eti epitel hücrelerini in vitro4,5elde etmek için iki farklı teknik, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğrudan eksplant yöntemi, daha az miktarda doku örneğinin gerekliliği ve basit izolasyon prosedürü gibi avantajlara sahiptir, ancak daha uzun kültür süresi ve kontaminasyona yatkınlık dezavantajlarına sahiptir5. Enzimmatik yöntem gereken kültür süresini kısaltsa da, verimlilik nispeten düşüktür ve kullanılan enzimlere ve ortama bağlı olarak değişir. Kedjarune ve ark.6, alt kültürden önce (2 hafta) daha fazla zaman gerektiren doğrudan eksplant yönteminin, enzimatik yönteme kıyasla diş eti epitel hücrelerini kültlemede daha başarılı göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntemi karşılaştıran Klingbeil ve ark.7, enzmatik yöntemin oral epitel hücrelerinin birincil kültürleri için en iyi sonuçlara sahip olduğunu ve en kısa süre içinde (11.9 gün ile 14.2 gün) optimal hücre verimini elde etmenin mümkün olduğunu buldu.
Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek önemliydi4. Daha önce Rho ile ilişkili protein kinazının (ROCK) bir inhibitörü olan Y-27632’nin eklenmesinin, insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin yetişkin cilt dokularından izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini bildirdik8,9,10. Epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen ve epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen yeni bir şartlandırılmış aşılama ortamı olan G-medium’u geliştirdik8,9,10. Bu çalışmada G-medium ile Y-27632’yi birleştirerek diş eti epitel hücreleri için yeni bir serumsuz izolasyon ve kültür tekniği geliştirdik. Özünde, yöntemimiz geleneksel iki adımlı enzymatic yöntemin basitleştirilmesine dayanmaktadır, bu nedenle yeni yöntemimizi doğrudan explant yöntemiyle karşılaştırdık. Bu modifiye enzimatik yöntem, diş eti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır ve diş eti epitel hücrelerinin kültleme verimliliğini arttırır.
Diş eti dokusu periodontal bütünlüğü ve sağlığı koruyan anahtar bir yapıdır. Dişeti epitel hücreleri periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli rollere sahiptir ve oral biyoloji, farmakoloji, toksikoloji ve oral mukoza eksiklikleri de dahil olmak üzere bilimsel araştırma ve klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda kullanılabilir18. Bu nedenle, oral epitel hücrelerini hasat etmek için istikrarlı ve verimli bir yöntem geliştirmek gerekir19</su…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı ve Shandong Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) tarafından X.W.’ye desteklenmiştir; Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2018GSF118240) J.G.’ye; Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2018WS163) Z.X.’ye ve Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2019WS045) J.S.
Names | Abbreviations & Comments | ||
Countess automated cell counter | Shanghai Ruiyu Bio-science&Technology Co.Ltd. | BBA0218AC | Automatic cell counting |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubation |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
50 ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifugation |
1.5 ml microcentrifuge Tubes | KIRGEN | 190691J | For cell digestion |
Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Gingival epithelial cells culture medium |
Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HGGEPCs dissociation |
Dilution Medium | Life Technologies | 50-9701 | For coating matrix |
Dispase | Gibco | 17105-041 | For HGGEPCs isolation |
Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HGGEPCs isolation |
F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
Y-27632 | Gene Operation | IAD1011 | ROCK inhibitor |
Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | For Cell proliferation assay |
Rabbit Anti-Human CK18 | Abcam | ab82254 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Rabbit Anti-Human Cytokeratin10 | Abcam | ab76318 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of Gingival fibroblasts |
Rabbit Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-Ki67 | Abcam | 15580 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p63 | Biolegend | 619002 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |
rabbit anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HGGEPCs |