Summary
Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.
Abstract
Tijdens de activering past het metabolisme van T-cellen zich aan aan veranderingen die hun lot beïnvloeden. Een toename van mitochondriale oxidatieve fosforylering is onmisbaar voor T-celactivatie en de overleving van geheugen-T-cellen is afhankelijk van mitochondriale remodellering. Bijgevolg beïnvloedt dit de klinische uitkomst op lange termijn van kankerimmunotherapieën. Veranderingen in T-celkwaliteit worden vaak bestudeerd door flowcytometrie met behulp van bekende oppervlaktemarkers en niet direct door hun metabolische toestand. Dit is een geoptimaliseerd protocol voor het meten van real-time mitochondriale ademhaling van primaire menselijke T-cellen met behulp van een Extracellulaire Flux Analyzer en de cytokines IL-2 en IL-15, die het T-celmetabolisme anders beïnvloeden. Het is aangetoond dat de metabole toestand van T-cellen duidelijk kan worden onderscheiden door het zuurstofverbruik te meten bij het remmen van belangrijke complexen in de metabole route en dat de nauwkeurigheid van deze metingen sterk afhankelijk is van een optimale remmerconcentratie en remmerinjectiestrategie. Dit gestandaardiseerde protocol zal helpen bij het implementeren van mitochondriale ademhaling als een standaard voor T-celfitness bij het monitoren en bestuderen van kankerimmunotherapieën.
Introduction
Correcte ontwikkeling en functie van T-cellen zijn essentieel voor het vermogen van het immuunsysteem om antigenen te herkennen en erop te reageren. Mitochondriale oxidatieve fosforylering (OxPhos) verandert afhankelijk van de toestand van de T-cel. Naïeve T-cellen gebruiken voornamelijk OxPhos om ATP te produceren, terwijl geactiveerde T-cellen een metabole overgang ondergaan waarbij glycolyse dominant wordt1. Na de effectorfase keert de kleine resterende subset van geheugen-T-cellen terug naar een metabolische toestand die wordt gedomineerd door OxPhos2,3. De veranderingen van OxPhos volgen de differentiatie van T-cellen in zo'n mate dat zelfs subsets van T-cellen kunnen worden gedifferentieerd door hun specifieke OxPhos-eigenschappen1. Omgekeerd is OxPhos belangrijk voor de functie van T-cellen en is aangetoond dat remming van OxPhos proliferatie en cytokineproductie van T-cellen blokkeert4. Daarom is de mogelijkheid om de eigenschappen van T-cel OxPhos op een nauwkeurige en reproduceerbare manier te kwantificeren een krachtig hulpmiddel voor iedereen die met T-cellen werkt.
In dit protocol worden de eigenschappen van T-cel OxPhos gemeten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. De kernfunctie van deze analyzer is het continu meten van het zuurstofgehalte van de groeimedia van de te analyseren cellen. Zuurstof verwijderd uit de groeimedia wordt verondersteld te worden opgenomen door de cellen. Door de cellen te behandelen met een verscheidenheid aan OxPhos-remmers of modifiers, wordt een daling van de zuurstofopname geassocieerd met de geremde of gemoduleerde functie. Remming van het ATP-synthase zal bijvoorbeeld leiden tot een verminderde cellulaire opname van zuurstof die anders zou worden gebruikt om ATP te produceren door oxidatieve fosforylering. Andere apparatuur, waaronder de Clark-elektrode en het Oroboros-instrument, biedt vergelijkbare functionaliteit en elk instrument heeft verschillende voordelen en tekortkomingen. Een breed scala aan celtypen kan worden gebruikt voor studies in deze apparaten, maar een bijzonder uitdagend celtype is menselijke primaire T-lymfocyten5. Vanwege hun kleine formaat, slechte overleving ex vivo en niet-adherente eigenschappen, kunnen menselijke primaire T-cellen een uitdaging zijn om te bestuderen.
Dit is een protocol voor het bestuderen van de mitochondriale ademhaling van menselijke primaire T-cellen door een extracellulaire analysator. Het protocol is verdeeld in een Optimalisatie run, waarbij optimale concentraties van celgetal per put, evenals de optimale concentratie van oligomycine en FCCP, worden bepaald. Verder wordt er een Assay uitgevoerd, waarbij de geoptimaliseerde condities worden gebruikt.
Met behulp van bloed-afgeleide menselijke PBMC's en ex vivo primaire T-celculturen, toont dit protocol het belang aan van een optimale remmerconcentratie en de relevantie van het gebruik van afzonderlijke in plaats van een sequentiële injectie van mitochondriale remmers bij het werken met gevoelige celtypen. Ten slotte is aangetoond dat deze test robuuste subtiele verschillen in mitochondriale ademhaling kan detecteren bij polarisatie met cytokines IL-2 en IL-15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Herlev-ziekenhuis en de hoofdstedelijke regio van Denemarken.
OPMERKING: Dit protocol bevat instructies voor zowel een optimalisatierun als een assays-run. Het is duidelijk in de tekst geschreven wanneer instructies zijn voor een optimalisatierun of een assay-run. Voer een optimalisatierun uit voordat u doorgaat met de assay-uitvoeringen
1. Menselijke perifere bloed mononucleaire (PBMC) isolatie van buffy coats
- PBMC isolatie
- Verzamel buffy jassen van de juiste instelling (verzameld in bloedafnamezakken). Buffy coats zijn afkomstig van gezonde donoren. Sluit donoren uit die onlangs pijnstillers hebben gebruikt.
- Spuit de bloedafnamezak met de buffy coat in met 70% ethanol voordat u deze overbrengt naar een laminaire flowkast. Gebruik altijd steriele technieken en steriele hardware voor alle stappen
OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste autorisaties voor de behandeling van menselijke bloedmonsters zijn verkregen. - Breng het bloed over naar een steriele centrifugebuis van 50 ml.
- Verdun het bloed ten minste 10% met niet-aangevulde RPMI 1640.
- Giet 20 ml van het gewenste dichtheidsgradiëntmedium in een centrifugebuis van 50 ml.
- Zuig 25 ml van het verdunde bloed op in een serologische pipet. Stel de elektrische pipetcontroller in op de laagste snelheid.
- Houd de buis met dichtheidsgradiëntmedium in een hoek van 45° en laat de serologische pipetpunt aan de binnenkant van de centrifugebuis van 50 ml rusten. Laat langzaam 25 ml van het verdunde bloed uit de serologische pipet los.
- Zorg ervoor dat het verdunde bloed en het medium met dichtheidsgradiënt niet mengen. Zorg ervoor dat het verdunde bloed bovenop het medium met dichtheidsgradiënt rust.
- Herhaal dit met daaropvolgende mediumbuizen met dichtheidsgradiënt totdat al het verdunde bloed is verwerkt.
- Verplaats de buizen voorzichtig naar een centrifuge en centrifugeer bij 1000 x g gedurende 30 minuten in een uitklapbare rotor bij kamertemperatuur (RT). Zorg ervoor dat de acceleratie en rem op een minimum zijn.
OPMERKING: Na het centrifugeren moeten verschillende lagen zichtbaar zijn. De bovenste, heldere roze-oranje laag bestaat uit het bloedplasma en de bloedplaatjes. De middelste witte laag bestaat uit de PBMC's gevolgd door een heldere laag die bestaat uit het dichtheidsgradiëntmedium en ten slotte een donkerrode laag aan de onderkant met rode bloedcellen. - Gebruik een steriele Pasteur pipet om de PBMC-bevattende witte laag voorzichtig op te zuigen tot een centrifugebuis van 50 ml.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het medium met dichtheidsgradiënt niet overdraagt, omdat dit de stroomafwaartse zuivering zal beïnvloeden. Overtollig plasma heeft geen invloed op de resultaten. - Pool alle verzamelde PBMC's in dezelfde centrifugebuis van 50 ml en vul tot 50 ml aan met RPMI 1640.
- Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij RT (voer de resterende centrifugatiestappen uit bij deze instelling, tenzij anders aangegeven).
- Adem het supernatant op en resuspend de cellen in 30 ml RPMI 1640. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.
- Voor cryopreservatie, resuspend een maximum van 30 miljoen cellen per 1 ml vriesmedium.
- Breng de cellen over naar cryobuizen en vries in tot -80 °C met behulp van een snelheidsgecontroleerde vriescontainer (-1 °C per minuut). Voor langdurige opslag verplaatst u de PBMC's naar -140 °C.
OPMERKING: Beperk de tijd dat cellen zich in het vriesmedium bij RT bevinden. Bij RT is DMSO zeer giftig voor cellen.
2. Kweken van geactiveerde menselijke primaire T-lymfocyten
- Ontdooien van cellen (dag 1)
- Verwarm 10 ml RPMI 1640 per monster voor tot ongeveer 37 °C.
- Neem het gewenste aantal celampullen en bewaar ze tijdelijk op droogijs.
- Resuspend de bevroren cellen in 10 ml voorverwarmde RPMI 1640.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 x g bij RT.
- Gooi het supernatant weg en was de cellen opnieuw door resuspendatie in 10 ml RPMI 1640 en centrifugeer zoals beschreven in punt 2.1.4.
- Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen bij 2 x 106 cellen per ml X-VIVO 15 medium + 5% humaan serum (hierna: T-celmedium).
- Plaat 2 ml van de cellen per put in een 24-well celkweekplaat en incamineer 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.
- Activering van cellen (dag 0)
- Was CD3/CD28-kralen door 12,5 μL kralen per 1 miljoen cellen over te brengen naar een microcentrifugebuis. Voeg 12,5 μL PBS per 12,5 μL kralen toe.
OPMERKING: Het is belangrijk om de flacon met kralen voor gebruik te vortexen. - Plaats de microcentrifugebuis gedurende 1 minuut op een geschikte magneet.
- Gooi de buffer weg en resuspend de kralen in het oorspronkelijke volume van het T-celmedium (12,5 μL T-celmedium per 12,5 μL van het oorspronkelijke volume kralen).
- Voeg 12,5 μL kralen per miljoen cellen toe, wat overeenkomt met een verhouding van 1:2 (kralen: cellen).
- Verdeel de cellen in twee omstandigheden met elk ongeveer 5 miljoen cellen.
- Voeg het juiste volume cytokines toe aan de omstandigheden zoals vermeld in tabel 1.
- Incubeer de cellen gedurende 3 dagen bij 37 °C en 5% CO2.
- Was CD3/CD28-kralen door 12,5 μL kralen per 1 miljoen cellen over te brengen naar een microcentrifugebuis. Voeg 12,5 μL PBS per 12,5 μL kralen toe.
- Kweken van cellen (dag 3 en 5)
- Resuspend de cellen en splits ze door de helft van het volume van elke put over te brengen naar een nieuwe put. Voeg hetzelfde volume vers T-celmedium toe aan elke put.
- Voeg nieuwe cytokines toe aan elke aandoening zoals vermeld in tabel 1.
3. Extracellulaire fluxtest
- Hydratatie van de sensorcartridge (dag 0)
- Pak de sensorcartridge uit en verwijder de sensorcartridge voorzichtig van de gebruiksplaat.
- Plaats de sensorcartridge ondersteboven en zorg ervoor dat u de sensorsondes niet aanraakt.
- Vul de gebruiksplaat met 200 μL kalibrant (zie materialentabel voor meer informatie) en plaats de sensorcartridge voorzichtig terug in de gebruiksplaat.
- Als alternatief, om elke bubbelvorming te elimineren, incubeer de sensorpatroon 's nachts in steriel ultrapuur water en vervang deze op de ochtend van de test door een voorverwarmd kalibrant.
- Incubeer de sensorpatroonplaat bij 37 °C 's nachts in een niet-CO2-gereguleerde verwarmingskast.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om een niet-CO2-gereguleerde kast te gebruiken, omdat overtollige CO2 de sensorcartridge zal beïnvloeden. Zorg ervoor dat de fluxanalysator (zie materiaaltabel voor details) ten minste een dag voor gebruik is ingeschakeld om deze tot 37 °C te laten opwarmen.
- Celcoating en bereiding van mitochondriale remmers (dag 1)
- Bereid een coatingoplossing (zie materiaaltabel) met NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) en NaOH (1,0 M, 24 μL).
OPMERKING: Coatingoplossing moet altijd vers worden gemaakt en gebruikt. - Open een verse XF-celkweekplaat en voeg 12 μL van de vers bereide coatingoplossing toe aan elke put. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van de coatingoplossing op de bodem van alle putten.
- Incubeer de plaat bij RT met het deksel erop gedurende 30 minuten en gooi de resterende vloeibare oplossing uit alle putjes weg.
- Was de plaat met 200 μL steriel water en gooi de vloeistof weg.
- Was de plaat met 200 μL steriel PBS van celkweekkwaliteit en gooi de vloeistof weg.
- Laat het bord bij RT staan en laat het minstens 30 min drogen.
- Bereid een coatingoplossing (zie materiaaltabel) met NaHCO3 (pH 8,3, 0,1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/ml, 48 μL) en NaOH (1,0 M, 24 μL).
- Plaat T-cellen in de XF-celkweekplaat (dag 1)
- Bereid 50 ml testmedia door geschikte XF RPMI-media te mengen met glucose, pyruvaat en glutamine volgens experimentele opstelling (aanbevolen niveaus: 4 mM glucose, 1 mM pyruvaat en 3 mM glutamine).
- Verwarm tot 37 °C in een niet-CO2-gereguleerde incubator en stel de pH in op 7,4. Zorg ervoor dat er voldoende media zijn voor het platen van cellen en het bereiden van oligomycine- en FCCP-oplossingen (rubriek 3.4).
- Ontwerp een plaatlay-out met een toenemend aantal cellen per put voor optimalisatierun of assayrun. Gebruik vier 4 putjes, gevuld met media en geïnjecteerd met media, voor achtergrondmetingen.
- Tel T-cellen bereid in punt 2.3 (volgens de voorkeursmethode) en pipetteer het juiste aantal cellen naar elke put van de XF-celkweekplaat bedekt met de coatingoplossing, volgens de plaatlay-out.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van elke put kan variëren, maar moet voldoende zijn om de bodem van de put te bedekken. - Centrifugeer de XF-celkweekplaat gedurende 10 minuten bij 1000 x g bij RT om de T-cel aan het gecoate oppervlak te hechten.
- Was de cellen met 200 μL testmedia, gooi de media weg en voeg 180 μL testmedia toe.
OPMERKING: Inspecteer de putten visueel met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn bevestigd en gelijkmatig over het putoppervlak zijn verdeeld. - Incubeer de XF-celkweekplaat gedurende 30 minuten in de niet-CO2-gereguleerde verwarmingskast om ervoor te zorgen dat de temperatuur van de plaat 37 °C is.
- Laadsensorcartridge met oligomycine en FCCP voor optimalisatierun (dag 1)
OPMERKING: Als de oligomycine- en FCCP-concentraties al waren geoptimaliseerd, ga dan verder met rubriek 3.5.- Bereid werkoplossingen van oligomycine en FCCP in testmedia (bereid in stap 3.3.1) zoals beschreven in de stappen 3.4.2 en 3.4.3.
- Oligomycine-werkoplossingen: bereid 5 μM-oplossing (2 ml testmedia + 10 μL 1 mM oligomycine-voorraad) en 3 μM-oplossing (8 ml testmedia + 24 μL 1 mM oligomycine-voorraad).
- FCCP-werkoplossing: Bereid 2 μM-oplossing (2 ml testmedia + 13,2 μL van 300 μM FCCP-voorraad) en een 1,3 μM-oplossing (8 ml assaymedia + 34,6 μL van 300 μM FCCP-voorraad)
- Laad de werkoplossingen van oligomycine of FCCP in de injectiepoorten van de sensorcartridge (tabel 2).
NOTITIE. Het is belangrijk dat geen enkele injectiepoort alleen lucht bevat. Als om welke reden dan ook niet alle injectiepoorten worden gebruikt, moeten lege poorten worden gevuld met testmedia. - Klop voorzichtig de randen van de plaat op de tafel om mogelijke bubbels in de injectiepoorten te verwijderen.
- Sensorcartridge laden met oligomycine, FCCP en antimycine A voor testrun (dag 1)
- Bereid oplossingen van oligomycine, FCCP in testmedia (bereid in stap 3.3.1) volgens de optimale concentraties die in een eerdere optimalisatierun zijn geïdentificeerd. Bereid ook een 20 μM antimycine A-oplossing voor.
- Laad 20 μL oligomycine of FCCP in injectiepoort A van de sensorcartridge volgens de lay-out van de plaat. Voeg 22 μL van 20 μM antimycine A toe aan injectiepoort B van alle putjes. De resulterende concentratie van antimycine A eenmaal geïnjecteerd in de put zal 2 μM zijn.
- Opzetten van experimenteel protocol in Flux analyzer software.
- Wijs de groepen en plaattoewijzing toe voor elke voorwaarde per plaatlay-out.
- Ontwerp het protocol volgens de injectiestrategie (tabel 3 en figuur 1).
OPMERKING: Bij het uitvoeren van Assay runs kunnen injectie C en D worden weggelaten. - Sla de set-up van de test op, vul de informatie in die nodig is om voor de test te worden opgenomen en druk op Start.
- De fluxanalysator vraagt om de sensorcartridge die in punt 3.5 is voorbereid. Verwijder het deksel en plaats de sensorcartridge zoals aangegeven door de analyzer.
OPMERKING: De test kalibreert en controleert sensoren die worden aangegeven door vinkjes. Na een succesvolle kalibratie zal de analysator de in punt 3.3 voorbereide XF-celkweekplaat aanvragen. De gebruiksplaat wordt uit de analysator geworpen en vervangen door de XF-celkweekplaat om de test te starten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een correcte bepaling van OxPhos eigenschappen is een onmisbaar hulpmiddel bij het bestuderen van T-cellen. Als de testomstandigheden echter niet zijn geoptimaliseerd, bestaat er een aanzienlijk risico op misleidende of onjuiste resultaten. In dit protocol is er een sterke focus op de optimalisatie van het celgetal per put en de te gebruiken concentraties oligomycine en FCCP. In de beschreven opstelling worden oligomycine en FCCP stapsgewijs aan dezelfde put toegevoegd, waardoor de concentratie van de mitochondriale modulatoren toeneemt. De optimale concentratie van oligomycine en FCCP kan worden bepaald uit de resulterende OCR-curven van de putten als de concentratie waar een plateau wordt bereikt.
In de representatieve loop wordt oligomycine toegevoegd in een toenemende concentratie en remt ATP-synthase (Complex V van de elektronentransportketen), wat resulteert in verminderde mitochondriale ademhaling. Een plateau in OCR wordt bereikt nadat de accumulatieve concentratie van de putten 1 μM heeft bereikt. Door deze concentratie en toenemende concentraties werd de OCR niet verder verlaagd (figuur 1A). Voor putten die werden behandeld met een incrementele concentratie van de ontkoppelings-FCCP, stegen de OCR-niveaus zoals verwacht totdat een plateau werd bereikt nadat 0,2 μM FCCP was toegevoegd, wat aangeeft dat bij deze concentratie volledige ontkoppeling werd verkregen (figuur 1B). Een optimalisatie van cellen per put is belangrijk voor een correcte en reproduceerbare assay. Als het gebruikte celnummer te laag is, is het zuurstofgehalte dat door de cellen uit de testmedia wordt verwijderd te laag om correct door de analysator te worden gemeten. Aan de andere kant, als het aantal cellen per put te hoog is, kan het zuurstofverbruik van de cellen zo hoog worden dat het systeem na elke meting de zuurstofniveaus van de testmedia niet kan aanvullen, wat leidt tot een steeds hypoxischer omgeving en onjuiste OxPhos-karakterisering.
In de representatieve run werden cellen gezaaid met een dichtheid van 200.000 en 400.000 cellen per put (figuur 2A-C). Voor een run met 200.000 cellen is de initiële OCR ongeveer de helft van een run met 400.000 cellen per put. Voor FCCP-behandeling is de maximale OCR 61,6 pmol/min (200.000 cellen) versus 190,4 pmol/min (400.000 cellen). Na oligomycinebehandeling stort de OCR in de run met 200.000 cellen in elkaar in enkelcijferige OCR (6,4 pmol / min). Dit is lager dan de OCR van de run, met 400.000 cellen per goed behandeld met oligomycine (respectievelijk 25,8 pmol/min).
Daarom is uit de optimalisatierun duidelijk dat een celaantal van 400.000 cellen per put nodig was voor toekomstige testen, met behulp van 1 μM oligomycine en 0,2 μM FCCP. In de klassieke opstelling die door de fabrikant wordt aanbevolen, worden oligomycine en FCCP achtereenvolgens toegevoegd met de laatste toevoeging van antimycine A. Voor T-cellen is dit niet de optimale aanpak, omdat de oligomycinebehandeling de ontkoppeling na FCCP-behandeling beperkt (figuur 3A,B). In deze gepresenteerde methode wordt aanbevolen om elke aandoening in dubbele putten uit te voeren en de ene goed te behandelen met oligomycine en de andere met FCCP, met een laatste toevoeging van antimycine A voor beide putten. Door deze aanpak te gebruiken, heeft de oligomycinebehandeling geen invloed op OCR na FCCP-behandeling. Deze benadering maakt het mogelijk om dezelfde mitochondriale eigenschappen te bepalen als de klassieke opstelling, waarbij geneesmiddelen in volgorde worden toegevoegd (figuur 3C)
Ten slotte werd onderzocht of de effecten van cytokines IL-2 en IL-15 konden worden gedifferentieerd op het metabolisme van ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen. Il-15 gekweekte cellen bezaten inderdaad een hogere maximale ademhaling en reserve ademhalingscapaciteit, zoals eerder is aangetoond1 (figuur 4A-E). Basale ademhaling en ATP-productie werden niet beïnvloed. Alles bij elkaar genomen tonen deze gegevens aan dat de mitochondriale ademhaling van ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen met succes kan worden geanalyseerd met behulp van de extracellulaire fluxanalysator.
Figuur 1: Zuurstofverbruikssnelheid (OCR) gemeten tijdens titratie van remmers oligomycine en FCCP in ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen. (A) OCR tijdens stapsgewijze titratie van oligomycine van 0-1,25 μM eindconcentratie. (B) OCR tijdens stapsgewijze titratie van FCCP van 0-0,5 μM eindconcentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De invloed van celconcentratie op OCR-metingen in ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen. OCR-metingen van ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen met 200.000 of 400.000 cellen per put na injectie van (A) FCCP of (B) Oligomycine. (C) Basale ademhaling, maximale ademhaling, ATP-productie en reserve ademhalingscapaciteit van menselijke primaire T-cellen met behulp van 200.000 of 400.000 cellen per put. Vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Enkelvoudige of sequentiële injectie van mitochondriale modulatoren. (A) Representatieve OCR-metingen tijdens baseline en na injectie van oligomycine en FCCP (a,b), of antimycine A (c) als afzonderlijke injecties of als sequentiële injecties. (B) OCR-waarden vóór injectie (basale ademhaling) of na injectie van oligomycine of FCCP als enkelvoudige injecties of sequentiële injecties. (C) Schematische weergave van de injectie- en meetstrategie. Vertegenwoordiger van een onafhankelijk experiment Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verschillen in mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen. (A-D) Basale ademhaling, maximale ademhaling, ATP-productie en reserve ademhalingscapaciteit van menselijke primaire T-cellen gekweekt met IL-2 of IL-15 gedurende zeven dagen (n = 3). E) Representatieve percelen van (A-D), met injecties van Oligomycine of FCCP (a) of antimycine A (b). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Cytokine | [Voorraad] | Verdunningsfactor | [Definitief] | |
| Voorwaarde 1 | Il-2 | 3 x 106 U/ml | 30,000 | 100 U/ml |
| Voorwaarde 2 | Il-15 | 2 x 105 U/ml | 2,000 | 100 U/ml |
Tabel 1: Bereiding van cytokineculturen die worden gebruikt om metabole veranderingen in T-cellen te begeleiden.
| Oligomycine | Fccp | |||||
| Werkende sol. | Slotconc. | Vol. | Werkende sol. | Slotconc. | Vol. | |
| Poort A | 5,0 μM | 0,50 μM | 20 μL | 2,0 μM | 0,2 μM | 20 μL |
| Poort B | 3,0 μM | 0,75 μM | 22 μL | 1,30 μM | 0,3 μM | 22 μL |
| Poort C | 3,0 μM | 1,0 μM | 24 μl | 1,30 μM | 0,4 μM | 24 μl |
| Poort D | 3,0 μM | 1,25 μM | 27 μl | 1,30 μM | 0,5 μM | 27 μl |
Tabel 2: Strategie voor de bereiding van mitochondriale remmers en modulatoren. Voorbereidingsconcentraties, werkconcentraties en injectiestrategieën voor een optimalisatierun.
| Actie | Bijzonderheden | Meetgegevens |
| Basislijn | Nulmetingen | 3 metingen |
| Injectie | Poort A injectie | 3 metingen |
| Injectie | Poort B injectie | 3 metingen |
| Injectie | Poort C injectie | 3 metingen |
| Injectie | Poort D injectie | 3 metingen |
| Meten | Aanvullende metingen | Facultatief |
Tabel 3: Protocolontwerp van een optimalisatierun met titratie van mitochondriale remmers en modulatoren met behulp van 4 injecties met elk 3 metingen.
| Element van mitochondriale oxidatieve fosforylering | Uitleg | ||
| Basale ademhaling | Basale ademhaling is een basismaat voor de snelheid van zuurstof die door de gestimuleerde T-cellen wordt verbruikt vóór toevoeging van mitochondriale remmers. Het is een maat voor het zuurstofverbruik dat wordt gebruikt om te voldoen aan de cellulaire ATP-vraag als gevolg van mitochondriaal protonlek. Als zodanig biedt het een overzicht van de protonstroom die wordt gegenereerd om ATP-synthese en protonlek te leveren. Het is echter ook een maat die kan worden gewijzigd afhankelijk van de substraten die aanwezig zijn in de groeimedia, stimulatie van cellen voorafgaand aan de test en andere extrinsieke factoren. De basale ademhaling is daarom een maat die wordt gebruikt om twee of meer verschillende celtypen en / of verschillende behandelingen te vergelijken waarvan wordt aangenomen dat ze de cellulaire metabole toestand van de cellen beïnvloeden. Basale ademhaling wordt berekend als het verschil in OCR voordat mitochondriale modulatoren (oligomycine of FCCP) worden toegevoegd en na toevoeging van antimycine A |
||
| Maximale ademhaling | Deze maat is de maximale snelheid van zuurstof die kan worden verbruikt voor oxidatieve fosforylering. De snelheid van zuurstof die wordt verbruikt door oxidatieve fosforylering wordt bepaald door zowel het vermogen van de elektronentransportketen om protonen over het binnenste mitochondriale membraan te pompen, als het vermogen van het ATP-synthase om de protongradiënt te gebruiken om ATP uit ADP te fosforyleren. De snelheid van het ATP-synthase wordt beperkt door vrij ADP-substraat en daarmee door de algemene energetische toestand van de cel. Bij de behandeling van de cellen met de mitochondriale ontkoppelaar FCCP kunnen protonen vrijelijk terugtrappen over het binnenste mitochondriale membraan. Dit bootst een situatie na waarin de cellen een onverzadigde energievraag ervaren en de maximale ademhaling daarom een maat is voor de maximale snelheid van zuurstof die kan worden verbruikt door de elektronentransportketen. Maximale ademhaling wordt berekend als het verschil in OCR van cellen behandeld met FCCP en cellen behandeld met antimycine A |
||
| ATP omzet | ATP-gebonden ademhaling wordt gemeten als het verschil in OCR na remming van het ATP-synthase met behulp van oligomycine. De zuurstof die anders zou worden verbruikt voor fosforylering van ADP door oxidatieve fosforylering zal niet langer worden gebruikt als dit proces wordt gestopt. ATP-gebonden ademhaling is daarom relatief ten opzichte van ATP geproduceerd door oxidatieve fosforylering. Veranderingen in AT-gebonden ademhaling is een reactie van de mitochondriën op een veranderde ATP-vraag van de cel ATP-gebonden ademhaling wordt berekend als het verschil in OCR voordat mitochondriale modulatoren (oligomycine of FCCP) worden toegevoegd en na toevoeging van oligomycine |
||
| Reserve ademhalingscapaciteit | De reserve ademhalingscapaciteit is een maat voor een theoretische extra capaciteit om ATP te produceren als reactie op een verhoogde energetische vraag. Het wordt gedefinieerd als het verschil tussen basale ademhaling en maximale ademhaling. Veranderingen in de reserve ademhalingscapaciteit kunnen een indicator zijn van mitochondriale en celconditie en flexibiliteit. | ||
Tabel 4: Uitleg van de verschillende componenten van mitochondriale ademhaling die worden bestudeerd met behulp van de flux analyzer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gedetailleerde en correcte kwantificering van oxidatieve fosforylering is een onmisbaar hulpmiddel bij het beschrijven van de energietoestanden van T-cellen. De toestand van mitochondriale fitheid kan direct verband houden met T-celactivatiepotentieel, overleving en differentiatie1,5. Met dit protocol is het mogelijk om de verschillende eigenschappen van oxidatieve fosforylering te bepalen (zie tabel 4 voor een gedetailleerde uitleg). Nauwkeurige kwantificering van deze eigenschappen van oxidatieve fosforylering biedt een gedetailleerd inzicht in de energietoestanden van T-cellen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, moet echter grote zorg worden besteed aan het opzetten van het experiment.
In dit protocol worden de drie volgende optimalisatiestappen geadviseerd- eerst, optimalisatie van celaantallen. Het vermogen van een fluxanalysator om zuurstofconcentraties correct te meten volgt een sigmoïde curve; te kleine of te grote zuurstofveranderingen vallen buiten het werkingsinterval van de machine en worden daardoor niet goed gemeten. Dit vereist een optimalisatie van celaantallen die gedurende het hele experiment moet worden gebruikt. Als er te weinig cellen worden getest, zijn de veranderingen in zuurstofverbruik te laag om correct te kunnen worden gemeten. Als er te veel cellen zijn, bestaat er een risico op zuurstoftekort in de testmedia. Een eerste run wordt daarom aanbevolen, met celaantallen variërend van 100.000-400.000 cellen per put. Bij het uitzetten van het celgetal versus de basale ademhaling ligt het optimale celgetal in het lineaire bereik van de curve. Houd er bij het optimaliseren van de installatie rekening mee dat er een exponentieel verschil in mitochondriale activiteit kan zijn tussen rustende en geactiveerde cellen en daarom dienovereenkomstig moet worden geoptimaliseerd.
Ten tweede, titratie van inhibitorconcentraties. Bij de behandeling van de cellen met oligomycine en FCCP is het belangrijk om de optimale concentraties van de te gebruiken remmers te bepalen. Een te lage concentratie zal resulteren in een suboptimale remming en een onjuiste meting van de mitochondriale ademhaling. Het is gebruikelijk dat mensen de hoogste aanbevolen concentraties van de remmers gebruiken om ervoor te zorgen dat een volledige remming wordt verkregen. Dit is ook problematisch omdat te hoge concentraties van de remmers pleiotrope effecten kunnen hebben. Uncouplers zoals FCCP oefenen ook hun effecten uit op andere membranen dan de mitochondriale, wat resulteert in een reeks ongewenste effecten, waaronder plasmamembraandepolarisatie, mitochondriale remming en cytotoxiciteit. In dit protocol wordt titratie van oligomycine en FCCP gelijktijdig gedaan met celgetaloptimalisatie. Tijdens een optimalisatierun worden toenemende concentraties oligomycine of FCCP toegevoegd met behulp van de vier beschikbare substraatpoorten. In het resulterende OCR-diagram kan de optimale concentratie visueel worden bepaald als de concentratie waarbij de OCR een stabiel plateau bereikt. Zodra de concentratie oligomycine en FCCP zijn getitreerd, moeten deze concentraties gedurende het hele experiment worden gebruikt.
Ten derde, sequentiële versus enkelvoudige individuele toevoeging van remmers. Klassieke Seahorse-testen worden meestal uitgevoerd met de sequentiële toevoeging van het eerste oligomycine gevolgd door de toevoeging van FCCP. In T-cellen en andere gevoelige cellen kan een dergelijke sequentiële toevoeging resulteren in een onjuiste kwantificering van maximale ademhaling. Op hun beurt zullen de gemeten niveaus van reserve ademhalingscapaciteit lager rapporteren dan ze zijn. Ernstige voorbeelden hiervan zijn waarden van reserve ademhalingscapaciteit die negatief zijn. Dit is natuurlijk biologisch niet mogelijk en wordt veroorzaakt door een voorsensibilisatie van de mitochondriën door oligomycinebehandeling. In dit protocol wordt in plaats daarvan aanbevolen dat cellen alleen worden behandeld met oligomycine of FCCP (zie figuur 3C voor een illustratieve vergelijking).
Ten slotte wordt dit geoptimaliseerde protocol gebruikt om te laten zien hoe IL-15-aangevulde menselijke primaire T-celculturen duidelijk kunnen worden onderscheiden van IL-2-aangevulde cellen op basis van hun mitochondriale ademhaling. IL-15-gekweekte cellen bezitten een hogere maximale ademhaling en reserve ademhalingscapaciteit, een metabolische toestand gekoppeld aan geheugen T-cellen1,6. Deze observaties zijn in lijn met eerdere studies die IL-15 koppelen aan geheugen T-cel subsets8. Bovendien werd een verschil in basale ademhaling waargenomen, maar niet in ATP-productie in vergelijking met IL-2-gekweekte cellen. Dit geeft aan dat deze cellen hun glycolytische capaciteit gebruiken om te voldoen aan basale metabolische eisen, een route geassocieerd met meer gedifferentieerde cellen. Alles bij elkaar genomen is aangetoond dat een menselijk geheugen T-celmodel in vitro kan worden vastgesteld met behulp van IL-15-suppletie. Het gebruik van een IL-15-rijke omgeving om de ontwikkeling van geheugencellen te bevorderen is eerder aangetoond en ondersteunt de bevindingen verder8.
In deze methode zijn oligomycine, FCCP en antimycine A gebruikt om de eigenschappen van OxPhos te kwantificeren. Er bestaan andere verbindingen met vergelijkbare effecten, die mogelijk beter geschikt zouden zijn voor T-cellen. Een voorbeeld zou zijn om de ontkoppelaar BAM15 te gebruiken in plaats van FCCP om depolarisatie van het mitochondriale membraan te verminderen en cytotoxiciteit te voorkomen9. In deze methode zijn deze verbindingen niet in aanmerking genomen, omdat oligomycine, FCCP en antimycine A de afgelopen tien jaar de aanbevolen mitochondriale modulatoren zijn geweest voor Seahorse-experimenten. Het gebruik van deze verbindingen wordt daarom erkend door reviewers en andere onderzoekers die met OxPhos werken. Meer ervaren gebruikers van de Seahorse flux analyzer worden aangemoedigd om deze alternatieve verbindingen te gebruiken, maar het gebruik hiervan valt buiten het bestek van dit artikel.
Monitoring mitochondriale OxPhos is een essentieel hulpmiddel voor het begrijpen van de T-celfunctie en het verbeteren van kankerimmunotherapieën. Zoals eerder vermeld, bleken IL-15-geëxpandeerde cellen - met een minder gedifferentieerd geheugenfenotype - de reacties op CAR T-celtherapieën te verbeteren, omdat ze minder uitgeput waren en een verhoogde antitumoractiviteit hadden10. Dit geoptimaliseerde protocol zou een effectief hulpmiddel kunnen zijn om de kwaliteit van T-cellen in zowel preklinische als klinische omgevingen te bestuderen. Kortom, dit protocol implementeert stappen voor het optimaliseren van celaantallen en inhibitorconcentraties voor het gebruik van ex vivo gekweekte menselijke primaire T-cellen in metabole assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard en Anne Rahbech ontvingen subsidies van Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard ontving ook een subsidie van Børnecancerfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
