Summary

ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים בציטוקינים

Published: October 19, 2021
doi:

Summary

הסתגלות מטבולית היא בסיסית עבור תאי T כפי שהיא מכתיבה בידול, התמדה, וציטוטוקסיות. כאן, פרוטוקול ממוטב לניטור נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים ex vivo .

Abstract

במהלך ההפעלה, חילוף החומרים של תאי T מסתגל לשינויים המשפיעים על גורלם. עלייה בזרחן חמצוני מיטוכונדריאלי היא הכרחית להפעלת תאי T, והישרדותם של תאי T זיכרון T תלויה בשיפוץ מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, זה משפיע על התוצאה הקלינית ארוכת הטווח של אימונותרפיות סרטן. שינויים באיכות תאי T נחקרים לעתים קרובות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות סמני שטח ידועים ולא ישירות על ידי מצבם המטבולי. זהו פרוטוקול ממוטב למדידת נשימה מיטוכונדריאלית בזמן אמת של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי והציטוקינים IL-2 ו- IL-15, המשפיעים באופן שונה על חילוף החומרים של תאי T. הוכח כי המצב המטבולי של תאי T ניתן להבחין בבירור על ידי מדידת צריכת החמצן בעת עיכוב מתחמי מפתח במסלול המטבולי וכי הדיוק של מדידות אלה תלוי מאוד בריכוז מעכב אופטימלי ואסטרטגיית הזרקת מעכבים. פרוטוקול מתוקנן זה יסייע ליישם נשימה מיטוכונדריאלית כסטנדרט לכושר תאי T בניטור ולמידה של חיסונים לסרטן.

Introduction

התפתחות ותפקוד תקינים של תאי T חיוניים ליכולתה של מערכת החיסון לזהות ולהגיב לאנטיגנים. זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי (OxPhos) משתנה בהתאם למצב תא ה- T. תאי T נאיביים משתמשים בעיקר באוקספוס כדי לייצר ATP, בעוד שתאי T מופעלים עוברים מעבר מטבולי שבו הגליקוליזה הופכת דומיננטית1. לאחר שלב המשפיע, תת-קבוצה קטנה שנותרה של תאי T זיכרון חוזרת למצב מטבולי הנשלט על ידי OxPhos2,3. השינויים של OxPhos בצע את ההבחנה של תאי T עד כדי כך שאפילו תת קבוצות של תאי T ניתן להבדיל על ידי הספציפי שלהם הוא תכונות OxPhos1. לעומת זאת, OxPhos חשוב לתפקוד תאי T, ועיכוב של OxPhos הוכח לחסום התפשטות וייצור ציטוקינים של תאי T4. לכן, היכולת לכמת את המאפיינים של תא T OxPhos באופן מדויק וניתן לשחזור היא כלי רב עוצמה עבור כל מי שעובד עם תאי T.

בפרוטוקול זה, מאפיינים של תא T OxPhos נמדדים באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. תפקיד הליבה של מנתח זה הוא למדוד ברציפות את תכולת החמצן של מדיית הצמיחה של התאים שיש לנתח. חמצן שהוסר ממדיית הצמיחה הוא הניח להיות נלקח על ידי התאים. על ידי טיפול בתאים עם מגוון של מעכבי OxPhos או מכפילים, ירידה בספיגת חמצן קשורה לתפקוד המעכב או המווסת. לדוגמה, עיכוב של סינתאז ATP יוביל לספיגה תאית מופחתת של חמצן שאחרת היה משמש לייצור ATP על ידי זרחן חמצוני. ציוד אחר, כולל האלקטרודה קלארק ומכשיר Oroboros, מציע פונקציונליות דומה, ולכל מכשיר יש יתרונות וחסרונות שונים. מגוון רחב של סוגי תאים יכול לשמש למחקרים במכשירים אלה, אך סוג תא אחד מאתגר במיוחד הוא לימפוציטים T ראשוני אנושיים5. בשל גודלם הקטן, ex vivo הישרדות ירודה, ומאפיינים שאינם חסידים, תאי T ראשוניים אנושיים יכולים להיות מאתגרים ללמוד.

זהו פרוטוקול לחקר הנשימה המיטוכונדריאלית של תאי T ראשוניים אנושיים על ידי מנתח חוץ-תאי. הפרוטוקול מחולק לרוץ אופטימיזציה, שבו ריכוזים אופטימליים של מספר תא לכל באר, כמו גם את הריכוז האופטימלי של oligomycin ו FCCP, נקבעים. יתר על כן, ריצה Assay, שבו התנאים הממוטבים משמשים.

באמצעות PBMCs אנושיים שמקורם בדם ותרביות תאי T ראשיות ex vivo , פרוטוקול זה מדגים את החשיבות של ריכוז מעכב אופטימלי ואת הרלוונטיות של שימוש נפרד במקום הזרקה רציפה של מעכבי מיטוכונדריה בעת עבודה עם סוגי תאים רגישים. לבסוף, הוא הוכיח כי בדיקה זו יכולה לזהות היטב הבדלים עדינים בנשימה מיטוכונדריאלית על קיטוב עם ציטוקינים IL-2 ו IL-15.

Protocol

הניסויים בוצעו תחת ההנחיות של בית החולים הרלב ואזור הבירה של דנמרק. הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות הן עבור הפעלת מיטוב והן עבור הפעלת Assays. הוא כתוב בבירור בטקסט כאשר ההוראות הן עבור הפעלת מיטוב או הפעלת Assay. הפעל הפעלת מיטוב לפני שתמשיך בהפעלות Assay 1. בידוד חד-…

Representative Results

קביעה נכונה של תכונות OxPhos היא כלי הכרחי בעת לימוד תאי T. עם זאת, אם תנאי הבדיקה לא עברו אופטימיזציה, קיים סיכון משמעותי לתוצאות מטעות או שגויות. בפרוטוקול זה, יש דגש חזק על אופטימיזציה של מספר תא לכל באר וריכוזים של oligomycin ו FCCP לשמש. בהתקנה המתוארת, אוליגומיצין ו- FCCP מתווספים בהדרגה לאותה באר, מ…

Discussion

כימות מפורט ונכון של זרחן חמצוני הוא כלי הכרחי כאשר מתארים את מצבי האנרגיה של תאי T. מצב הכושר המיטוכונדריאלי יכול להיות קשור ישירות לפוטנציאל הפעלת תאי T, הישרדות ובידול1,5. עם פרוטוקול זה, ניתן לקבוע את המאפיינים השונים של זרחן חמצוני (ראה טבלה 4 להס?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

קספר מולגארד ואן רהבך קיבלו מענקים מטומרמסטר יורגן הולם og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. קספר מולגארדלסו קיבל מענק מבורנקנסורפונדן.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

References

  1. vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  2. Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
  3. vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
  4. Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  5. vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
  6. Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  7. Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
  8. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  9. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  10. Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).

Play Video

Cite This Article
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

View Video