Summary
La adaptación metabólica es fundamental para las células T, ya que dicta la diferenciación, la persistencia y la citotoxicidad. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para monitorear la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas ex vivo .
Abstract
Durante la activación, el metabolismo de las células T se adapta a los cambios que afectan su destino. Un aumento en la fosforilación oxidativa mitocondrial es indispensable para la activación de las células T, y la supervivencia de las células T de memoria depende de la remodelación mitocondrial. En consecuencia, esto afecta el resultado clínico a largo plazo de las inmunoterapias contra el cáncer. Los cambios en la calidad de las células T a menudo se estudian mediante citometría de flujo utilizando marcadores de superficie bien conocidos y no directamente por su estado metabólico. Este es un protocolo optimizado para medir la respiración mitocondrial en tiempo real de las células T humanas primarias utilizando un analizador de flujo extracelular y las citoquinas IL-2 e IL-15, que afectan de manera diferente el metabolismo de las células T. Se ha demostrado que el estado metabólico de las células T se puede distinguir claramente midiendo el consumo de oxígeno al inhibir complejos clave en la vía metabólica y que la precisión de estas mediciones depende en gran medida de la concentración óptima de inhibidores y la estrategia de inyección de inhibidores. Este protocolo estandarizado ayudará a implementar la respiración mitocondrial como un estándar para la aptitud de las células T en el monitoreo y estudio de las inmunoterapias contra el cáncer.
Introduction
El correcto desarrollo y función de las células T son esenciales para la capacidad del sistema inmunitario de reconocer y responder a los antígenos. La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) cambia según el estado de la célula T. Las células T naïve utilizan predominantemente OxPhos para producir ATP, mientras que las células T activadas experimentan una transición metabólica donde la glucólisis se vuelve dominante1. Después de la fase efectora, el pequeño subconjunto restante de células T de memoria vuelve a un estado metabólico dominado por OxPhos2,3. Los cambios de OxPhos siguen la diferenciación de las células T a tal grado que incluso subconjuntos de células T pueden diferenciarse por sus propiedades específicas de OxPhos1. Por el contrario, OxPhos es importante para la función de las células T, y se ha demostrado que la inhibición de OxPhos bloquea la proliferación y la producción de citoquinas de las células T4. Por lo tanto, la capacidad de cuantificar las propiedades de oxPhos de células T de una manera precisa y reproducible es una herramienta poderosa para cualquier persona que trabaje con células T.
En este protocolo, las propiedades de oxPhos de células T se miden utilizando un analizador de flujo extracelular. La función principal de este analizador es medir continuamente el contenido de oxígeno de los medios de crecimiento de las células a analizar. Se supone que el oxígeno eliminado de los medios de crecimiento es absorbido por las células. Al tratar las células con una variedad de inhibidores o modificadores de OxPhos, una caída en la absorción de oxígeno se asocia con la función inhibida o modulada. Por ejemplo, la inhibición de la ATP sintasa conducirá a una absorción celular reducida de oxígeno que de otro modo se utilizaría para producir ATP por fosforilación oxidativa. Otros equipos, incluidos el electrodo Clark y el instrumento Oroboros, ofrecen una funcionalidad similar, y cada instrumento tiene diferentes ventajas y deficiencias. Se puede utilizar una amplia gama de tipos de células para estudios en estos dispositivos, pero un tipo de célula particularmente desafiante son los linfocitos T primarios humanos5. Debido a su pequeño tamaño, pobre supervivencia ex vivo y propiedades no adherentes, las células T primarias humanas pueden ser difíciles de estudiar.
Este es un protocolo para estudiar la respiración mitocondrial de las células T primarias humanas mediante un analizador extracelular. El protocolo se divide en una ejecución de optimización, donde se determinan las concentraciones óptimas de número de células por pozo, así como la concentración óptima de oligomicina y FCCP. Además, se ejecuta un ensayo, donde se utilizan las condiciones optimizadas.
Utilizando PBMC humanos derivados de la sangre y cultivos de células T primarias ex vivo , este protocolo demuestra la importancia de una concentración óptima de inhibidores y la relevancia de usar una inyección separada en lugar de una inyección secuencial de inhibidores mitocondriales cuando se trabaja con tipos de células sensibles. Finalmente, está demostrado que este ensayo puede detectar de manera robusta diferencias sutiles en la respiración mitocondrial tras la polarización con las citoquinas IL-2 e IL-15.
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Protocol
Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del Hospital Herlev y la Región Capital de Dinamarca.
Nota : este protocolo contiene instrucciones para una ejecución de optimización y una ejecución de ensayos. Está claramente escrito en el texto cuando las instrucciones son para una ejecución de optimización o una ejecución de ensayo. Ejecutar una ejecución de optimización antes de continuar con las ejecuciones de assay
1. Aislamiento mononuclear de sangre periférica humana (PBMC) de abrigos buffy
- Aislamiento PBMC
- Recolecte abrigos buffy de la institución apropiada (recolectados en bolsas de recolección de sangre). Los abrigos Buffy se originan de donantes sanos. Excluya a los donantes que hayan usado analgésicos recientemente.
- Rocíe la bolsa de recolección de sangre que contiene la capa buffy con etanol al 70% antes de transferirla a un gabinete de flujo laminar. Utilice siempre técnicas estériles y hardware estéril para todos los pasos
NOTA: Asegurar que se obtengan las autorizaciones correctas para el manejo de muestras de sangre humana. - Transfiera la sangre a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
- Diluya la sangre al menos al 10% con RPMI 1640 no suplementado.
- Vierta 20 ml del medio de gradiente de densidad preferido en un tubo centrífugo de 50 ml.
- Aspire 25 ml de la sangre diluida en una pipeta serológica. Ajuste el controlador de pipeta eléctrica a la velocidad más baja.
- Sostenga el tubo con medio de gradiente de densidad en un ángulo de 45° y apoye la punta de la pipeta serológica en el lado interior del tubo centrífugo de 50 ml. Libere lentamente 25 ml de la sangre diluida de la pipeta serológica.
- Asegúrese de que la sangre diluida y el medio de gradiente de densidad no se mezclen. Asegúrese de que la sangre diluida descanse sobre el medio de gradiente de densidad.
- Repita esto con tubos medios de gradiente de densidad posteriores hasta que se procese toda la sangre diluida.
- Mueva cuidadosamente los tubos a una centrífuga y centrífuga a 1000 x g durante 30 minutos en un rotor oscilante a temperatura ambiente (RT). Asegúrese de que la aceleración y la rotura sean mínimas.
NOTA: Después de la centrifugación, varias capas deben ser visibles. La capa superior, clara de rosa a naranja consiste en el plasma sanguíneo y las plaquetas. La capa blanca media consiste en los PBMC seguidos de una capa transparente que consiste en el medio de gradiente de densidad, y finalmente una capa roja oscura en la parte inferior con glóbulos rojos. - Usando una pipeta Pasteur estéril, aspire cuidadosamente la capa blanca que contiene PBMC a un tubo centrífugo de 50 ml.
NOTA: Asegúrese de no transferir el medio de gradiente de densidad, ya que esto afectará la purificación aguas abajo. El exceso de plasma no afectará los resultados. - Agrupe todos los PBMC recolectados en el mismo tubo centrífugo de 50 ml y recargue hasta 50 ml con RPMI 1640.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a RT (realice los pasos de centrifugación restantes en este ajuste a menos que se especifique lo contrario).
- Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 30 mL de RPMI 1640. Cuente las células usando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
- Para la criopreservación, resuspenda un máximo de 30 millones de células por 1 ml de medio de congelación.
- Transfiera las células a criotubos y congele hasta -80 °C utilizando un recipiente de congelación de velocidad controlada (-1 °C por minuto). Para el almacenamiento a largo plazo, mueva los PBMC a -140 °C.
NOTA: Limite el tiempo que las celdas están en el medio de congelación en RT. En RT, DMSO es altamente tóxico para las células.
2. Cultivo de linfocitos T primarios humanos activados
- Descongelación de las células (Día 1)
- Precaliente 10 ml de RPMI 1640 por muestra a alrededor de 37 °C.
- Tome el número deseado de ampollas celulares y guárdelas temporalmente en hielo seco.
- Resuspend las células congeladas en 10 mL de RPMI 1640 precalentado.
- Centrifugar las células durante 5 min a 500 x g en RT.
- Deseche el sobrenadante y lave las células de nuevo resuspiendo en 10 ml de RPMI 1640 y centrifugando como se describe en 2.1.4.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda las células a 2 x 106 células por ml de X-VIVO 15 medio + 5% de suero humano (en adelante: medio de células T).
- Placa 2 ml de las células por pozo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de CO2.
- Activación de las células (Día 0)
- Lave las perlas CD3/CD28 transfiriendo 12,5 μL de perlas por 1 millón de células a un tubo de microcentrífuga. Añadir 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de perlas.
NOTA: Es importante vórtice el vial de perlas antes de su uso. - Coloque el tubo de la microcentrífuga en un imán adecuado durante 1 min.
- Deseche el tampón y vuelva a suspender las perlas en el volumen original del medio de células T (12,5 μL de medio de células T por 12,5 μL del volumen original de perlas).
- Añadir 12,5 μL de perlas por millón de células correspondiente a una proporción de 1:2 (perlas: células).
- Divida las células en dos condiciones con alrededor de 5 millones de células en cada una.
- Agregue el volumen correcto de citoquinas a las condiciones como se menciona en la Tabla 1.
- Incubar las células durante 3 días a 37 °C y 5% de CO2.
- Lave las perlas CD3/CD28 transfiriendo 12,5 μL de perlas por 1 millón de células a un tubo de microcentrífuga. Añadir 12,5 μL de PBS por 12,5 μL de perlas.
- Cultivo de células (Día 3 y 5)
- Resuspend las células y divídelas transfiriendo la mitad del volumen de cada pozo a un nuevo pozo. Agregue el mismo volumen de medio de células T frescas a cada pocillo.
- Agregue nuevas citoquinas a cada afección como se menciona en la Tabla 1.
3. Ensayo de flujo extracelular
- Hidratación del cartucho del sensor (Día 0)
- Desembala el cartucho del sensor y retira cuidadosamente el cartucho del sensor de la placa de utilidad.
- Coloque el cartucho del sensor boca abajo, teniendo cuidado de no tocar las sondas del sensor.
- Llene la placa de utilidad con 200 μL de calibrante (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y reemplace cuidadosamente el cartucho del sensor de nuevo en la placa de utilidad.
- Alternativamente, para eliminar cualquier formación de burbujas, incube el cartucho del sensor en agua ultrapura estéril durante la noche y reemplácelo con un calibrante precalentado en la mañana del ensayo.
- Incube la placa del cartucho del sensor a 37 °C en un armario calefactor no regulado por CO2 durante la noche.
NOTA: Es muy importante utilizar un gabinete no regulado por CO2 , ya que el exceso de CO2 influirá en el cartucho del sensor. Asegúrese de que el analizador de flujo (consulte la Tabla de materiales para obtener más información) esté encendido al menos un día antes de su uso para permitir que se caliente hasta 37 °C.
- Recubrimiento celular y preparación de inhibidores mitocondriales (Día 1)
- Preparar una solución de recubrimiento (ver Tabla de Materiales) que contenga NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) y NaOH (1.0 M, 24 μL).
NOTA: La solución de recubrimiento siempre debe hacerse y usarse fresca. - Abra una placa de cultivo celular XF fresca y agregue 12 μL de la solución de recubrimiento recién preparada a cada pozo. Asegurar una distribución uniforme de la solución de recubrimiento en el fondo de todos los pozos.
- Incubar la placa en RT con la tapa puesta durante 30 min y desechar la solución líquida restante de todos los pocillos.
- Lave la placa con 200 μL de agua estéril y deseche el líquido.
- Lavar la placa con 200 μL de PBS estéril de grado de cultivo celular y desechar el líquido.
- Deje la placa en RT y déjela secar durante al menos 30 min.
- Preparar una solución de recubrimiento (ver Tabla de Materiales) que contenga NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) y NaOH (1.0 M, 24 μL).
- Placa T de células en la placa de cultivo de células XF (Día 1)
- Prepare 50 ml de medios de ensayo mezclando medios XF RPMI adecuados con glucosa, piruvato y glutamina de acuerdo con la configuración experimental (niveles recomendados: 4 mM de glucosa, 1 mM de piruvato y 3 mM de glutamina).
- Calentar a 37 °C en una incubadora no regulada por CO2 y fijar el pH en 7,4. Asegúrese de que hay suficientes medios para el recubrimiento de las células y la preparación de soluciones de oligomicina y FCCP (sección 3.4).
- Diseñe un diseño de placa con un número creciente de celdas por pozo para la ejecución de optimización o la ejecución de ensayo. Use cuatro 4 pocillos, llenos de medios e inyectados con medios, para mediciones de fondo.
- Cuente las células T preparadas en la sección 2.3 (por el método preferido) y canalice el número correcto de células a cada pocillo de la placa de cultivo celular XF recubierta con la solución de recubrimiento, de acuerdo con el diseño de la placa.
NOTA: El volumen final de cada pozo puede variar, pero debe ser suficiente para cubrir el fondo del pozo. - Centrifugar la placa de cultivo celular XF a 1000 x g en RT durante 10 min para adherir la célula T a la superficie recubierta.
- Lave las células con 200 μL de medios de ensayo, deseche los medios y agregue 180 μL de medios de ensayo.
NOTA: Inspeccione visualmente los pozos utilizando un microscopio de luz invertida para asegurarse de que las células estén unidas y distribuidas uniformemente a través de la superficie del pozo. - Incubar la placa de cultivo celular XF en el armario calefactor no regulado por CO2 durante 30 min para asegurar que la temperatura de la placa sea de 37 °C.
- Cartucho de sensor de carga con oligomicina y FCCP para la ejecución de optimización (Día 1)
NOTA: Si las concentraciones de oligomicina y FCCP ya estaban optimizadas, continúe en la sección 3.5.- Preparar soluciones de trabajo de oligomicina y FCCP en medios de ensayo (preparados en la etapa 3.3.1) como se describe en las etapas 3.4.2 y 3.4.3.
- Soluciones de trabajo de oligomicina: preparar una solución de 5 μM (2 ml de medios de ensayo + 10 μL de 1 mM de cepa de oligomicina) y una solución de 3 μM (8 ml de medios de ensayo + 24 μL de existencias de oligomicina de 1 mM).
- Solución de trabajo FCCP: Preparar una solución de 2 μM (2 ml de medios de ensayo + 13,2 μL de 300 μM de material FCCP) y una solución de 1,3 μM (8 ml de medios de ensayo + 34,6 μL de 300 μM de material FCCP)
- Cargue las soluciones de trabajo de oligomicina o FCCP en los puertos de inyección del cartucho del sensor (Tabla 2).
NOTA. Es importante que ningún puerto de inyección contenga solo aire. Si, por alguna razón, no se utilizan todos los puertos de inyección, los puertos vacíos deben llenarse con medios de ensayo. - Golpee suavemente los bordes de la placa sobre la mesa para eliminar las burbujas potenciales en los puertos de inyección.
- Cartucho de sensor de carga con oligomicina, FCCP y antimicina A para la ejecución del ensayo (Día 1)
- Preparar soluciones de oligomicina, FCCP en medios de ensayo (preparados en el paso 3.3.1) de acuerdo con las concentraciones óptimas identificadas en una ejecución de optimización anterior. Además, prepare una solución de antimicina A de 20 μM.
- Cargue 20 μL de oligomicina o FCCP en el puerto de inyección A del cartucho del sensor de acuerdo con el diseño de la placa. Añadir 22 μL de 20 μM de antimicina A al puerto de inyección B de todos los pocillos. La concentración resultante de antimicina A una vez inyectada en el pozo será de 2 μM.
- Configuración del protocolo experimental en el software analizador Flux.
- Asigne los grupos y el mapa de placas para cada condición por diseño de placa.
- Diseñar el protocolo según la estrategia de inyección (Tabla 3 y Figura 1).
NOTA: Al ejecutar ejecuciones de ensayo, se puede omitir la inyección C y D. - Guarde la configuración del ensayo, complete la información necesaria para incluirla en el ensayo y pulse Inicio.
- El analizador de flujo solicitará el cartucho del sensor preparado en la sección 3.5. Retire la tapa e inserte el cartucho del sensor según las indicaciones del analizador.
NOTA: El ensayo calibrará y comprobará los sensores indicados por las marcas de verificación. Después de una calibración exitosa, el analizador solicitará la placa de cultivo celular XF preparada en la sección 3.3. La placa de utilidad se expulsa del analizador y se reemplaza con la placa de cultivo celular XF para iniciar el ensayo.
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Representative Results
Una correcta determinación de las propiedades de OxPhos es una herramienta indispensable a la hora de estudiar las células T. Sin embargo, si las condiciones del ensayo no se han optimizado, existe un riesgo sustancial de resultados engañosos o erróneos. En este protocolo, hay un fuerte enfoque en la optimización del número de células por pozo y las concentraciones de oligomicina y FCCP a utilizar. En la configuración descrita, la oligomicina y la FCCP se agregan incrementalmente al mismo pozo, aumentando la concentración de los moduladores mitocondriales. La concentración óptima de oligomicina y FCCP se puede determinar a partir de las curvas OCR resultantes de los pozos como la concentración donde se alcanza una meseta.
En la carrera representativa, la oligomicina se agrega en una concentración creciente e inhibe la ATP sintasa (Complejo V de la cadena de transporte de electrones), lo que resulta en una disminución de la respiración mitocondrial. Una meseta en OCR se alcanza después de que la concentración acumulativa de los pozos alcanzó 1 μM. A partir de esta concentración y del aumento de las concentraciones, el OCR no se redujo aún más (Figura 1A). Para los pozos tratados con una concentración incremental del desacoplador FCCP, los niveles de OCR aumentaron según lo esperado hasta alcanzar una meseta después de que se agregaron 0,2 μM de FCCP, lo que indica que a esta concentración se obtuvo un desacoplamiento completo (Figura 1B). Una optimización de las células chapadas por pozo es importante para un ensayo correcto y reproducible. Si el número de células utilizadas es demasiado bajo, entonces el nivel de oxígeno eliminado de los medios de ensayo por las células es demasiado bajo para ser medido correctamente por el analizador. Por otro lado, si el número de células por pozo es demasiado alto, el consumo de oxígeno de las células puede llegar a ser tan alto que el sistema no puede reponer los niveles de oxígeno de los medios de ensayo después de cada medición, lo que lleva a un ambiente cada vez más hipóxico y a una caracterización errónea de OxPhos.
En la tirada representativa, las células se sembraron a una densidad de 200.000 y 400.000 células por pozo (Figura 2A-C). Para una ejecución con 200.000 celdas, el OCR inicial es aproximadamente la mitad de una ejecución con 400.000 células por pozo. Para el tratamiento con FCCP, el OCR máximo es de 61,6 pmol/min (200.000 células) frente a 190,4 pmol/min (400.000 células). Después del tratamiento con oligomicina, el OCR en ejecución con 200,000 células colapsa en OCR de un solo dígito (6.4 pmol / min). Esto es inferior al OCR de la carrera, con 400.000 células por pozo tratado con oligomicina (25,8 pmol/min, respectivamente).
Por lo tanto, a partir de la ejecución de optimización, está claro que se requirió un número de células de 400,000 células por pozo para futuros ensayos, utilizando 1 μM de oligomicina y 0.2 μM de FCCP. En la configuración clásica recomendada por el fabricante, la oligomicina y la FCCP se agregan secuencialmente con la adición final de antimicina A. Para las células T, este no es el enfoque óptimo, ya que se puede ver que el tratamiento con oligomicina limita el desacoplamiento después del tratamiento con FCCP (Figura 3A, B). En este método presentado, se recomienda ejecutar cada condición en pozos duplicados y tratar un pozo con oligomicina y el otro con FCCP, con una adición final de antimicina A para ambos pozos. Mediante el uso de este enfoque, el tratamiento con oligomicina no afecta a la OCR después del tratamiento con FCCP. Este enfoque permite la determinación de las mismas propiedades mitocondriales que la configuración clásica, donde los fármacos se añaden en secuencia (Figura 3C)
Finalmente, se investigó si los efectos de las citoquinas IL-2 e IL-15 podían diferenciarse sobre el metabolismo de las células T primarias humanas cultivadas ex vivo. De hecho, las células cultivadas con IL-15 poseían una mayor respiración máxima y capacidad respiratoria excedentaria, como se ha demostrado anteriormente1 (Figura 4A-E). La respiración basal y la producción de ATP no se vieron afectadas. Tomados en conjunto, estos datos muestran que la respiración mitocondrial de las células T primarias humanas cultivadas ex vivo se puede analizar con éxito utilizando el analizador de flujo extracelular.
Figura 1: Tasa de consumo de oxígeno (OCR) medida durante la titulación de los inhibidores de oligomicina y FCCP en células T primarias humanas cultivadas ex vivo . (A) OCR durante la titulación gradual de oligomicina de 0-1,25 μM de concentración final. (B) OCR durante la titulación gradual de FCCP de 0-0.5 μM concentración final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La influencia de la concentración celular en las mediciones de OCR en células T primarias humanas cultivadas ex vivo . Mediciones de OCR de células T primarias humanas cultivadas ex vivo con 200,000 o 400,000 células por pozo después de la inyección de (A) FCCP o (B) Oligomicina. (C) Respiración basal, respiración máxima, producción de ATP y capacidad respiratoria excedente de células T primarias humanas utilizando 200,000 o 400,000 células por pozo. Representante de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección única o secuencial de moduladores mitocondriales. (A) Mediciones representativas de OCR durante la línea de base y después de la inyección de oligomicina y FCCP (a, b) o antimicina A (c) como inyecciones individuales individuales o como inyecciones secuenciales. (B) Valores de OCR antes de la inyección (respiración basal) o después de la inyección de oligomicina o FCCP como inyecciones individuales o inyecciones secuenciales. (C) Representación esquemática de la estrategia de inyección y medición. Representante de un experimento independiente Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diferencias en la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas. (A-D) Respiración basal, respiración máxima, producción de ATP y capacidad respiratoria excedentaria de células T primarias humanas cultivadas con IL-2 o IL-15 durante siete días (n = 3). (E) Parcelas representativas de (A-D), con inyecciones de Oligomicina o FCCP (a) o antimicina A (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Citoquinas | [Stock] | Factor de dilución | [Final] | |
| Condición 1 | IL-2 | 3 x 106 U/ml | 30,000 | 100 U/ml |
| Condición 2 | IL-15 | 2 x 105 U/ml | 2,000 | 100 U/ml |
Tabla 1: Preparación de cultivos de citoquinas utilizados para guiar los cambios metabólicos en las células T.
| Oligomicina | FCCP | |||||
| Sol de trabajo. | Final conc. | Vol. | Sol de trabajo. | Final conc. | Vol. | |
| Puerto A | 5,0 μM | 0,50 μM | 20 μL | 2,0 μM | 0,2 μM | 20 μL |
| Puerto B | 3,0 μM | 0,75 μM | 22 μL | 1,30 μM | 0,3 μM | 22 μL |
| Puerto C | 3,0 μM | 1,0 μM | 24 μL | 1,30 μM | 0,4 μM | 24 μL |
| Puerto D | 3,0 μM | 1,25 μM | 27 μL | 1,30 μM | 0,5 μM | 27 μL |
Tabla 2: Estrategia para la preparación de inhibidores y moduladores mitocondriales. Concentraciones de preparación, concentraciones de trabajo y estrategias de inyección para una ejecución de optimización.
| Acción | Detalles | Detalles de la medición |
| Referencia | Mediciones de referencia | 3 medidas |
| Inyección | Inyección en el puerto A | 3 medidas |
| Inyección | Inyección en puerto B | 3 medidas |
| Inyección | Inyección en puerto C | 3 medidas |
| Inyección | Inyección en el puerto D | 3 medidas |
| Medir | Medidas adicionales | Opcional |
Tabla 3: Diseño de protocolo de una ejecución de optimización con titulación de inhibidores y moduladores mitocondriales mediante 4 inyecciones con 3 mediciones en cada una.
| Elemento de fosforilación oxidativa mitocondrial | Explicación | ||
| Respiración basal | La respiración basal es una medida basal de la tasa de oxígeno consumido por las células T estimuladas antes de la adición de inhibidores mitocondriales. Es una medida del consumo de oxígeno utilizado para satisfacer la demanda celular de ATP resultante de la fuga de protones mitocondriales. Como tal, proporciona una visión general de la corriente de protones generada para suministrar síntesis de ATP y fuga de protones. Sin embargo, también es una medida que puede ser alterada dependiendo de los sustratos presentes en los medios de crecimiento, la estimulación de las células antes del ensayo y otros factores extrínsecos. La respiración basal es, por lo tanto, una medida utilizada para comparar dos o más tipos de células diferentes y / o diferentes tratamientos que se cree que afectan el estado metabólico celular de las células. La respiración basal se calcula como la diferencia en OCR antes de agregar cualquier modulador mitocondrial (oligomicina o FCCP) y después de agregar antimicina A |
||
| Respiración máxima | Esta medida es la tasa máxima de oxígeno que se puede consumir para la fosforilación oxidativa. La tasa de oxígeno consumido por la fosforilación oxidativa está determinada tanto por la capacidad de la cadena de transporte de electrones para bombear protones a través de la membrana mitocondrial interna, como por la capacidad de la ATP sintasa para utilizar el gradiente de protones para fosforilar ATP de ADP. La velocidad de la ATP sintasa está limitada por el sustrato ADP libre y, por lo tanto, por el estado energético general de la célula. Al tratar las células con el desacoplador mitocondrial FCCP, los protones pueden atravesar libremente la membrana mitocondrial interna. Esto imita una situación en la que las células experimentan una demanda de energía insaturable y, por lo tanto, la respiración máxima es una medida de la tasa máxima de oxígeno que puede consumir la cadena de transporte de electrones. La respiración máxima se calcula como la diferencia en el OCR de las células tratadas con FCCP y las células tratadas con antimicina A |
||
| Rotación de ATP | La respiración ligada al ATP se mide como la diferencia en el OCR después de la inhibición de la ATP sintasa utilizando oligomicina. El oxígeno que de otro modo se consumiría para la fosforilación de ADP por fosforilación oxidativa ya no se utilizará a medida que se detenga este proceso. Por lo tanto, la respiración ligada al ATP es relativa al ATP producido por la fosforilación oxidativa. Los cambios en la respiración ligada a AT es una respuesta de las mitocondrias a una demanda alterada de ATP de la célula La respiración ligada al ATP se calcula como la diferencia en OCR antes de agregar cualquier modulador mitocondrial (oligomicina o FCCP) y después de agregar oligomicina |
||
| Capacidad respiratoria excedentaria | La capacidad respiratoria excedentaria es una medida de una capacidad adicional teórica para producir ATP como respuesta a una mayor demanda energética. Se define como la diferencia entre la respiración basal y la respiración máxima. Los cambios en la capacidad respiratoria sobrante pueden ser un indicador de la aptitud y flexibilidad mitocondrial y celular. | ||
Tabla 4: Explicación de los diversos componentes de la respiración mitocondrial que se estudian utilizando el analizador de flujo
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Discussion
La cuantificación detallada y correcta de la fosforilación oxidativa es una herramienta indispensable a la hora de describir los estados energéticos de las células T. El estado de aptitud mitocondrial puede estar directamente relacionado con el potencial de activación, supervivencia y diferenciación de las células T1,5. Con este protocolo, es posible determinar las diversas propiedades de la fosforilación oxidativa (ver Tabla 4 para una explicación detallada). La cuantificación precisa de estas propiedades de la fosforilación oxidativa ofrece una visión detallada de los estados de energía de las células T. Sin embargo, para obtener resultados confiables, se debe tener mucho cuidado al configurar el experimento.
En este protocolo, se aconsejan los tres pasos de optimización siguientes: primero, la optimización de los números de celda. La capacidad de un analizador de flujo para medir correctamente las concentraciones de oxígeno sigue una curva sigmoide; los cambios en el oxígeno que son demasiado pequeños o demasiado grandes caerán fuera del intervalo de funcionamiento de la máquina y, por lo tanto, no se medirán correctamente. Esto requiere una optimización de los números de células para ser utilizados a lo largo de todo el experimento. Si se analizan muy pocas células, los cambios en el consumo de oxígeno son demasiado bajos para ser medidos correctamente. Si hay demasiadas células, existe el riesgo de agotamiento del oxígeno en los medios de ensayo. Por lo tanto, se recomienda una ejecución inicial, con números de células que oscilan entre 100,000 y 400,000 células por pozo. Al trazar el número de células frente a la respiración basal, el recuento óptimo de células estará en el rango lineal de la curva. Al optimizar la configuración, tenga en cuenta que puede haber una diferencia exponencial en la actividad mitocondrial entre las células en reposo y las activadas, y por lo tanto debe optimizarse en consecuencia.
En segundo lugar, la titulación de las concentraciones de inhibidores. Al tratar las células con oligomicina y FCCP, es importante identificar las concentraciones óptimas de los inhibidores que se utilizarán. Una concentración demasiado baja resultará en una inhibición subóptima y una medición incorrecta de la respiración mitocondrial. Es común que las personas usen las concentraciones más altas recomendadas de los inhibidores para garantizar que se obtenga una inhibición completa. Esto también es problemático ya que las concentraciones demasiado altas de los inhibidores pueden tener efectos pleiotrópicos. Los desacopladores como FCCP también ejercen sus efectos sobre membranas distintas de las mitocondriales, lo que resulta en una serie de efectos no deseados, incluida la despolarización de la membrana plasmática, la inhibición mitocondrial y la citotoxicidad. En este protocolo, la titulación de oligomicina y FCCP se realiza simultáneamente con la optimización del número de células. Durante una ejecución de optimización, se agregan concentraciones crecientes de oligomicina o FCCP utilizando los cuatro puertos de sustrato disponibles. En el diagrama de OCR resultante, la concentración óptima se puede determinar visualmente como la concentración a la que el OCR alcanza una meseta constante. Una vez que se ha titulado la concentración de oligomicina y FCCP, estas concentraciones se utilizarán durante todo el experimento.
En tercer lugar, la adición secuencial versus individual de inhibidores. Los ensayos clásicos de caballitos de mar se realizan típicamente con la adición secuencial de la primera oligomicina seguida de la adición de FCCP. En las células T y otras células sensibles, tal adición secuencial puede resultar en una cuantificación errónea de la respiración máxima. A su vez, los niveles medidos de capacidad respiratoria excedentaria reportarán menores de lo que son. Ejemplos graves de esto incluyen valores de capacidad respiratoria excedentaria que son negativos. Esto, por supuesto, no es biológicamente posible y es causado por una presensibilización de las mitocondrias mediante el tratamiento con oligomicina. En este protocolo, en cambio, se recomienda que las células solo se traten con oligomicina o FCCP (consulte la Figura 3C para una comparación ilustrativa).
Finalmente, este protocolo optimizado se utiliza para mostrar cómo los cultivos de células T primarias humanas suplementadas con IL-15 se pueden distinguir claramente de las células suplementadas con IL-2 en función de su respiración mitocondrial. Las células cultivadas con IL-15 poseen mayor respiración máxima y capacidad respiratoria excedentaria, un estado metabólico ligado a las células T de memoria1,6. Estas observaciones están en línea con estudios previos que vinculan la IL-15 con subconjuntos de células T de memoria8. Además, se observó una diferencia en la respiración basal pero no en la producción de ATP en comparación con las células cultivadas con IL-2. Esto indica que estas células utilizan su capacidad glucolítica para cumplir con las demandas metabólicas basales, una vía asociada con células más diferenciadas. En conjunto, se demuestra que un modelo de células T de memoria humana se puede establecer in vitro mediante el uso de suplementos de IL-15. El uso de un entorno rico en IL-15 para promover el desarrollo de células de memoria se ha demostrado previamente y apoya aún más los hallazgos8.
En este método, se han utilizado oligomicina, FCCP y antimicina A para cuantificar las propiedades de OxPhos. Existen otros compuestos con efectos similares, que potencialmente serían más adecuados para las células T. Un ejemplo sería utilizar el desacoplador BAM15 en lugar de FCCP para disminuir la despolarización de la membrana mitocondrial y evitar la citotoxicidad9. En este método, estos compuestos no se han considerado, ya que la oligomicina, la FCCP y la antimicina A han sido los moduladores mitocondriales recomendados para los experimentos de Seahorse durante la última década. Por lo tanto, el uso de estos compuestos es reconocido por los revisores y otros investigadores que trabajan con OxPhos. Se alienta a los usuarios más experimentados del analizador de flujo Seahorse a usar estos compuestos alternativos, pero el uso de estos está fuera del alcance de este documento.
El monitoreo de OxPhos mitocondrial es una herramienta esencial para comprender la función de las células T y mejorar las inmunoterapias contra el cáncer. Como se mencionó anteriormente, se demostró que las células expandidas de IL-15, con un fenotipo de memoria menos diferenciado, mejoran las respuestas a las terapias con células T con CAR, ya que estaban menos agotadas y tenían una mayor actividad antitumoral10. Este protocolo optimizado podría ser una herramienta eficaz para estudiar la calidad de las células T tanto en entornos preclínicos como clínicos. En conclusión, este protocolo implementa pasos para optimizar el número de células y las concentraciones de inhibidores para el uso de células T primarias humanas cultivadas ex vivo en ensayos metabólicos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard y Anne Rahbech recibieron subvenciones de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard también recibió una subvención de Børnecancerfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
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