Summary

Monitoreo en tiempo real de la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas

Published: October 19, 2021
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Summary

La adaptación metabólica es fundamental para las células T, ya que dicta la diferenciación, la persistencia y la citotoxicidad. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para monitorear la respiración mitocondrial en células T primarias humanas diferenciadas por citoquinas ex vivo .

Abstract

Durante la activación, el metabolismo de las células T se adapta a los cambios que afectan su destino. Un aumento en la fosforilación oxidativa mitocondrial es indispensable para la activación de las células T, y la supervivencia de las células T de memoria depende de la remodelación mitocondrial. En consecuencia, esto afecta el resultado clínico a largo plazo de las inmunoterapias contra el cáncer. Los cambios en la calidad de las células T a menudo se estudian mediante citometría de flujo utilizando marcadores de superficie bien conocidos y no directamente por su estado metabólico. Este es un protocolo optimizado para medir la respiración mitocondrial en tiempo real de las células T humanas primarias utilizando un analizador de flujo extracelular y las citoquinas IL-2 e IL-15, que afectan de manera diferente el metabolismo de las células T. Se ha demostrado que el estado metabólico de las células T se puede distinguir claramente midiendo el consumo de oxígeno al inhibir complejos clave en la vía metabólica y que la precisión de estas mediciones depende en gran medida de la concentración óptima de inhibidores y la estrategia de inyección de inhibidores. Este protocolo estandarizado ayudará a implementar la respiración mitocondrial como un estándar para la aptitud de las células T en el monitoreo y estudio de las inmunoterapias contra el cáncer.

Introduction

El correcto desarrollo y función de las células T son esenciales para la capacidad del sistema inmunitario de reconocer y responder a los antígenos. La fosforilación oxidativa mitocondrial (OxPhos) cambia según el estado de la célula T. Las células T naïve utilizan predominantemente OxPhos para producir ATP, mientras que las células T activadas experimentan una transición metabólica donde la glucólisis se vuelve dominante1. Después de la fase efectora, el pequeño subconjunto restante de células T de memoria vuelve a un estado metabólico dominado por OxPhos2,3. Los cambios de OxPhos siguen la diferenciación de las células T a tal grado que incluso subconjuntos de células T pueden diferenciarse por sus propiedades específicas de OxPhos1. Por el contrario, OxPhos es importante para la función de las células T, y se ha demostrado que la inhibición de OxPhos bloquea la proliferación y la producción de citoquinas de las células T4. Por lo tanto, la capacidad de cuantificar las propiedades de oxPhos de células T de una manera precisa y reproducible es una herramienta poderosa para cualquier persona que trabaje con células T.

En este protocolo, las propiedades de oxPhos de células T se miden utilizando un analizador de flujo extracelular. La función principal de este analizador es medir continuamente el contenido de oxígeno de los medios de crecimiento de las células a analizar. Se supone que el oxígeno eliminado de los medios de crecimiento es absorbido por las células. Al tratar las células con una variedad de inhibidores o modificadores de OxPhos, una caída en la absorción de oxígeno se asocia con la función inhibida o modulada. Por ejemplo, la inhibición de la ATP sintasa conducirá a una absorción celular reducida de oxígeno que de otro modo se utilizaría para producir ATP por fosforilación oxidativa. Otros equipos, incluidos el electrodo Clark y el instrumento Oroboros, ofrecen una funcionalidad similar, y cada instrumento tiene diferentes ventajas y deficiencias. Se puede utilizar una amplia gama de tipos de células para estudios en estos dispositivos, pero un tipo de célula particularmente desafiante son los linfocitos T primarios humanos5. Debido a su pequeño tamaño, pobre supervivencia ex vivo y propiedades no adherentes, las células T primarias humanas pueden ser difíciles de estudiar.

Este es un protocolo para estudiar la respiración mitocondrial de las células T primarias humanas mediante un analizador extracelular. El protocolo se divide en una ejecución de optimización, donde se determinan las concentraciones óptimas de número de células por pozo, así como la concentración óptima de oligomicina y FCCP. Además, se ejecuta un ensayo, donde se utilizan las condiciones optimizadas.

Utilizando PBMC humanos derivados de la sangre y cultivos de células T primarias ex vivo , este protocolo demuestra la importancia de una concentración óptima de inhibidores y la relevancia de usar una inyección separada en lugar de una inyección secuencial de inhibidores mitocondriales cuando se trabaja con tipos de células sensibles. Finalmente, está demostrado que este ensayo puede detectar de manera robusta diferencias sutiles en la respiración mitocondrial tras la polarización con las citoquinas IL-2 e IL-15.

Protocol

Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del Hospital Herlev y la Región Capital de Dinamarca. Nota : este protocolo contiene instrucciones para una ejecución de optimización y una ejecución de ensayos. Está claramente escrito en el texto cuando las instrucciones son para una ejecución de optimización o una ejecución de ensayo. Ejecutar una ejecución de optimización antes de continuar con las ejecuciones de assay 1. Aislamiento mononu…

Representative Results

Una correcta determinación de las propiedades de OxPhos es una herramienta indispensable a la hora de estudiar las células T. Sin embargo, si las condiciones del ensayo no se han optimizado, existe un riesgo sustancial de resultados engañosos o erróneos. En este protocolo, hay un fuerte enfoque en la optimización del número de células por pozo y las concentraciones de oligomicina y FCCP a utilizar. En la configuración descrita, la oligomicina y la FCCP se agregan incrementalmente al mismo pozo, aumentando la conc…

Discussion

La cuantificación detallada y correcta de la fosforilación oxidativa es una herramienta indispensable a la hora de describir los estados energéticos de las células T. El estado de aptitud mitocondrial puede estar directamente relacionado con el potencial de activación, supervivencia y diferenciación de las células T1,5. Con este protocolo, es posible determinar las diversas propiedades de la fosforilación oxidativa (ver Tabla 4 para una e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kasper Mølgaard y Anne Rahbech recibieron subvenciones de Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaard también recibió una subvención de Børnecancerfonden.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

References

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Cite This Article
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

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