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Immunology and Infection

साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की वास्तविक समय की निगरानी

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/62984
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,3, 2, 1
1National Center for Cancer Immune Therapy, Department of Oncology, University Hospital Herlev, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, Center for Healthy Aging, University of Copenhagen, 3Department of Immunology and Microbiology, Inflammation and Cancer Group, University of Copenhagen
* These authors contributed equally

Summary

चयापचय अनुकूलन टी कोशिकाओं के लिए मौलिक है क्योंकि यह भेदभाव, दृढ़ता और साइटोटॉक्सिसिटी को निर्धारित करता है। यहां, पूर्व विवो साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की निगरानी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

सक्रियण के दौरान, टी कोशिकाओं का चयापचय उन परिवर्तनों के अनुकूल होता है जो उनके भाग्य को प्रभावित करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि टी सेल सक्रियण के लिए अपरिहार्य है, और स्मृति टी कोशिकाओं का अस्तित्व माइटोकॉन्ड्रियल रीमॉडलिंग पर निर्भर करता है। नतीजतन, यह कैंसर इम्यूनोथेरेपी के दीर्घकालिक नैदानिक परिणाम को प्रभावित करता है। टी सेल की गुणवत्ता में परिवर्तन अक्सर अच्छी तरह से ज्ञात सतह मार्करों का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अध्ययन किया जाता है और सीधे उनके चयापचय राज्य द्वारा नहीं। यह एक एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक और साइटोकिन्स आईएल -2 और आईएल -15 का उपयोग करके प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं के वास्तविक समय माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, जो टी सेल चयापचय को अलग-अलग प्रभावित करता है। यह दिखाया गया है कि टी कोशिकाओं की चयापचय स्थिति को स्पष्ट रूप से चयापचय मार्ग में प्रमुख परिसरों को बाधित करते समय ऑक्सीजन की खपत को मापकर प्रतिष्ठित किया जा सकता है और इन मापों की सटीकता इष्टतम अवरोधक एकाग्रता और अवरोधक इंजेक्शन रणनीति पर अत्यधिक निर्भर है। यह मानकीकृत प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैंसर इम्यूनोथेरेपी की निगरानी और अध्ययन में टी सेल फिटनेस के लिए एक मानक के रूप में लागू करने में मदद करेगा।

Introduction

एंटीजन को पहचानने और प्रतिक्रिया देने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता के लिए सही टी सेल विकास और कार्य आवश्यक हैं। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ऑक्सफॉस) टी सेल की स्थिति के अनुसार बदलता है। भोले टी कोशिकाएं मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करने के लिए ऑक्सफॉस का उपयोग करती हैं, जबकि सक्रिय टी कोशिकाएं एक चयापचय संक्रमण से गुजरती हैं जहां ग्लाइकोलाइसिस प्रमुख हो जाता है। प्रभावक चरण के बाद, स्मृति टी कोशिकाओं का छोटा शेष सबसेट ऑक्सफॉस 2, 3 के प्रभुत्व वाले चयापचय राज्य में वापस आ जाता है। OxPhos के परिवर्तन टी कोशिकाओं के विभेदन का इस तरह से पालन करते हैं कि टी कोशिकाओं के सबसेट को भी उनके विशिष्ट द्वारा विभेदित किया जा सकता है OxPhos गुण 1। इसके विपरीत, OxPhos टी कोशिकाओं के कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, और OxPhos के निषेध को टी कोशिकाओं के प्रसार और साइटोकाइन उत्पादन को अवरुद्ध करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसलिए, एक सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से टी सेल ऑक्सफॉस के गुणों को मापने की क्षमता टी कोशिकाओं के साथ काम करने वाले किसी भी व्यक्ति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

इस प्रोटोकॉल में, टी सेल ऑक्सफॉस के गुणों को एक एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके मापा जाता है। इस विश्लेषक का मुख्य कार्य विश्लेषण किए जाने वाले कोशिकाओं के विकास मीडिया की ऑक्सीजन सामग्री को लगातार मापना है। विकास मीडिया से हटाई गई ऑक्सीजन को कोशिकाओं द्वारा लिया जाना माना जाता है। विभिन्न प्रकार के ऑक्सफॉस अवरोधकों या संशोधक के साथ कोशिकाओं का इलाज करके, ऑक्सीजन अपटेक में एक बूंद बाधित या मॉडुलित फ़ंक्शन से जुड़ी होती है। उदाहरण के लिए, एटीपी सिंथेज़ के निषेध से ऑक्सीजन का एक कम सेलुलर अपटेक होगा जिसका उपयोग अन्यथा ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा एटीपी का उत्पादन करने के लिए किया जाएगा। क्लार्क इलेक्ट्रोड और ओरोबोरोस उपकरण सहित अन्य उपकरण, समान कार्यक्षमता प्रदान करते हैं, और प्रत्येक उपकरण के अलग-अलग फायदे और कमियां हैं। इन उपकरणों में अध्ययन के लिए सेल प्रकारों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण सेल प्रकार मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइट्स 5 है। उनके छोटे आकार, खराब उत्तरजीविता पूर्व विवो, और गैर-अनुयायी गुणों के कारण, मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

यह एक बाह्य कोशिकीय विश्लेषक द्वारा मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल को एक अनुकूलन रन में विभाजित किया गया है, जहां सेल संख्या की इष्टतम सांद्रता प्रति अच्छी तरह से, साथ ही साथ ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी की इष्टतम एकाग्रता भी निर्धारित की जाती है। इसके अलावा, एक परख चलाने, जहां अनुकूलित शर्तों का उपयोग किया जाता है.

रक्त-व्युत्पन्न मानव PBMCs और पूर्व विवो प्राथमिक टी सेल संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, यह प्रोटोकॉल इष्टतम अवरोधक एकाग्रता के महत्व और संवेदनशील सेल प्रकारों के साथ काम करते समय माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बजाय अलग-अलग उपयोग करने की प्रासंगिकता को दर्शाता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया जाता है कि यह परख साइटोकिन्स आईएल -2 और आईएल -15 के साथ ध्रुवीकरण पर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में सूक्ष्म अंतर का मजबूती से पता लगा सकता है।

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Protocol

हर्लेव अस्पताल और डेनमार्क के राजधानी क्षेत्र के दिशानिर्देशों के तहत प्रयोग किए गए थे।

नोट:: इस प्रोटोकॉल में एक ऑप्टिमाइज़ेशन चलाने और एक Assays चलाने दोनों के लिए निर्देश हैं। यह स्पष्ट रूप से पाठ में लिखा गया है जब निर्देश एक अनुकूलन चलाने या एक परख चलाने के लिए कर रहे हैं. परख रन के साथ जारी रखने से पहले एक अनुकूलन रन चलाएँ

1. मानव परिधीय रक्त mononuclear (PBMC) बफी कोट से अलगाव

  1. PBMC अलगाव
    1. उपयुक्त संस्था से बफी कोट एकत्र करें (रक्त संग्रह बैग में एकत्र)। बफी कोट स्वस्थ दाताओं से उत्पन्न होते हैं। उन दाताओं को बाहर रखें जिन्होंने हाल ही में दर्द निवारक दवाओं का उपयोग किया है।
    2. एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ बफी कोट युक्त रक्त संग्रह बैग स्प्रे करें। हमेशा बाँझ तकनीकों और सभी चरणों के लिए बाँझ हार्डवेयर का उपयोग करें
      नोट: सुनिश्चित करें कि मानव रक्त के नमूनों की हैंडलिंग के लिए सही प्राधिकरण प्राप्त किए जाते हैं।
    3. रक्त को एक बाँझ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. गैर-पूरक RPMI 1640 के साथ रक्त को कम से कम 10% पतला करें।
    5. एक 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पसंदीदा घनत्व ढाल माध्यम के 20 मिलीलीटर डालो।
    6. एस्पिरेट 25 मिलीलीटर पतला रक्त एक सीरोलॉजिकल पिपेट में। सबसे कम गति के लिए बिजली पिपेट नियंत्रक सेट करें।
    7. एक 45 ° कोण पर घनत्व ढाल माध्यम के साथ ट्यूब पकड़ो और 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के भीतरी पक्ष पर सीरोलॉजिकल पिपेट टिप आराम. धीरे-धीरे सीरोलॉजिकल पिपेट से पतला रक्त का 25 मिलीलीटर जारी करें।
    8. सुनिश्चित करें कि पतला रक्त और घनत्व ढाल माध्यम मिश्रण नहीं करते हैं। सुनिश्चित करें कि पतला रक्त घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर रहता है।
    9. बाद के घनत्व ग्रेडिएंट मध्यम ट्यूबों के साथ इसे दोहराएं जब तक कि सभी पतले रक्त को संसाधित नहीं किया जाता है।
    10. कमरे के तापमान (आरटी) पर एक स्विंग-आउट रोटर में 30 मिनट के लिए 1000 x g पर एक सेंट्रीफ्यूज और सेंट्रीफ्यूज पर ट्यूबों को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि त्वरण और ब्रेक कम से कम हैं।
      नोट: centrifugation के बाद, विभिन्न परतों दिखाई देना चाहिए। शीर्ष, स्पष्ट गुलाबी-से-नारंगी परत में रक्त प्लाज्मा और प्लेटलेट्स होते हैं। मध्य सफेद परत में पीबीएमसी होते हैं, जिसके बाद एक स्पष्ट परत होती है जिसमें घनत्व ढाल माध्यम होता है, और अंत में लाल रक्त कोशिकाओं के साथ नीचे एक गहरी लाल परत होती है।
    11. एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करते हुए, ध्यान से PBMC युक्त सफेद परत को 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एस्पिरेट करें।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम को स्थानांतरित न करें क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण को प्रभावित करेगा। अतिरिक्त प्लाज्मा परिणामों को प्रभावित नहीं करेगा।
    12. पूल सभी एक ही 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में PBMCs एकत्र और RPMI 1640 के साथ 50 mL करने के लिए शीर्ष.
    13. RT पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें (इस सेटिंग पर शेष सेंट्रीफ्यूजेशन चरणों को निष्पादित करें जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो)।
    14. supernatant aspirate और RPMI 1640 के 30 mL में कोशिकाओं resuspend. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    15. क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, ठंड माध्यम के प्रति 1 मिलीलीटर अधिकतम 30 मिलियन कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    16. क्रायोट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और दर-नियंत्रित फ्रीजिंग कंटेनर (-1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट) का उपयोग करके -80 डिग्री सेल्सियस तक फ्रीज करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, PBMCs को -140 °C पर ले जाएँ।
      नोट:: समय कक्षों को RT पर फ़्रीजिंग माध्यम में हैं सीमित करें। आरटी में, डीएमएसओ कोशिकाओं के लिए अत्यधिक विषाक्त है।

2. सक्रिय मानव प्राथमिक टी लिम्फोसाइटों की खेती

  1. कोशिकाओं का पिघलना (दिन 1)
    1. RPMI 1640 प्रति नमूना के पूर्व गर्म 10 मिलीलीटर के आसपास 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए।
    2. सेल ampules की वांछित संख्या ले लो और उन्हें अस्थायी रूप से सूखी बर्फ पर स्टोर.
    3. पूर्व-गर्म RPMI 1640 के 10 मिलीलीटर में जमे हुए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    4. RT पर 500 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. supernatant को छोड़ दें और RPMI 1640 और 2.1.4 में वर्णित के रूप में centrifuge के 10 mL में resuspending द्वारा कोशिकाओं को फिर से धोएं।
    6. supernatant को छोड़ दें और एक्स-वीवो 15 माध्यम + 5% मानव सीरम (इसके बाद: टी सेल माध्यम) के प्रति एमएल 2 x 106 कोशिकाओं पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    7. एक 24-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की प्लेट 2 मिलीलीटर और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रातभर इनक्यूबेट करें।
  2. कक्षों का सक्रियण (दिन 0)
    1. CD3/ CD28 मोतियों को धोएं, प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं में मोतियों के 12.5 μL को एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करके। मोतियों के प्रति 12.5 μL प्रति PBS के 12.5 μL जोड़ें।
      नोट: उपयोग करने से पहले मोतियों की शीशी को भंवर करना महत्वपूर्ण है।
    2. 1 मिनट के लिए एक उपयुक्त चुंबक पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
    3. बफर को छोड़ दें और टी सेल माध्यम की मूल मात्रा में मोतियों को फिर से निलंबित करें (मोतियों की मूल मात्रा के प्रति 12.5 μL प्रति 12.5 μL टी सेल माध्यम के 12.5 μL)।
    4. 1: 2 (मोती: कोशिकाओं) के अनुपात के अनुरूप कोशिकाओं के प्रति मिलियन मोतियों के 12.5 μL जोड़ें।
    5. प्रत्येक में लगभग 5 मिलियन कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को दो स्थितियों में विभाजित करें।
    6. साइटोकिन्स की सही मात्रा को उन स्थितियों में जोड़ें जैसा कि तालिका 1 में उल्लेख किया गया है।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं की खेती (दिन 3 और 5)
    1. कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक कुएं से आधी मात्रा को एक नए कुएं में स्थानांतरित करके उन्हें विभाजित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा टी सेल माध्यम की एक ही मात्रा जोड़ें।
    2. तालिका 1 में उल्लिखित प्रत्येक स्थिति में नए साइटोकिन्स जोड़ें।

3. बाह्य कोशिकीय फ्लक्स परख

  1. सेंसर कारतूस का जलयोजन (दिन 0)
    1. सेंसर कारतूस अनपैक करें और सावधानी से उपयोगिता प्लेट से सेंसर कारतूस को हटा दें।
    2. सेंसर कारतूस को उल्टा-नीचे रखें, ध्यान रखें कि सेंसर जांच को स्पर्श न करें।
    3. कैलिब्रेंट के 200 μL के साथ उपयोगिता प्लेट भरें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) और सावधानी से उपयोगिता प्लेट में सेंसर कारतूस को वापस बदलें।
    4. वैकल्पिक रूप से, किसी भी बुलबुला गठन को खत्म करने के लिए, बाँझ ultrapure पानी में सेंसर कारतूस रात भर इनक्यूबेट और परख की सुबह पर एक पूर्व गर्म calibrant के साथ इसे प्रतिस्थापित करें।
    5. एक गैर-CO2-विनियमित हीटिंग कैबिनेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेंसर कारतूस प्लेट को रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एक गैर-CO2 विनियमित कैबिनेट का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि अतिरिक्त CO2 सेंसर कारतूस को प्रभावित करेगा। सुनिश्चित करें कि फ्लक्स विश्लेषक (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति देने के लिए उपयोग से कम से कम एक दिन पहले चालू किया जाता है।
  2. सेल कोटिंग और माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों की तैयारी (दिन 1)
    1. NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), सेल-Tak (1 mg/mL, 48 μL) और NaOH (1.0 M, 24 μL) वाले कोटिंग समाधान (सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
      नोट: कोटिंग समाधान हमेशा बनाया जाना चाहिए और ताजा इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    2. एक ताजा XF सेल संस्कृति प्लेट खोलें और प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा तैयार कोटिंग समाधान के 12 μL जोड़ें। यहां तक कि सभी कुओं के तल में कोटिंग समाधान का वितरण सुनिश्चित करें।
    3. 30 मिनट के लिए ढक्कन के साथ आरटी पर प्लेट को इनक्यूबेट करें और सभी कुओं से शेष तरल समाधान को छोड़ दें।
    4. बाँझ पानी के 200 μL के साथ प्लेट धोलें और तरल को त्याग दें।
    5. सेल कल्चर ग्रेड बाँझ पीबीएस के 200 μL के साथ प्लेट धोलें और तरल त्याग.
    6. प्लेट को आरटी पर छोड़ दें और इसे कम से कम 30 मिनट के लिए सूखने दें।
  3. एक्सएफ सेल संस्कृति प्लेट में प्लेट टी कोशिकाएं (दिन 1)
    1. प्रयोगात्मक सेटअप के अनुसार ग्लूकोज, पाइरूवेट, और ग्लूटामाइन के साथ उपयुक्त XF RPMI मीडिया मिश्रण करके परख मीडिया के 50 mL तैयार करें (अनुशंसित स्तर: 4 mM ग्लूकोज, 1 mM पाइरूवेट और 3 mM ग्लूटामाइन)।
    2. एक गैर-CO2 विनियमित इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी और 7.4 पर पीएच सेट करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को चढ़ाना और ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी समाधान (अनुभाग 3.4) तैयार करने के लिए पर्याप्त मीडिया है।
    3. अनुकूलन चलाने या परख चलाने के लिए अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की बढ़ती संख्या के साथ एक प्लेट लेआउट डिजाइन. पृष्ठभूमि माप के लिए मीडिया से भरे हुए चार 4 कुओं का उपयोग करें और मीडिया के साथ इंजेक्ट किए गए।
    4. अनुभाग 2.3 (पसंदीदा विधि द्वारा) में तैयार टी कोशिकाओं की गणना करें और प्लेट लेआउट के अनुसार, कोटिंग समाधान के साथ लेपित एक्सएफ सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं पर कोशिकाओं की सही संख्या को पिपेट करें।
      नोट: प्रत्येक कुएं की अंतिम मात्रा भिन्न हो सकती है लेकिन अच्छी तरह से नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए।
    5. लेपित सतह पर टी सेल का पालन करने के लिए 10 मिनट के लिए आरटी पर 1000 x g पर XF सेल संस्कृति प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. परख मीडिया के 200 μL के साथ कोशिकाओं को धोने, मीडिया को त्यागने और परख मीडिया के 180 μL जोड़ें.
      नोट:: नेत्रहीन एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कुओं का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं संलग्न कर रहे हैं और समान रूप से अच्छी तरह से सतह भर में वितरित कर रहे हैं।
    7. गैर-CO2 विनियमित हीटिंग कैबिनेट में XF सेल कल्चर प्लेट को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्लेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है।
  4. ओलिगोमाइसिन और अनुकूलन रन के लिए FCCP के साथ सेंसर कारतूस लोड हो रहा है (दिन 1)
    नोट: यदि ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी सांद्रता पहले से ही अनुकूलित थे, तो अनुभाग 3.5 पर जारी रखें।
    1. परख मीडिया में oligomycin और FCCP के काम समाधान तैयार (चरण 3.3.1 में तैयार) के रूप में चरण 3.4.2 और 3.4.3 में वर्णित है.
    2. Oligomycin काम समाधान: 5 μM समाधान (परख मीडिया के 2 mL + 1 mM oligomycin स्टॉक के 10 μL) और 3 μM समाधान (परख मीडिया के 8 mL + 1 mM oligomycin स्टॉक के 24 μL) तैयार करें।
    3. FCCP काम समाधान: तैयार 2 μM समाधान (परख मीडिया के 2 mL + 13.2 μL 300 μM FCCP स्टॉक के) और एक 1.3 μM समाधान (परख मीडिया के 8 मिलीलीटर + 300 μM FCCP स्टॉक के 34.6 μL)
    4. सेंसर कारतूस के इंजेक्शन बंदरगाहों में या तो oligomycin या FCCP के काम कर रहे समाधान लोड (तालिका 2).
      नोट। यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी इंजेक्शन पोर्ट में केवल हवा नहीं होती है। यदि, किसी भी कारण से, सभी इंजेक्शन बंदरगाहों का उपयोग नहीं किया जाता है, तो खाली बंदरगाहों को परख मीडिया से भरने की आवश्यकता होती है।
    5. धीरे इंजेक्शन बंदरगाहों में संभावित बुलबुले को हटाने के लिए मेज पर प्लेट के किनारों दस्तक.
  5. ओलिगोमाइसिन, FCCP, और परख रन के लिए antimycin एक के साथ सेंसर कारतूस लोड हो रहा है (दिन 1)
    1. oligomycin के समाधान तैयार, परख मीडिया में FCCP (चरण 3.3.1 में तैयार) एक पिछले अनुकूलन रन में पहचाने गए इष्टतम सांद्रता के अनुसार. इसके अलावा, एक 20 μM एंटीमाइसिन ए समाधान तैयार करें।
    2. प्लेट लेआउट के अनुसार सेंसर कारतूस के इंजेक्शन पोर्ट ए में या तो ऑलिगोमाइसिन या एफसीसीपी के 20 μL लोड करें। सभी कुओं के इंजेक्शन पोर्ट बी के लिए 20 μM एंटीमाइसिन ए के 22 μL जोड़ें। एंटीमाइसिन ए की परिणामी एकाग्रता एक बार कुएं में इंजेक्ट करने के बाद 2 μM होगी।
  6. फ्लक्स विश्लेषक सॉफ़्टवेयर में प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की स्थापना.
    1. प्रति प्लेट लेआउट प्रत्येक शर्त के लिए समूह और प्लेट मानचित्र असाइन करें.
    2. इंजेक्शन रणनीति (तालिका 3 और चित्रा 1) के अनुसार प्रोटोकॉल डिजाइन करें।
      नोट: परख चलाता है, जब इंजेक्शन सी और डी छोड़ दिया जा सकता है चल रहा है.
    3. परख सेट अप सहेजें, परख के लिए शामिल किया जा करने के लिए आवश्यक जानकारी को भरने के लिए, और प्रेस प्रारंभ.
    4. फ्लक्स विश्लेषक अनुभाग 3.5 में तैयार सेंसर कारतूस के लिए पूछेगा। ढक्कन निकालें और विश्लेषक द्वारा निर्देशित के रूप में सेंसर कारतूस डालें।
      नोट: परख कैलिब्रेट और चेकमार्क द्वारा संकेतित सेंसर की जांच करेगा. सफल अंशांकन के बाद, विश्लेषक अनुभाग 3.3 में तैयार XF सेल संस्कृति प्लेट के लिए अनुरोध करेगा। उपयोगिता प्लेट विश्लेषक से बाहर निकाल दिया है और परख शुरू करने के लिए XF सेल संस्कृति प्लेट के साथ बदल दिया है.

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Representative Results

OxPhos गुणों का सही निर्धारण टी कोशिकाओं का अध्ययन करते समय एक अपरिहार्य उपकरण है। हालांकि, अगर परख शर्तों को अनुकूलित नहीं किया गया है, तो भ्रामक या गलत परिणामों का पर्याप्त जोखिम है। इस प्रोटोकॉल में, प्रति अच्छी तरह से सेल संख्या के अनुकूलन और ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी की सांद्रता का उपयोग करने पर एक मजबूत ध्यान केंद्रित किया गया है। वर्णित सेटअप में, ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी को एक ही अच्छी तरह से वृद्धिशील रूप से जोड़ा जाता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर की एकाग्रता बढ़ जाती है। ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी की इष्टतम एकाग्रता को कुओं के परिणामी ओसीआर वक्रों से निर्धारित किया जा सकता है, जहां एक पठार तक पहुंच गया है।

प्रतिनिधि रन में, ओलिगोमाइसिन को बढ़ती एकाग्रता में जोड़ा जाता है और एटीपी सिंथेज़ (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के जटिल वी) को बाधित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में कमी आती है। कुओं की संचयी सांद्रता 1 μM तक पहुंचने के बाद OCR में एक पठार तक पहुंच जाता है। इस एकाग्रता और बढ़ती सांद्रता से ओसीआर को और कम नहीं किया गया था (चित्रा 1 ए)। Uncoupler FCCP की वृद्धिशील एकाग्रता के साथ इलाज किए गए कुओं के लिए, FCCP के 0.2 μM के बाद एक पठार तक पहुंचने तक OCR का स्तर अपेक्षा के अनुसार बढ़ गया, यह दर्शाता है कि इस एकाग्रता पर पूर्ण uncoupling प्राप्त किया गया था (चित्रा 1B)। कोशिकाओं का एक अनुकूलन अच्छी तरह से प्रति मढ़वाया एक सही और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परख के लिए महत्वपूर्ण है. यदि उपयोग की गई सेल संख्या बहुत कम है, तो कोशिकाओं द्वारा परख मीडिया से हटाए गए ऑक्सीजन का स्तर विश्लेषक द्वारा सही ढंग से मापा जाने के लिए बहुत कम है। दूसरी ओर, यदि प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या बहुत अधिक है, तो कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत इतनी अधिक हो सकती है कि सिस्टम प्रत्येक माप के बाद परख मीडिया के ऑक्सीजन के स्तर को फिर से नहीं भर सकता है, जिससे तेजी से हाइपोक्सिक वातावरण और गलत ऑक्सफॉस लक्षण वर्णन होता है।

प्रतिनिधि रन में, कोशिकाओं को 200,000 और 400,000 कोशिकाओं के घनत्व पर प्रति अच्छी तरह से बीज दिया गया था (चित्रा 2 ए-सी)। 200,000 कोशिकाओं के साथ एक रन के लिए, प्रारंभिक OCR प्रति अच्छी तरह से 400,000 कोशिकाओं के साथ एक रन का लगभग आधा है। FCCP उपचार के लिए, अधिकतम OCR 61.6 pmol / min (200,000 कोशिकाओं) बनाम 190,4 pmol / min (400,000 कोशिकाएं) है। ऑलिगोमाइसिन उपचार के बाद, 200,000 कोशिकाओं के साथ चलने वाले ओसीआर एकल-अंकीय ओसीआर (6.4 पीएमओएल / मिनट) में गिर जाते हैं। यह रन के ओसीआर से कम है, जिसमें ओलिगोमाइसिन (क्रमशः 25.8 pmol / min) के साथ अच्छी तरह से इलाज किए गए 400,000 कोशिकाओं के साथ।

इसलिए, ऑप्टिमाइज़ेशन रन से, यह स्पष्ट है कि 1 μM oligomycin और 0.2 μM FCCP का उपयोग करके भविष्य के assays के लिए प्रति अच्छी तरह से 400,000 कोशिकाओं की एक सेल संख्या की आवश्यकता थी। निर्माता द्वारा अनुशंसित शास्त्रीय सेटअप में, ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी को एंटीमाइसिन ए के अंतिम जोड़ के साथ क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है। टी कोशिकाओं के लिए, यह इष्टतम दृष्टिकोण नहीं है क्योंकि ओलिगोमाइसिन उपचार को एफसीसीपी उपचार (चित्रा 3 ए, बी) के बाद अनकपलिंग को सीमित करने के लिए देखा जा सकता है। इस प्रस्तुत विधि में, डुप्लिकेट कुओं में प्रत्येक स्थिति को चलाने और एक को ओलिगोमाइसिन के साथ अच्छी तरह से इलाज करने और एफसीसीपी के साथ दूसरे को अच्छी तरह से इलाज करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें दोनों कुओं के लिए एंटीमाइसिन ए का अंतिम अतिरिक्त होता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, ओलिगोमाइसिन उपचार एफसीसीपी उपचार के बाद ओसीआर को प्रभावित नहीं करता है। यह दृष्टिकोण शास्त्रीय सेटअप के रूप में एक ही माइटोकॉन्ड्रियल गुणों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है, जहां दवाओं को अनुक्रम में जोड़ा जाता है (चित्रा 3 सी)

अंत में, यह जांच की गई कि क्या साइटोकिन्स आईएल -2 और आईएल -15 के प्रभावों को पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के चयापचय पर विभेदित किया जा सकता है। दरअसल, आईएल -15 सुसंस्कृत कोशिकाओं में उच्च अधिकतम श्वसन और अतिरिक्त श्वसन क्षमता थी, जैसा कि पहले दिखाया गया है1 (चित्रा 4 ए-ई)। बेसल श्वसन और एटीपी उत्पादन प्रभावित नहीं हुए थे। एक साथ लिया गया, इस डेटा से पता चलता है कि पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बाहरी फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके सफलतापूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ऑक्सीजन की खपत दर (OCR) पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में अवरोधक ओलिगोमाइसिन और FCCP के अनुमापन के दौरान मापा जाता है। (A) 0-1.25 μM अंतिम एकाग्रता से ओलिगोमाइसिन के चरणबद्ध अनुमापन के दौरान OCR। (बी) 0-0.5 μM अंतिम सांद्रता से FCCP के चरणबद्ध अनुमापन के दौरान OCR। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में ओसीआर माप पर सेल एकाग्रता का प्रभाव। पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के ओसीआर माप 200,000 या 400,000 कोशिकाओं के साथ प्रति अच्छी तरह से या तो (ए) एफसीसीपी या (बी) ओलिगोमाइसिन के इंजेक्शन के बाद। (सी) बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, एटीपी उत्पादन, और मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं की अतिरिक्त श्वसन क्षमता प्रति अच्छी तरह से 200,000 या 400,000 कोशिकाओं का उपयोग करके। तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटरों का एकल या अनुक्रमिक इंजेक्शन। (ए) बेसलाइन के दौरान और ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी (ए, बी), या एंटीमाइसिन ए (सी) के इंजेक्शन के बाद एकल व्यक्तिगत इंजेक्शन के रूप में या अनुक्रमिक इंजेक्शन के रूप में प्रतिनिधि ओसीआर माप। (बी) इंजेक्शन (बेसल श्वसन) से पहले या एकल इंजेक्शन या अनुक्रमिक इंजेक्शन के रूप में ओलिगोमाइसिन या एफसीसीपी के इंजेक्शन के बाद ओसीआर मान। (ग) इंजेक्शन और मापन कार्यनीति का योजनाबद्ध निरूपण। एक स्वतंत्र प्रयोग के प्रतिनिधि कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन में अंतर। (A-D) बेसल श्वसन, अधिकतम श्वसन, एटीपी उत्पादन, और सात दिनों के लिए आईएल -2 या आईएल -15 के साथ सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं की अतिरिक्त श्वसन क्षमता (एन = 3)। (ई) के प्रतिनिधि भूखंड (ए-डी), ओलिगोमाइसिन या एफसीसीपी (ए) या एंटीमाइसिन ए (बी) के इंजेक्शन के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

साइटोकाइन [स्टॉक] तनुकरण गुणक [अंतिम]
शर्त 1 IL-2 3 x 106 U/mL 30,000 100 U/mL
शर्त 2 IL-15 2 x 105 U/mL 2,000 100 U/mL

तालिका 1: साइटोकाइन संस्कृतियों की तैयारी टी कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तनों का मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग की जाती है।

ऑलिगोमाइसिन FCCP
सोल काम कर रहे हैं. अंतिम conc. Vol. सोल काम कर रहे हैं. अंतिम conc. Vol.
पोर्ट A 5.0 μM 0.50 μM 20 μL 2.0 μM 0.2 μM 20 μL
पोर्ट B 3.0 μM 0.75 μM 22 μL 1.30 μM 0.3 μM 22 μL
पोर्ट C 3.0 μM 1.0 μM 24 μL 1.30 μM 0.4 μM 24 μL
पोर्ट D 3.0 μM 1.25 μM 27 μL 1.30 μM 0.5 μM 27 μL

तालिका 2: माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों और मॉड्यूलेटरों की तैयारी के लिए रणनीति। तैयारी सांद्रता, काम की सांद्रता, और एक अनुकूलन चलाने के लिए इंजेक्शन रणनीतियों.

क्रिया ब्यौरा माप विवरण
बेसलाइन आधार रेखा माप 3 माप
इंजेक्शन पोर्ट एक इंजेक्शन 3 माप
इंजेक्शन पोर्ट बी इंजेक्शन 3 माप
इंजेक्शन पोर्ट सी इंजेक्शन 3 माप
इंजेक्शन पोर्ट डी इंजेक्शन 3 माप
माप अतिरिक्त माप वैकल्पिक

तालिका 3: माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों और मॉड्यूलेटरों के अनुमापन के साथ चलने वाले एक अनुकूलन के प्रोटोकॉल डिजाइन प्रत्येक में 3 माप के साथ 4 इंजेक्शन का उपयोग करते हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का तत्व व्याख्या
बेसल श्वसन बेसल श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों को जोड़ने से पहले उत्तेजित टी कोशिकाओं द्वारा खपत ऑक्सीजन की दर का एक आधारभूत उपाय है। यह माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन रिसाव के परिणामस्वरूप सेलुलर एटीपी मांग को पूरा करने के लिए उपयोग की जाने वाली ऑक्सीजन की खपत का एक उपाय है। जैसे, यह एटीपी संश्लेषण और प्रोटॉन रिसाव की आपूर्ति के लिए उत्पन्न प्रोटॉन वर्तमान का अवलोकन प्रदान करता है। हालांकि, यह भी एक उपाय है कि विकास मीडिया में मौजूद substrates, परख और अन्य बाह्य कारकों से पहले कोशिकाओं की उत्तेजना के आधार पर बदला जा सकता है. बेसल श्वसन इसलिए दो या दो से अधिक अलग-अलग सेल प्रकारों और / या विभिन्न उपचारों की तुलना करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक उपाय है जो कोशिकाओं की सेलुलर चयापचय स्थिति को प्रभावित करने के लिए माना जाता है।
बेसल श्वसन की गणना किसी भी माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर (ओलिगोमाइसिन या एफसीसीपी) को जोड़ने से पहले और एंटीमाइसिन ए को जोड़ने के बाद ओसीआर में अंतर के रूप में की जाती है।
अधिकतम श्वसन यह उपाय ऑक्सीजन की अधिकतम दर है जिसे ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के लिए खाया जा सकता है। ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा खपत ऑक्सीजन की दर दोनों इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला की आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में प्रोटॉन पंप करने की क्षमता और एटीपी सिंथेज़ की क्षमता से निर्धारित होती है ताकि एडीपी से एटीपी को फॉस्फोराइलेट करने के लिए प्रोटॉन ग्रेडिएंट का उपयोग किया जा सके। एटीपी सिंथेज़ की गति मुक्त एडीपी सब्सट्रेट द्वारा सीमित है और इस प्रकार सेल की सामान्य ऊर्जावान स्थिति द्वारा। माइटोकॉन्ड्रियल uncoupler FCCP के साथ कोशिकाओं का इलाज करते समय, प्रोटॉन स्वतंत्र रूप से आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में वापस आ सकते हैं। यह एक ऐसी स्थिति की नकल करता है जहां कोशिकाएं एक असंतृप्त ऊर्जा मांग का अनुभव करती हैं, और अधिकतम श्वसन इसलिए ऑक्सीजन की अधिकतम दर का एक उपाय है जिसे इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला द्वारा उपभोग किया जा सकता है।
अधिकतम श्वसन की गणना एफसीसीपी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं के ओसीआर में अंतर के रूप में की जाती है और एंटीमाइसिन ए के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं को
एटीपी टर्नओवर एटीपी-लिंक्ड श्वसन को ओलिगोमाइसिन का उपयोग करके एटीपी सिंथेज़ के निषेध के बाद ओसीआर में अंतर के रूप में मापा जाता है। ऑक्सीजन जो अन्यथा ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा एडीपी के फॉस्फोराइलेशन के लिए उपभोग की जाएगी, अब इसका उपयोग नहीं किया जाएगा क्योंकि इस प्रक्रिया को गिरफ्तार किया गया है। एटीपी से जुड़ा श्वसन इसलिए ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन द्वारा उत्पादित एटीपी के सापेक्ष है। एटी-लिंक्ड श्वसन में परिवर्तन सेल की एक परिवर्तित एटीपी मांग के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिक्रिया है
एटीपी-लिंक्ड श्वसन की गणना किसी भी माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर (ओलिगोमाइसिन या एफसीसीपी) को जोड़ने से पहले और ओलिगोमाइसिन जोड़ने के बाद ओसीआर में अंतर के रूप में की जाती है।
अतिरिक्त श्वसन क्षमता अतिरिक्त श्वसन क्षमता एक बढ़ी हुई ऊर्जावान मांग की प्रतिक्रिया के रूप में एटीपी का उत्पादन करने के लिए एक सैद्धांतिक अतिरिक्त क्षमता का एक उपाय है। इसे बेसल श्वसन और अधिकतम श्वसन के बीच के अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है। अतिरिक्त श्वसन क्षमता में परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल और सेल फिटनेस और लचीलेपन का संकेतक हो सकता है।

तालिका 4: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विभिन्न घटकों की व्याख्या जो फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके अध्ययन की जाती है

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Discussion

ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का विस्तृत और सही परिमाणीकरण टी कोशिकाओं की ऊर्जा राज्यों का वर्णन करते समय एक अपरिहार्य उपकरण है। माइटोकॉन्ड्रियल फिटनेस की स्थिति सीधे टी सेल सक्रियण क्षमता, अस्तित्व और भेदभाव 1,5 से संबंधित हो सकती है। इस प्रोटोकॉल के साथ, ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के विभिन्न गुणों को निर्धारित करना संभव है (विस्तृत विवरण के लिए तालिका 4 देखें)। ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन के इन गुणों का सटीक परिमाणीकरण टी कोशिकाओं के ऊर्जा राज्यों में एक विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। हालांकि, विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रयोग की स्थापना करते समय बहुत सावधानी बरतनी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, तीन निम्न ऑप्टिमाइज़ेशन चरणों की सलाह दी जाती है-पहले, कक्ष संख्याओं का ऑप्टिमाइज़ेशन. ऑक्सीजन सांद्रता को सही ढंग से मापने के लिए एक फ्लक्स विश्लेषक की क्षमता एक अवग्रह वक्र का पालन करती है; ऑक्सीजन में परिवर्तन जो बहुत छोटे या बहुत बड़े हैं, मशीन के ऑपरेटिंग अंतराल के बाहर गिर जाएंगे और इसलिए इसे सही ढंग से मापा नहीं जाएगा। यह पूरे प्रयोग के दौरान उपयोग किए जाने वाले सेल नंबरों के अनुकूलन की आवश्यकता है। यदि बहुत कम कोशिकाओं को परखा जाता है, तो ऑक्सीजन की खपत में परिवर्तन सही ढंग से मापा जाने के लिए बहुत कम है। यदि बहुत अधिक कोशिकाएं हैं, तो परख मीडिया में ऑक्सीजन की कमी का खतरा है। इसलिए एक प्रारंभिक रन की सिफारिश की जाती है, जिसमें सेल नंबर 100,000-400,000 सेल प्रति अच्छी तरह से होते हैं। बेसल श्वसन बनाम सेल संख्या की साजिश करते समय, इष्टतम सेल गिनती वक्र की रैखिक सीमा में होगी। सेटअप को अनुकूलित करते समय, कृपया ध्यान रखें कि आराम और सक्रिय कोशिकाओं के बीच माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि में घातीय अंतर हो सकता है, और इसलिए तदनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता है।

दूसरा, अवरोधक सांद्रता का अनुमापन। ओलिगोमाइसिन और एफसीसीपी के साथ कोशिकाओं का इलाज करते समय, उपयोग किए जाने वाले अवरोधकों की इष्टतम सांद्रता की पहचान करना महत्वपूर्ण है। एक बहुत कम एकाग्रता के परिणामस्वरूप एक सबऑप्टिमल निषेध और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का एक गलत माप होगा। यह आम है कि लोग यह सुनिश्चित करने के लिए अवरोधकों की उच्चतम अनुशंसित सांद्रता का उपयोग करते हैं कि एक पूर्ण निषेध प्राप्त किया जाता है। यह भी समस्याग्रस्त है क्योंकि अवरोधकों की बहुत अधिक सांद्रता में प्लीओट्रोपिक प्रभाव हो सकते हैं। FCCP जैसे uncouplers भी माइटोकॉन्ड्रियल के अलावा अन्य झिल्ली पर अपने प्रभाव डालते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मा झिल्ली विध्रुवीकरण, माइटोकॉन्ड्रियल निषेध और साइटोटॉक्सिसिटी सहित अवांछित प्रभावों की एक श्रृंखला होती है। इस प्रोटोकॉल में, ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी का अनुमापन सेल नंबर ऑप्टिमाइज़ेशन के साथ एक साथ किया जाता है। एक अनुकूलन रन के दौरान, ऑलिगोमाइसिन या एफसीसीपी की बढ़ती सांद्रता को चार उपलब्ध सब्सट्रेट बंदरगाहों का उपयोग करके जोड़ा जाता है। परिणामी ओसीआर आरेख में, इष्टतम एकाग्रता को नेत्रहीन रूप से उस एकाग्रता के रूप में निर्धारित किया जा सकता है जिस पर ओसीआर एक स्थिर पठार तक पहुंचता है। एक बार oligomycin और FCCP की एकाग्रता titrated किया गया है, इन सांद्रता प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं।

तीसरा, अवरोधकों के अनुक्रमिक बनाम एकल व्यक्तिगत जोड़। शास्त्रीय Seahorse assays आमतौर पर FCCP के अलावा के बाद पहले oligomycin के अनुक्रमिक इसके अलावा के साथ आयोजित कर रहे हैं. टी कोशिकाओं और अन्य संवेदनशील कोशिकाओं में, इस तरह के अनुक्रमिक जोड़ के परिणामस्वरूप अधिकतम श्वसन का एक गलत परिमाणीकरण हो सकता है। बदले में, अतिरिक्त श्वसन क्षमता के मापा स्तर वे कर रहे हैं की तुलना में कम रिपोर्ट करेंगे। इसके गंभीर उदाहरणों में अतिरिक्त श्वसन क्षमता के मूल्य शामिल हैं जो नकारात्मक हैं। यह निश्चित रूप से, जैविक रूप से संभव नहीं है और ओलिगोमाइसिन उपचार द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया के पूर्व-संवेदीकरण के कारण होता है। इस प्रोटोकॉल में, इसके बजाय यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं को केवल या तो ओलिगोमाइसिन या एफसीसीपी के साथ इलाज किया जाता है (उदाहरण की तुलना के लिए चित्रा 3 सी देखें)।

अंत में, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग यह दिखाने के लिए किया जाता है कि आईएल -15-पूरक मानव प्राथमिक टी सेल संस्कृतियों को उनके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के आधार पर आईएल -2-पूरक कोशिकाओं से स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है। आईएल -15-सुसंस्कृत कोशिकाओं में उच्च अधिकतम श्वसन और अतिरिक्त श्वसन क्षमता होती है, जो स्मृति टी कोशिकाओं 1,6 से जुड़ी एक चयापचय स्थिति है। ये अवलोकन पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं जो आईएल -15 को मेमोरी टी सेल सबसेट 8 से जोड़ते हैं। इसके अलावा, आईएल -2-सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में बेसल श्वसन में अंतर लेकिन एटीपी उत्पादन में नहीं देखा गया था। यह इंगित करता है कि ये कोशिकाएं बेसल चयापचय मांगों का पालन करने के लिए अपनी ग्लाइकोलाइटिक क्षमता का उपयोग करती हैं, जो अधिक विभेदित कोशिकाओं से जुड़ा एक मार्ग है। एक साथ लिया गया, यह दिखाया गया है कि आईएल -15 पूरकता का उपयोग करके विट्रो में एक मानव मेमोरी टी सेल मॉडल स्थापित किया जा सकता है। स्मृति कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा देने के लिए एक आईएल -15-समृद्ध वातावरण का उपयोग करना पहले प्रदर्शित किया गया है और आगे निष्कर्षों का समर्थन करता है।

इस विधि में, ऑलिगोमाइसिन, एफसीसीपी और एंटीमाइसिन ए का उपयोग ऑक्सफॉस के गुणों को मापने के लिए किया गया है। अन्य यौगिक समान प्रभावों के साथ मौजूद हैं, जो संभावित रूप से टी कोशिकाओं के लिए बेहतर अनुकूल होंगे। एक उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के विध्रुवीकरण को कम करने और साइटोटॉक्सिसिटी 9 से बचने के लिए एफसीसीपी के बजाय अनकपलर बीएएम 15 का उपयोग करना होगा। इस विधि में, इन यौगिकों पर विचार नहीं किया गया है, क्योंकि ओलिगोमाइसिन, एफसीसीपी और एंटीमाइसिन ए पिछले दशक के लिए सीहोर्स प्रयोगों के लिए अनुशंसित माइटोकॉन्ड्रियल मॉड्यूलेटर हैं। इन यौगिकों के उपयोग को इसलिए समीक्षकों और ऑक्सफॉस के साथ काम करने वाले अन्य शोधकर्ताओं द्वारा मान्यता प्राप्त है। सीहोर्स फ्लक्स विश्लेषक के अधिक अनुभवी उपयोगकर्ताओं को इन वैकल्पिक यौगिकों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, लेकिन इनका उपयोग इस पेपर के दायरे से बाहर है।

माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सफॉस की निगरानी टी सेल फ़ंक्शन को समझने और कैंसर इम्यूनोथेरेपी में सुधार के लिए एक आवश्यक उपकरण है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, आईएल -15 विस्तारित कोशिकाओं - कम विभेदित मेमोरी फेनोटाइप के साथ - सीएआर टी सेल थेरेपी की प्रतिक्रियाओं में सुधार करने के लिए दिखाया गया था, क्योंकि वे कम थके हुए थे और एक बढ़ी हुई एंटीट्यूमर गतिविधि 10 थी। यह अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रीक्लिनिकल और नैदानिक सेटिंग्स दोनों में टी कोशिकाओं की गुणवत्ता का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल चयापचय assays में पूर्व विवो सुसंस्कृत मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं के उपयोग के लिए सेल संख्या और अवरोधक सांद्रता के अनुकूलन के लिए चरणों को लागू करता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

Kasper Mølgaard और ऐनी Rahbech Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat से अनुदान प्राप्त किया। Kasper Mølgaardals भी Børnecancerfonden से अनुदान प्राप्त किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

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References

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साइटोकाइन-विभेदित मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की वास्तविक समय की निगरानी
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Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, … More

Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

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