Sanntidsovervåking av mitokondrie respirasjon i cytokin-differensierte humane primære T-celler
Summary
Metabolsk tilpasning er grunnleggende for T-celler da det dikterer differensiering, utholdenhet og cytotoksisitet. Her presenteres en optimalisert protokoll for overvåking av mitokondrie-respirasjon i ex vivo cytokin-differensierte primære T-celler.
Abstract
Under aktivering tilpasser metabolismen av T-celler seg til endringer som påvirker deres skjebne. En økning i mitokondrie oksidativ fosforylering er uunnværlig for T-celleaktivering, og overlevelsen av minne T-celler er avhengig av mitokondrieoppussing. Dette påvirker derfor det langsiktige kliniske utfallet av kreftimmunoterapi. Endringer i T-cellekvaliteten studeres ofte av strømningscytometri ved hjelp av kjente overflatemarkører og ikke direkte av deres metabolske tilstand. Dette er en optimalisert protokoll for måling av mitokondrie-respirasjon i sanntid av primære humane T-celler ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator og cytokinene IL-2 og IL-15, som forskjellig påvirker T-cellemetabolismen. Det er vist at den metabolske tilstanden til T-celler tydelig kan skille seg ut ved å måle oksygenforbruket når du hemmer nøkkelkomplekser i metabolsk vei, og at nøyaktigheten av disse målingene er svært avhengig av optimal hemmerkonsentrasjon og hemmerinjeksjonsstrategi. Denne standardiserte protokollen vil bidra til å implementere mitokondrie respirasjon som en standard for T-celle fitness i overvåking og studier av kreft immunterapi.
Introduction
Riktig T-celleutvikling og funksjon er avgjørende for immunsystemets evne til å gjenkjenne og reagere på antigener. Mitokondrie oksidativ fosforylering (OxPhos) endres i henhold til tilstanden til T-cellen. Naive T-celler bruker hovedsakelig OxPhos til å produsere ATP, mens aktiverte T-celler gjennomgår en metabolsk overgang der glykolyse blir dominerende1. Etter effektorfasen går den lille gjenværende undergruppen av minne T-celler tilbake til en metabolsk tilstand dominert av OxPhos2,3. Endringene i OxPhos følger differensiering av T-celler i en slik grad at selv undergrupper av T-celler kan differensieres av deres spesifikke er OxPhos egenskaper1. På den annen side er OxPhos viktig for T-cellenes funksjon, og hemming av OxPhos har vist seg å blokkere spredning og cytokinproduksjon av T-celler4. Derfor er evnen til å kvantifisere egenskapene til T-cellen OxPhos på en presis og reproduserbar måte et kraftig verktøy for alle som arbeider med T-celler.
I denne protokollen måles egenskapene til T-cellen OxPhos ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator. Kjernefunksjonen til denne analysatoren er å kontinuerlig måle oksygeninnholdet i vekstmediet til cellene som skal analyseres. Oksygen fjernet fra vekstmediet antas å bli tatt opp av cellene. Ved å behandle cellene med en rekke OxPhos-hemmere eller modifikatorer, er en dråpe i oksygenopptak forbundet med den hemmet eller modulerte funksjonen. For eksempel vil hemming av ATP-syntasen føre til redusert cellulært opptak av oksygen som ellers ville bli brukt til å produsere ATP ved oksidativ fosforylering. Annet utstyr, inkludert Clark-elektroden og Oroboros-instrumentet, tilbyr lignende funksjonalitet, og hvert instrument har forskjellige fordeler og mangler. Et bredt utvalg av celletyper kan brukes til studier i disse enhetene, men en spesielt utfordrende celletype er human primær T-lymfocytter5. På grunn av sin lille størrelse, dårlige overlevelse ex vivo, og ikke-tilhenger egenskaper, kan menneskelige primære T-celler være utfordrende å studere.
Dette er en protokoll for å studere mitokondrie respirasjon av menneskelige primære T-celler av en ekstracellulær analysator. Protokollen er delt inn i en optimaliseringskjøring, hvor optimale konsentrasjoner av cellenummer per brønn, samt den optimale konsentrasjonen av oligomycin og FCCP, bestemmes. Videre et analyseløp, der de optimaliserte forholdene brukes.
Ved hjelp av blodavledede menneskelige PBMCer og ex vivo primære T-cellekulturer, viser denne protokollen viktigheten av optimal inhibitorkonsentrasjon og relevansen av å bruke separat i stedet for en sekvensiell injeksjon av mitokondriehemmere når du arbeider med sensitive celletyper. Til slutt er det demonstrert at denne analysen robust kan oppdage subtile forskjeller i mitokondrie respirasjon ved polarisering med cytokiner IL-2 og IL-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detaljert og korrekt kvantifisering av oksidativ fosforylering er et uunnværlig verktøy når du beskriver energitilstandene til T-celler. Tilstanden til mitokondrie fitness kan være direkte relatert til T celleaktiveringspotensial, overlevelse og differensiering1,5. Med denne protokollen er det mulig å bestemme de ulike egenskapene til oksidativ fosforylering (se tabell 4 for en detaljert forklaring). Presis kvantifisering av disse egenskapen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard og Anne Rahbech fikk tilskudd fra Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaardalso fikk stipend fra Børnecancerfonden.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
