Summary

Sanntidsovervåking av mitokondrie respirasjon i cytokin-differensierte humane primære T-celler

Published: October 19, 2021
doi:

Summary

Metabolsk tilpasning er grunnleggende for T-celler da det dikterer differensiering, utholdenhet og cytotoksisitet. Her presenteres en optimalisert protokoll for overvåking av mitokondrie-respirasjon i ex vivo cytokin-differensierte primære T-celler.

Abstract

Under aktivering tilpasser metabolismen av T-celler seg til endringer som påvirker deres skjebne. En økning i mitokondrie oksidativ fosforylering er uunnværlig for T-celleaktivering, og overlevelsen av minne T-celler er avhengig av mitokondrieoppussing. Dette påvirker derfor det langsiktige kliniske utfallet av kreftimmunoterapi. Endringer i T-cellekvaliteten studeres ofte av strømningscytometri ved hjelp av kjente overflatemarkører og ikke direkte av deres metabolske tilstand. Dette er en optimalisert protokoll for måling av mitokondrie-respirasjon i sanntid av primære humane T-celler ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator og cytokinene IL-2 og IL-15, som forskjellig påvirker T-cellemetabolismen. Det er vist at den metabolske tilstanden til T-celler tydelig kan skille seg ut ved å måle oksygenforbruket når du hemmer nøkkelkomplekser i metabolsk vei, og at nøyaktigheten av disse målingene er svært avhengig av optimal hemmerkonsentrasjon og hemmerinjeksjonsstrategi. Denne standardiserte protokollen vil bidra til å implementere mitokondrie respirasjon som en standard for T-celle fitness i overvåking og studier av kreft immunterapi.

Introduction

Riktig T-celleutvikling og funksjon er avgjørende for immunsystemets evne til å gjenkjenne og reagere på antigener. Mitokondrie oksidativ fosforylering (OxPhos) endres i henhold til tilstanden til T-cellen. Naive T-celler bruker hovedsakelig OxPhos til å produsere ATP, mens aktiverte T-celler gjennomgår en metabolsk overgang der glykolyse blir dominerende1. Etter effektorfasen går den lille gjenværende undergruppen av minne T-celler tilbake til en metabolsk tilstand dominert av OxPhos2,3. Endringene i OxPhos følger differensiering av T-celler i en slik grad at selv undergrupper av T-celler kan differensieres av deres spesifikke er OxPhos egenskaper1. På den annen side er OxPhos viktig for T-cellenes funksjon, og hemming av OxPhos har vist seg å blokkere spredning og cytokinproduksjon av T-celler4. Derfor er evnen til å kvantifisere egenskapene til T-cellen OxPhos på en presis og reproduserbar måte et kraftig verktøy for alle som arbeider med T-celler.

I denne protokollen måles egenskapene til T-cellen OxPhos ved hjelp av en ekstracellulær fluksanalysator. Kjernefunksjonen til denne analysatoren er å kontinuerlig måle oksygeninnholdet i vekstmediet til cellene som skal analyseres. Oksygen fjernet fra vekstmediet antas å bli tatt opp av cellene. Ved å behandle cellene med en rekke OxPhos-hemmere eller modifikatorer, er en dråpe i oksygenopptak forbundet med den hemmet eller modulerte funksjonen. For eksempel vil hemming av ATP-syntasen føre til redusert cellulært opptak av oksygen som ellers ville bli brukt til å produsere ATP ved oksidativ fosforylering. Annet utstyr, inkludert Clark-elektroden og Oroboros-instrumentet, tilbyr lignende funksjonalitet, og hvert instrument har forskjellige fordeler og mangler. Et bredt utvalg av celletyper kan brukes til studier i disse enhetene, men en spesielt utfordrende celletype er human primær T-lymfocytter5. På grunn av sin lille størrelse, dårlige overlevelse ex vivo, og ikke-tilhenger egenskaper, kan menneskelige primære T-celler være utfordrende å studere.

Dette er en protokoll for å studere mitokondrie respirasjon av menneskelige primære T-celler av en ekstracellulær analysator. Protokollen er delt inn i en optimaliseringskjøring, hvor optimale konsentrasjoner av cellenummer per brønn, samt den optimale konsentrasjonen av oligomycin og FCCP, bestemmes. Videre et analyseløp, der de optimaliserte forholdene brukes.

Ved hjelp av blodavledede menneskelige PBMCer og ex vivo primære T-cellekulturer, viser denne protokollen viktigheten av optimal inhibitorkonsentrasjon og relevansen av å bruke separat i stedet for en sekvensiell injeksjon av mitokondriehemmere når du arbeider med sensitive celletyper. Til slutt er det demonstrert at denne analysen robust kan oppdage subtile forskjeller i mitokondrie respirasjon ved polarisering med cytokiner IL-2 og IL-15.

Protocol

Eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene fra Herlev Hospital og Hovedstadsregionen i Danmark. MERK: Denne protokollen inneholder instruksjoner for både en optimaliseringskjøring og en analysekjøring. Det er tydelig skrevet i teksten når instruksjonene er for en optimalisering kjøre eller en analyse kjøre. Kjør en optimaliseringskjøring før du fortsetter med analysene 1. Human perifer mononukleær (PBMC) isolasjon fra buffy strøk</stron…

Representative Results

En riktig bestemmelse av OxPhos egenskaper er et uunnværlig verktøy når du studerer T-celler. Men hvis analyseforholdene ikke er optimalisert, er det en betydelig risiko for villedende eller feilaktige resultater. I denne protokollen er det et sterkt fokus på optimalisering av cellenummer per brønn og konsentrasjoner av oligomycin og FCCP som skal brukes. I det beskrevne oppsettet tilsettes oligomycin og FCCP trinnvis til samme brønn, noe som øker konsentrasjonen av mitokondriemodulatorene. Den optimale konsentras…

Discussion

Detaljert og korrekt kvantifisering av oksidativ fosforylering er et uunnværlig verktøy når du beskriver energitilstandene til T-celler. Tilstanden til mitokondrie fitness kan være direkte relatert til T celleaktiveringspotensial, overlevelse og differensiering1,5. Med denne protokollen er det mulig å bestemme de ulike egenskapene til oksidativ fosforylering (se tabell 4 for en detaljert forklaring). Presis kvantifisering av disse egenskapen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kasper Mølgaard og Anne Rahbech fikk tilskudd fra Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat. Kasper Mølgaardalso fikk stipend fra Børnecancerfonden.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

References

  1. vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  2. Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
  3. vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
  4. Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  5. vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
  6. Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  7. Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
  8. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  9. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  10. Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).

Play Video

Cite This Article
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

View Video