Summary
Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Aktivasyon sırasında, T hücrelerinin metabolizması, kaderlerini etkileyen değişikliklere adapte olur. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyondaki artış, T hücresi aktivasyonu için vazgeçilmezdir ve hafıza T hücrelerinin hayatta kalması mitokondriyal yeniden şekillenmeye bağlıdır. Sonuç olarak, bu kanser immünoterapilerinin uzun vadeli klinik sonuçlarını etkiler. T hücre kalitesindeki değişiklikler genellikle doğrudan metabolik durumlarıyla değil, iyi bilinen yüzey belirteçleri kullanılarak akış sitometrisi ile incelenir. Bu, bir Hücre Dışı Akı Analizörü ve T hücresi metabolizmasını farklı şekilde etkileyen sitokinler IL-2 ve IL-15 kullanarak birincil insan T hücrelerinin gerçek zamanlı mitokondriyal solunumunu ölçmek için optimize edilmiş bir protokoldür. T hücrelerinin metabolik durumunun, metabolik yolaktaki anahtar kompleksleri inhibe ederken oksijen tüketiminin ölçülmesiyle açıkça ayırt edilebileceği ve bu ölçümlerin doğruluğunun optimal inhibitör konsantrasyonuna ve inhibitör enjeksiyon stratejisine büyük ölçüde bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, mitokondriyal solunumun kanser immünoterapilerinin izlenmesinde ve incelenmesinde T hücresi uygunluğu için bir standart olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.
Introduction
Doğru T hücresi gelişimi ve fonksiyonu, bağışıklık sisteminin antijenleri tanıma ve bunlara yanıt verme yeteneği için gereklidir. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OxPhos), T hücresinin durumuna göre değişir. Naif T hücreleri ağırlıklı olarak ATP üretmek için OxPhos kullanırken, aktive olmuş T hücreleri glikolizin baskın hale geldiği metabolik bir geçişe uğrar1. Efektör fazından sonra, bellek T hücrelerinin kalan küçük alt kümesi, OxPhos2,3'ün hakim olduğu metabolik bir duruma geri döner. OxPhos'un değişiklikleri, T hücrelerinin farklılaşmasını öyle bir dereceye kadar takip eder ki, T hücrelerinin alt kümeleri bile spesifik OxPhos özellikleri ile ayırt edilebilir1. Tersine, OxPhos, T hücrelerinin işlevi için önemlidir ve OxPhos'un inhibisyonunun, T hücrelerinin proliferasyonunu ve sitokin üretimini bloke ettiği gösterilmiştir4. Bu nedenle, T hücresi OxPhos'un özelliklerini kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme yeteneği, T hücreleri ile çalışan herkes için güçlü bir araçtır.
Bu protokolde, T hücresi OxPhos'un özellikleri, hücre dışı bir akı analizörü kullanılarak ölçülür. Bu analizörün temel işlevi, analiz edilecek hücrelerin büyüme ortamının oksijen içeriğini sürekli olarak ölçmektir. Büyüme ortamından çıkarılan oksijenin hücreler tarafından alındığı varsayılır. Hücreleri çeşitli OxPhos inhibitörleri veya modifiye edicileri ile tedavi ederek, oksijen alımındaki bir düşüş, inhibe edilmiş veya modüle edilmiş fonksiyon ile ilişkilidir. Örneğin, ATP sentazının inhibisyonu, aksi takdirde oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretmek için kullanılacak olan hücresel oksijen alımının azalmasına yol açacaktır. Clark elektrodu ve Oroboros enstrümanı da dahil olmak üzere diğer ekipmanlar benzer işlevsellik sunar ve her enstrümanın farklı avantajları ve eksiklikleri vardır. Bu cihazlardaki çalışmalar için çok çeşitli hücre tipleri kullanılabilir, ancak özellikle zorlu bir hücre tipi insan primer T lenfositleridir5. Küçük boyutları, zayıf sağkalım ex vivo ve yapışkan olmayan özellikleri nedeniyle, insan birincil T hücrelerinin incelenmesi zor olabilir.
Bu, insan birincil T hücrelerinin mitokondriyal solunumunu hücre dışı bir analizör tarafından incelemek için bir protokoldür. Protokol, kuyu başına optimal hücre sayısı konsantrasyonlarının yanı sıra optimal oligomisin ve FCCP konsantrasyonunun belirlendiği bir Optimizasyon çalışmasına bölünmüştür. Ayrıca, optimize edilmiş koşulların kullanıldığı bir Tahlil çalışması.
Kan kaynaklı insan PBMC'lerini ve ex vivo primer T hücre kültürlerini kullanan bu protokol, optimal inhibitör konsantrasyonunun önemini ve hassas hücre tipleriyle çalışırken mitokondriyal inhibitörlerin sıralı enjeksiyonu yerine ayrı ayrı kullanılmasının önemini göstermektedir. Son olarak, bu tahlilin IL-2 ve IL-15 sitokinleri ile polarizasyon üzerine mitokondriyal solunumdaki ince farklılıkları sağlam bir şekilde tespit edebileceği gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneyler, Herlev Hastanesi ve Danimarka'nın Başkent Bölgesi'nin yönergeleri altında gerçekleştirildi.
NOT: Bu protokol hem Optimizasyon çalıştırması hem de Tahliller çalıştırması için yönergeler içerir. Talimatlar bir Optimizasyon çalıştırması veya bir Tahlil çalıştırması için olduğunda metinde açıkça yazılır. Tahlil çalıştırmalarına devam etmeden önce bir Optimizasyon çalıştırması çalıştırın
1. Buffy paltolardan insan periferik kan mononükleer (PBMC) izolasyonu
- PBMC yalıtımı
- Buffy paltoları uygun kurumdan toplayın (kan toplama torbalarında toplanır). Buffy paltolar sağlıklı donörlerden kaynaklanır. Son zamanlarda ağrı kesici kullanan bağışçıları hariç tutun.
- Laminer akış kabinine aktarmadan önce buffy ceketi içeren kan toplama torbasına% 70 etanol püskürtün. Tüm adımlar için her zaman steril teknikler ve steril donanım kullanın
NOT: İnsan kan örneklerinin işlenmesi için doğru izinlerin alındığından emin olun. - Kanı steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın.
- Kanı takviye edilmemiş RPMI 1640 ile en az% 10 seyreltin.
- Tercih edilen yoğunluk gradyanı ortamının 20 mL'sini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dökün.
- Seyreltilmiş kanın 25 mL'sini serolojik bir pipete aspire edin. Elektrikli pipet kontrol cihazını en düşük hıza ayarlayın.
- Yoğunluk gradyanı ortamına sahip tüpü 45° açıyla tutun ve serolojik pipet ucunu 50 mL santrifüj tüpünün iç tarafına yerleştirin. Seyreltilmiş kanın 25 mL'sini serolojik pipetten yavaşça serbest bırakın.
- Seyreltilmiş kanın ve yoğunluk gradyanı ortamının karışmadığından emin olun. Seyreltilmiş kanın yoğunluk gradyanı ortamının üstünde durduğundan emin olun.
- Tüm seyreltilmiş kan işlenene kadar bunu sonraki yoğunluk gradyanı orta tüplerle tekrarlayın.
- Tüpleri, oda sıcaklığında (RT) bir salınımlı rotorda 30 dakika boyunca 1000 x g'de bir santrifüje ve santrifüje dikkatlice hareket ettirin. Hızlanma ve kırılmanın minimumda olduğundan emin olun.
NOT: Santrifüjlemeden sonra, çeşitli katmanlar görünür olmalıdır. Üstteki, berrak pembe-turuncu tabaka kan plazması ve trombositlerden oluşur. Orta beyaz tabaka, PBMC'lerden oluşur, ardından yoğunluk gradyanı ortamından oluşan berrak bir tabaka ve son olarak altta kırmızı kan hücreleri ile koyu kırmızı bir tabaka oluşur. - Steril bir Pasteur pipet kullanarak, PBMC içeren beyaz tabakayı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice aspire edin.
NOT: Yoğunluk gradyanı ortamını aktarmadığınızdan emin olun, çünkü bu aşağı akış arıtmasını etkileyecektir. Aşırı plazma sonuçları etkilemeyecektir. - Toplanan tüm PBMC'leri aynı 50 mL santrifüj tüpünde toplayın ve RPMI 1640 ile 50 mL'ye kadar doldurun.
- RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 500 x g'de santrifüj yapın (aksi belirtilmedikçe kalan santrifüjleme adımlarını bu ayarda gerçekleştirin).
- Süpernatantı aspire edin ve hücreleri RPMI 1640'ın 30 mL'sinde yeniden askıya alın. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
- Kriyoprezervasyon için, 1 mL donma ortamı başına maksimum 30 milyon hücreyi yeniden askıya alın.
- Hücreleri kriyotüplere aktarın ve hız kontrollü bir dondurma kabı (dakikada -1 ° C) kullanarak -80 ° C'ye kadar dondurun. Uzun süreli depolama için PBMC'leri -140 °C'ye taşıyın.
NOT: RT'de hücrelerin donma ortamında olduğu süreyi sınırlayın. RT'de, DMSO hücreler için oldukça toksiktir.
2. Aktif insan primer T lenfositlerinin kültürlenmesi
- Hücrelerin çözülmesi (1. Gün)
- Numune başına yaklaşık 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış 10 mL RPMI 1640.
- İstenilen sayıda hücre ampulünü alın ve geçici olarak kuru buz üzerinde saklayın.
- Dondurulmuş hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış RPMI 1640'ta yeniden askıya alın.
- RT'de 500 x g'de hücreleri 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve 2.1.4'te açıklandığı gibi 10 mL RPMI 1640 ve santrifüjde yeniden askıya alarak hücreleri tekrar yıkayın.
- Süpernatantı atın ve hücreleri mL başına 2 x 106 hücrede X-VIVO 15 ortamı +% 5 insan serumunda (bundan böyle: T hücre ortamı) yeniden askıya alın.
- 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasında kuyu başına hücrelerin 2 mL'sini plakalayın ve gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Hücrelerin aktivasyonu (Gün 0)
- CD3/CD28 boncuklarını, 1 milyon hücre başına 12,5 μL boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak yıkayın. 12,5 μL boncuk başına 12,5 μL PBS ekleyin.
NOT: Kullanmadan önce boncuk şişesini vortekse etmek önemlidir. - Mikrosantrifüj tüpünü 1 dakika boyunca uygun bir mıknatıs üzerine yerleştirin.
- Arabelleği atın ve boncukları orijinal T hücresi ortamı hacminde yeniden askıya alın (orijinal boncuk hacminin 12,5 μL'si başına 12,5 μL T hücre ortamı).
- 1: 2 oranına karşılık gelen milyonlarca hücre başına 12,5 μL boncuk ekleyin (boncuklar: hücreler).
- Hücreleri, her birinde yaklaşık 5 milyon hücre bulunan iki koşula bölün.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi koşullara doğru miktarda sitokin ekleyin.
- Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 gün boyunca inkübe edin.
- CD3/CD28 boncuklarını, 1 milyon hücre başına 12,5 μL boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak yıkayın. 12,5 μL boncuk başına 12,5 μL PBS ekleyin.
- Hücrelerin kültürlenmesi (Gün 3 ve 5)
- Hücreleri yeniden askıya alın ve hacmin yarısını her kuyudan yeni bir kuyuya aktararak bölün. Her bir kuyucuğa aynı miktarda taze T hücresi ortamı ekleyin.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi her duruma yeni sitokinler ekleyin.
3. Hücre dışı akı testi
- Sensör kartuşunun hidrasyonu (Gün 0)
- Sensör kartuşunu ambalajından çıkarın ve sensör kartuşunu yardımcı plakadan dikkatlice çıkarın.
- Sensör kartuşunu baş aşağı yerleştirin ve sensör problarına dokunmamaya dikkat edin.
- Yardımcı plakayı 200 μL kalibrant ile doldurun (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) ve sensör kartuşunu dikkatlice tekrar yardımcı plakaya yerleştirin.
- Alternatif olarak, herhangi bir kabarcık oluşumunu ortadan kaldırmak için, sensör kartuşunu gece boyunca steril ultra saf suda inkübe edin ve tahlil sabahı önceden ısıtılmış bir kalibrent ile değiştirin.
- Sensör kartuş plakasını gece boyunca CO2 ayarlı olmayan bir ısıtma kabininde 37 °C'de inkübe edin.
NOT: Fazla CO2 sensör kartuşunu etkileyeceğinden, CO2 düzenlemeli olmayan bir kabin kullanmak çok önemlidir. Akı analizörünün (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın) 37 °C'ye kadar ısınmasını sağlamak için kullanımdan en az bir gün önce açık olduğundan emin olun.
- Hücre kaplaması ve mitokondriyal inhibitörlerin hazırlanması (Gün 1)
- NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) ve NaOH (1.0 M, 24 μL) içeren bir kaplama çözeltisi hazırlayın (bkz.
NOT: Kaplama çözeltisi her zaman taze yapılmalı ve kullanılmalıdır. - Taze bir XF hücre kültürü plakası açın ve her bir oyuğa taze hazırlanmış kaplama çözeltisinden 12 μL ekleyin. Kaplama çözeltisinin tüm kuyucukların dibinde eşit dağılımını sağlayın.
- RT'deki plakayı kapağı açık olarak 30 dakika boyunca inkübe edin ve kalan sıvı çözeltiyi tüm kuyucuklardan atın.
- Plakayı 200 μL steril suyla yıkayın ve sıvıyı atın.
- Plakayı 200 μL hücre kültürü sınıfı steril PBS ile yıkayın ve sıvıyı atın.
- Plakayı RT'de bırakın ve en az 30 dakika kurumaya bırakın.
- NaHCO3 (pH 8.3, 0.1 M, 1128 μL), Cell-Tak (1 mg/mL, 48 μL) ve NaOH (1.0 M, 24 μL) içeren bir kaplama çözeltisi hazırlayın (bkz.
- XF hücre kültürü plakasındaki plaka T hücreleri (Gün 1)
- Uygun XF RPMI ortamını deneysel düzeneğe göre glikoz, piruvat ve glutamin ile karıştırarak 50 mL tahlil ortamı hazırlayın (Önerilen seviyeler: 4 mM glikoz, 1 mM piruvat ve 3 mM glutamin).
- CO2 düzenlemeli olmayan bir inkübatörde 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. Hücreleri kaplamak ve oligomisin ve FCCP çözeltileri hazırlamak için yeterli ortam olduğundan emin olun (bölüm 3.4).
- Optimizasyon çalıştırması veya Tahlil çalıştırması için kuyu başına artan sayıda hücreye sahip bir plaka düzeni tasarlayın. Arka plan ölçümleri için medya ile doldurulmuş ve medya enjekte edilmiş dört adet 4 kuyucuk kullanın.
- Bölüm 2.3'te hazırlanan T hücrelerini (tercih edilen yöntemle) sayın ve plaka düzenine göre kaplama çözeltisi ile kaplanmış XF hücre kültürü plakasının her bir kuyucuğuna doğru sayıda hücreyi pipetleyin.
NOT: Her bir kuyunun son hacmi değişebilir, ancak kuyunun dibini örtmek için yeterli olmalıdır. - XF hücre kültürü plakasını RT'de 1000 x g'de santrifüj yaparak T hücresini kaplanmış yüzeye yapıştırmak için 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücreleri 200 μL tahlil ortamı ile yıkayın, ortamı atın ve 180 μL tahlil ortamı ekleyin.
NOT: Hücrelerin kuyu yüzeyine tutturulmuş ve eşit olarak dağılmış olduğundan emin olmak için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak kuyuları görsel olarak inceleyin. - Plakanın sıcaklığının 37 °C olmasını sağlamak için XF hücre kültürü plakasını CO2 ayarlı olmayan ısıtma kabininde 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Optimizasyon çalışması için oligomisin ve FCCP ile sensör kartuşu yükleme (1. Gün)
NOT: Oligomisin ve FCCP konsantrasyonları zaten optimize edilmişse, bölüm 3.5'te devam edin.- Oligomisin ve FCCP'nin çalışma çözeltilerini, adım 3.4.2 ve 3.4.3'te açıklandığı gibi tahlil ortamında (adım 3.3.1'de hazırlanan) hazırlayın.
- Oligomisin çalışma çözeltileri: 5 μM çözelti (2 mL tahlil ortamı + 10 μL 1 mM oligomisin stoğu) ve 3 μM çözelti (8 mL tahlil ortamı + 24 μL 1 mM oligomisin stoğu) hazırlayın.
- FCCP çalışma çözümü: 2 μM çözelti (2 mL tahlil ortamı + 13,2 μL 300 μM FCCP stoğu) ve 1,3 μM çözelti (8 ml tahlil ortamı + 34,6 μL 300 μM FCCP stoğu) hazırlayın
- Oligomisin veya FCCP'nin çalışma çözeltilerini sensör kartuşunun enjeksiyon portlarına yükleyin (Tablo 2).
NOT. Hiçbir enjeksiyon portunun sadece hava içermemesi önemlidir. Herhangi bir nedenle, tüm enjeksiyon portları kullanılmıyorsa, boş portların tahlil ortamıyla doldurulması gerekir. - Enjeksiyon portlarındaki potansiyel kabarcıkları gidermek için plakanın kenarlarını masanın üzerine yavaşça vurun.
- Tahlil çalışması için oligomisin, FCCP ve antimisin A içeren sensör kartuşu yükleme (1. Gün)
- Önceki bir Optimizasyon çalışmasında tanımlanan optimum konsantrasyonlara göre tahlil ortamında oligomisin, FCCP çözeltileri hazırlayın (adım 3.3.1'de hazırlanmıştır). Ayrıca, 20 μM'lik bir antimisin A çözeltisi hazırlayın.
- Plaka düzenine göre sensör kartuşunun A enjeksiyon portuna 20 μL oligomisin veya FCCP yükleyin. Tüm kuyucukların B enjeksiyon portuna 22 μL 20 μM antimisin A ekleyin. Kuyuya enjekte edildikten sonra ortaya çıkan antimisin A konsantrasyonu 2 μM olacaktır.
- Flux analizör yazılımında deneysel protokolün kurulması.
- Plaka düzeni başına her koşul için grupları ve plaka haritasını atayın.
- Protokolü enjeksiyon stratejisine göre tasarlayın (Tablo 3 ve Şekil 1).
NOT: Tahlil çalışmalarını çalıştırırken, C ve D enjeksiyonları atlanabilir. - Tahlil kurulumunu kaydedin, tahlil için dahil edilmesi gereken bilgileri doldurun ve Başlat'a basın.
- Akı analizörü, bölüm 3.5'te hazırlanan sensör kartuşunu isteyecektir. Kapağı çıkarın ve sensör kartuşunu analizörün yönlendirdiği şekilde takın.
NOT: Tahlil, onay işaretleriyle belirtilen sensörleri kalibre edecek ve kontrol edecektir. Başarılı kalibrasyondan sonra, analizör bölüm 3.3'te hazırlanan XF hücre kültürü plakasını talep edecektir. Yardımcı plaka analizörden çıkarılır ve tahlili başlatmak için XF hücre kültürü plakası ile değiştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OxPhos özelliklerinin doğru belirlenmesi, T hücrelerini incelerken vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, tahlil koşulları optimize edilmemişse, yanıltıcı veya hatalı sonuçlar elde etme riski vardır. Bu protokolde, kuyu başına hücre sayısının optimizasyonuna ve kullanılacak oligomisin ve FCCP konsantrasyonlarına güçlü bir odaklanma vardır. Tarif edilen kurulumda, oligomisin ve FCCP aynı kuyuya kademeli olarak eklenir ve mitokondriyal modülatörlerin konsantrasyonu arttırılır. Oligomisin ve FCCP'nin optimal konsantrasyonu, kuyuların ortaya çıkan OCR eğrilerinden, bir platoya ulaşılan konsantrasyon olarak belirlenebilir.
Temsili çalışmada, oligomisin artan bir konsantrasyonda eklenir ve ATP sentazı (elektron taşıma zincirinin Kompleks V'si) inhibe eder, bu da mitokondriyal solunumun azalmasına neden olur. OCR'deki bir platoya, kuyuların birikimli konsantrasyonu 1 μM'ye ulaştıktan sonra ulaşılır. Bu konsantrasyondan ve artan konsantrasyonlardan OCR daha fazla azalmadı (Şekil 1A). Eşikatör FCCP'nin artımlı bir konsantrasyonu ile muamele edilen kuyular için, OCR seviyeleri, 0.2 μM FCCP eklendikten sonra bir platoya ulaşana kadar beklendiği gibi artmıştır, bu da bu konsantrasyonda tam ayrışmanın elde edildiğini göstermektedir (Şekil 1B). Kuyu başına kaplanmış hücrelerin optimizasyonu, doğru ve tekrarlanabilir bir tahlil için önemlidir. Kullanılan hücre sayısı çok düşükse, hücreler tarafından tahlil ortamından çıkarılan oksijen seviyesi, analizör tarafından doğru bir şekilde ölçülemeyecek kadar düşüktür. Öte yandan, kuyu başına düşen hücre sayısı çok yüksekse, hücrelerin oksijen tüketimi o kadar yüksek olabilir ki, sistem her ölçümden sonra tahlil ortamının oksijen seviyelerini yenileyemez, bu da giderek hipoksik bir ortama ve hatalı OxPhos karakterizasyonuna yol açar.
Temsili çalışmada, hücreler kuyu başına 200.000 ve 400.000 hücre yoğunluğunda tohumlandı (Şekil 2A-C). 200.000 hücreli bir çalışma için, ilk OCR, kuyu başına 400.000 hücreli bir çalışmanın yaklaşık yarısıdır. FCCP tedavisi için maksimum OCR, 190.4 pmol / dak'ya (400.000 hücre) karşı 61.6 pmol / dak'dır (200.000 hücre). Oligomisin tedavisini takiben, 200.000 hücreli OCR, tek haneli OCR'ye (6.4 pmol / dak) çöker. Bu, çalışmanın OCR'sinden daha düşüktür ve oligomisin ile iyi muamele edilmiş başına 400.000 hücre (sırasıyla 25.8 pmol / dak).
Bu nedenle, optimizasyon çalışmasından, 1 μM oligomisin ve 0.2 μM FCCP kullanılarak gelecekteki tahliller için kuyu başına 400.000 hücrelik bir hücre sayısının gerekli olduğu açıktır. Üretici tarafından önerilen klasik kurulumda, oligomisin ve FCCP, antimisin A'nın son ilavesiyle sırayla eklenir. T hücreleri için bu en uygun yaklaşım değildir, çünkü oligomisin tedavisinin FCCP tedavisinden sonra ayrılmayı sınırladığı görülebilir (Şekil 3A, B). Sunulan bu yöntemde, her bir durumun çift kuyucuklarda çalıştırılması ve bir kuyucuğun oligomisin, diğerinin FCCP ile muamele edilmesi ve her iki kuyu için de son bir antimisin A ilavesi yapılması önerilir. Bu yaklaşımı kullanarak, oligomisin tedavisi FCCP tedavisinden sonra OCR'yi etkilemez. Bu yaklaşım, ilaçların sırayla eklendiği klasik kurulumla aynı mitokondriyal özelliklerin belirlenmesine izin verir (Şekil 3C)
Son olarak, IL-2 ve IL-15 sitokinlerinin etkilerinin ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinin metabolizması üzerinde farklılaştırılıp ayırt edilemeyeceği araştırıldı. Gerçekten de, IL-15 kültürlü hücreler, daha önce gösterildiği gibi1 daha yüksek maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesine sahipti1 (Şekil 4A-E). Bazal solunum ve ATP üretimi etkilenmedi. Birlikte ele alındığında, bu veriler ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinin mitokondriyal solunumunun hücre dışı akı analizörü kullanılarak başarılı bir şekilde analiz edilebileceğini göstermektedir.
Şekil 1: İnhibitörler oligomisin ve FCCP'nin ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinin titrasyonlanması sırasında ölçülen oksijen tüketim hızı (OCR). (A) oligomisinin 0-1.25 μM nihai konsantrasyondan kademeli titrasyonunda OCR. (B) FCCP'nin 0-0,5 μM nihai konsantrasyondan kademeli titrasyonunda OCR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinde hücre konsantrasyonunun OCR ölçümleri üzerindeki etkisi. (A) FCCP veya (B) Oligomisin enjeksiyonundan sonra kuyu başına 200.000 veya 400.000 hücre ile ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinin OCR ölçümleri. (C) Bazal solunum, maksimal solunum, ATP üretimi ve kuyu başına 200.000 veya 400.000 hücre kullanan insan birincil T hücrelerinin yedek solunum kapasitesi. Üç bağımsız deneyin temsilcisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mitokondriyal modülatörlerin tek veya sıralı enjeksiyonu . (A) Oligomisin ve FCCP (a,b) veya antimisin A (c)'nin tek tek enjeksiyonlar veya ardışık enjeksiyonlar olarak enjeksiyonu sırasında ve sonrasında temsili OCR ölçümleri. (B) Enjeksiyondan önce (bazal solunum) veya oligomisin veya FCCP enjeksiyonundan sonra tek enjeksiyon veya sıralı enjeksiyon olarak OCR değerleri. (C) Enjeksiyon ve ölçüm stratejisinin şematik gösterimi. Bir bağımsız deneyin temsilcisi Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumdaki farklılıklar. (A-D) Yedi gün boyunca IL-2 veya IL-15 ile kültürlenen insan primer T hücrelerinin bazal solunum, maksimal solunum, ATP üretimi ve yedek solunum kapasitesi (n=3). (E) Oligomisin veya FCCP (a) veya antimisin A (b) enjeksiyonları ile (A-D)'nin temsili grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sitokin | [Stok] | Seyreltme faktörü | [Final] | |
| Durum 1 | IL-2 | 3 x 106 U/mL | 30,000 | 100 U/mL |
| Durum 2 | IL-15 | 2 x 105 U/mL | 2,000 | 100 U/mL |
Tablo 1: T hücrelerinde metabolik değişiklikleri yönlendirmek için kullanılan sitokin kültürlerinin hazırlanması.
| Oligomisin | FCCP (Mali İşler Sözleşmesi) | |||||
| Çalışan sol. | Son conc. | Vol. | Çalışan sol. | Son conc. | Vol. | |
| Bağlantı Noktası A | 5,0 μM | 0,50 μM | 20 μL | 2,0 μM | 0,2 μM | 20 μL |
| Bağlantı Noktası B | 3,0 μM | 0,75 μM | 22 μL | 1,30 μM | 0,3 μM | 22 μL |
| C Bağlantı Noktası | 3,0 μM | 1,0 μM | 24 μL | 1,30 μM | 0,4 μM | 24 μL |
| Bağlantı Noktası D | 3,0 μM | 1,25 μM | 27 μL | 1,30 μM | 0,5 μM | 27 μL |
Tablo 2: Mitokondriyal inhibitörlerin ve modülatörlerin hazırlanması için strateji. Bir Optimizasyon çalışması için hazırlık konsantrasyonları, çalışma konsantrasyonları ve enjeksiyon stratejileri.
| Eylem | Şey | Ölçüm detayları |
| Taban çizgisi | Temel ölçümler | 3 ölçüm |
| Enjeksiyon | Port A enjeksiyonu | 3 ölçüm |
| Enjeksiyon | Port B enjeksiyonu | 3 ölçüm |
| Enjeksiyon | Port C enjeksiyonu | 3 ölçüm |
| Enjeksiyon | Port D enjeksiyonu | 3 ölçüm |
| Ölçmek | Ek ölçümler | Opsiyonel |
Tablo 3: Mitokondriyal inhibitörlerin ve modülatörlerin titrasyonunun her birinde 3 ölçümü olan 4 enjeksiyon kullanılarak yapılan bir Optimizasyon çalışmasının protokol tasarımı.
| Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon elementi | Açıklama | ||
| Bazal solunum | Bazal solunum, mitokondriyal inhibitörlerin eklenmesinden önce uyarılmış T hücreleri tarafından tüketilen oksijen oranının temel bir ölçüsüdür. Mitokondriyal proton sızıntısından kaynaklanan hücresel ATP talebini karşılamak için kullanılan oksijen tüketiminin bir ölçüsüdür. Bu nedenle, ATP sentezi ve proton sızıntısı sağlamak için üretilen proton akımına genel bir bakış sağlar. Bununla birlikte, büyüme ortamında bulunan substratlara, tahlilden önce hücrelerin uyarılmasına ve diğer dışsal faktörlere bağlı olarak değiştirilebilen bir önlemdir. Bu nedenle bazal solunum, hücrelerin hücresel metabolik durumunu etkilediğine inanılan iki veya daha fazla farklı hücre tipini ve / veya farklı tedavileri karşılaştırmak için kullanılan bir ölçüdür. Bazal solunum, herhangi bir mitokondriyal modülatör (oligomisin veya FCCP) eklenmeden önce ve antimisin A eklendikten sonra OCR'deki fark olarak hesaplanır. |
||
| Maksimum solunum | Bu ölçü, oksidatif fosforilasyon için tüketilebilecek maksimum oksijen oranıdır. Oksidatif fosforilasyon tarafından tüketilen oksijen oranı, hem elektron taşıma zincirinin iç mitokondriyal membran boyunca protonları pompalama kabiliyeti hem de ATP sentazının ADP'den ATP'yi fosforile etmek için proton gradyanını kullanma kabiliyeti ile belirlenir. ATP sentazın hızı, serbest ADP substratı ve dolayısıyla hücrenin genel enerjik durumu ile sınırlıdır. Hücreleri mitokondriyal uncoupler FCCP ile tedavi ederken, protonlar iç mitokondriyal membran boyunca serbestçe geri dönebilir. Bu, hücrelerin doymamış bir enerji talebi yaşadığı bir durumu taklit eder ve bu nedenle maksimum solunum, elektron taşıma zinciri tarafından tüketilebilecek maksimum oksijen oranının bir ölçüsüdür. Maksimum solunum, FCCP ile tedavi edilen hücrelerin OCR'sindeki fark ve antimisin A ile tedavi edilen hücreler olarak hesaplanır. |
||
| ATP cirosu | ATP'ye bağlı solunum, oligomisin kullanılarak ATP sentazının inhibisyonundan sonra OCR'deki fark olarak ölçülür. Aksi takdirde oksidatif fosforilasyon ile ADP'nin fosforilasyonu için tüketilecek olan oksijen, bu işlem durdurulduğu için artık kullanılmayacaktır. ATP'ye bağlı solunum bu nedenle oksidatif fosforilasyon tarafından üretilen ATP'ye göredir. AT'ye bağlı solunumdaki değişiklikler, mitokondrinin hücrenin değişmiş ATP talebine verdiği bir cevaptır. ATP'ye bağlı solunum, herhangi bir mitokondriyal modülatör (oligomisin veya FCCP) eklenmeden önce ve oligomisin eklendikten sonra OCR'deki fark olarak hesaplanır. |
||
| Yedek solunum kapasitesi | Yedek solunum kapasitesi, artan enerjik talebe yanıt olarak ATP üretmek için teorik bir ekstra kapasitenin bir ölçüsüdür. Bazal solunum ile maksimal solunum arasındaki fark olarak tanımlanır. Yedek solunum kapasitesindeki değişiklikler, mitokondriyal ve hücre zindeliğinin ve esnekliğinin bir göstergesi olabilir. | ||
Tablo 4: Akı analizörü kullanılarak incelenen mitokondriyal solunumun çeşitli bileşenlerinin açıklaması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oksidatif fosforilasyonun ayrıntılı ve doğru bir şekilde ölçülmesi, T hücrelerinin enerji durumlarını tanımlarken vazgeçilmez bir araçtır. Mitokondriyal uygunluk durumu, T hücresi aktivasyon potansiyeli, sağkalım ve farklılaşma ile doğrudan ilişkili olabilir1,5. Bu protokolle, oksidatif fosforilasyonun çeşitli özelliklerini belirlemek mümkündür (ayrıntılı bir açıklama için Tablo 4'e bakınız). Oksidatif fosforilasyonun bu özelliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesi, T hücrelerinin enerji durumları hakkında ayrıntılı bir fikir verir. Bununla birlikte, güvenilir sonuçlar elde etmek için, deneyi kurarken büyük özen gösterilmelidir.
Bu protokolde, aşağıdaki üç optimizasyon adımı, önce hücre numaralarının optimizasyonu önerilir. Bir akı analizörünün oksijen konsantrasyonlarını doğru bir şekilde ölçme kabiliyeti bir sigmoid eğrisini takip eder; oksijendeki çok küçük veya çok büyük değişiklikler makinenin çalışma aralığının dışına düşecek ve bu nedenle doğru şekilde ölçülmeyecektir. Bu, tüm deney boyunca kullanılacak hücre sayılarının optimizasyonunu gerektirir. Çok az hücre analiz edilirse, oksijen tüketimindeki değişiklikler doğru bir şekilde ölçülemeyecek kadar düşüktür. Çok fazla hücre varsa, tahlil ortamında oksijen tükenmesi riski vardır. Bu nedenle, hücre numaraları kuyu başına 100.000-400.000 hücre arasında değişen bir ilk çalıştırma önerilir. Hücre sayısını bazal solunuma karşı çizerken, optimal hücre sayısı eğrinin doğrusal aralığında olacaktır. Kurulumu optimize ederken, lütfen istirahat ve aktif hücreler arasında mitokondriyal aktivitede üstel bir fark olabileceğini ve bu nedenle buna göre optimize edilmesi gerektiğini unutmayın.
İkincisi, inhibitör konsantrasyonlarının titrasyonlanması. Hücreleri oligomisin ve FCCP ile tedavi ederken, kullanılacak inhibitörlerin optimal konsantrasyonlarını belirlemek önemlidir. Çok düşük bir konsantrasyon, optimal olmayan bir inhibisyona ve mitokondriyal solunumun yanlış ölçülmesine neden olacaktır. İnsanların tam bir inhibisyon elde edilmesini sağlamak için inhibitörlerin önerilen en yüksek konsantrasyonlarını kullanmaları yaygındır. Bu aynı zamanda sorunludur, çünkü inhibitörlerin çok yüksek konsantrasyonları pleiotropik etkilere sahip olabilir. FCCP gibi uncoupler'lar da mitokondriyal dışındaki membranlar üzerindeki etkilerini gösterir, bu da plazma membran depolarizasyonu, mitokondriyal inhibisyon ve sitotoksisite dahil olmak üzere bir dizi istenmeyen etkiye neden olur. Bu protokolde, oligomisin ve FCCP'nin titrasyonlanması, hücre sayısı optimizasyonu ile aynı anda yapılır. Bir optimizasyon çalışması sırasında, mevcut dört substrat portu kullanılarak artan oligomisin veya FCCP konsantrasyonları eklenir. Elde edilen OCR diyagramında, optimum konsantrasyon, OCR'nin sabit bir platoya ulaştığı konsantrasyon olarak görsel olarak belirlenebilir. Oligomisin ve FCCP konsantrasyonu titredildikten sonra, bu konsantrasyonlar deney boyunca kullanılmalıdır.
Üçüncüsü, inhibitörlerin sıralı ve tek bireysel eklenmesi. Klasik Denizatı tahlilleri tipik olarak ilk oligomisinin sıralı olarak eklenmesi ve ardından FCCP'nin eklenmesiyle gerçekleştirilir. T hücrelerinde ve diğer hassas hücrelerde, böyle bir sıralı ekleme, maksimum solunumun hatalı bir şekilde ölçülmesine neden olabilir. Buna karşılık, ölçülen yedek solunum kapasitesi seviyeleri olduklarından daha düşük rapor verecektir. Bunun ciddi örnekleri, negatif olan yedek solunum kapasitesi değerlerini içerir. Bu, elbette, biyolojik olarak mümkün değildir ve oligomisin tedavisi ile mitokondrinin ön duyarlılaştırılmasından kaynaklanır. Bu protokolde, hücrelerin sadece oligomisin veya FCCP ile tedavi edilmesi önerilir (açıklayıcı karşılaştırma için Şekil 3C'ye bakınız).
Son olarak, bu optimize edilmiş protokol, IL-15 takviyeli insan birincil T hücre kültürlerinin, mitokondriyal solunumlarına dayanarak IL-2 takviyeli hücrelerden nasıl açıkça ayırt edilebileceğini göstermek için kullanılır. IL-15 kültürlü hücreler daha yüksek maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesine, hafıza T hücrelerine bağlı metabolik bir duruma sahiptir1,6. Bu gözlemler, IL-15'i bellek T hücre alt kümelerine8 bağlayan önceki çalışmalarla uyumludur. Ek olarak, IL-2 kültürlü hücrelere kıyasla bazal solunumda bir fark gözlendi, ancak ATP üretiminde bir fark gözlenmedi. Bu, bu hücrelerin glikolitik kapasitelerini, daha farklılaşmış hücrelerle ilişkili bir yol olan bazal metabolik taleplere uymak için kullandıklarını gösterir. Birlikte ele alındığında, IL-15 takviyesi kullanılarak bir insan hafızası T hücre modelinin in vitro olarak kurulabileceği gösterilmiştir. Hafıza hücrelerinin gelişimini teşvik etmek için IL-15 bakımından zengin bir ortamın kullanılması daha önce gösterilmiştir ve bulguları daha da desteklemektedir8.
Bu yöntemde, OxPhos'un özelliklerini ölçmek için oligomisin, FCCP ve antimisin A kullanılmıştır. Diğer bileşikler, potansiyel olarak T hücreleri için daha uygun olacak benzer etkilere sahiptir. Bir örnek, mitokondriyal membranın depolarizasyonunu azaltmak ve sitotoksisiteyi önlemek için FCCP yerine uncoupler BAM15'i kullanmak olacaktır9. Bu yöntemde, oligomisin, FCCP ve antimisin A, son on yıldır Denizatı deneyleri için önerilen mitokondriyal modülatörler olduğu için bu bileşikler dikkate alınmamıştır. Bu nedenle bu bileşiklerin kullanımı, gözden geçirenler ve OxPhos ile çalışan diğer araştırmacılar tarafından tanınmaktadır. Denizatı akısı analizörünün daha deneyimli kullanıcılarının bu alternatif bileşikleri kullanmaları teşvik edilir, ancak bunların kullanımı bu makalenin kapsamı dışındadır.
Mitokondriyal OxPhos'un izlenmesi, T hücresi fonksiyonunu anlamak ve kanser immünoterapilerini geliştirmek için önemli bir araçtır. Daha önce de belirtildiği gibi, IL-15 genişlemiş hücrelerinin - daha az farklılaşmış bir hafıza fenotipine sahip - daha az tükenmiş oldukları ve artmış bir antitümör aktivitesine sahip oldukları için CAR T hücre tedavilerine yanıtları iyileştirdiği gösterilmiştir10. Bu optimize edilmiş protokol, hem klinik öncesi hem de klinik ortamlarda T hücrelerinin kalitesini incelemek için etkili bir araç olabilir. Sonuç olarak, bu protokol, ex vivo kültürlü insan primer T hücrelerinin metabolik tahlillerde kullanımı için hücre sayılarını ve inhibitör konsantrasyonlarını optimize etmek için adımlar uygulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Kasper Mølgaard ve Anne Rahbech, Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat'tan hibe aldı. Kasper Mølgaardayrıca Børnecancerfonden'den hibe aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath--new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
