Summary
成年蚊子唾液腺（SG）是将所有蚊子传播的病原体（包括病毒和寄生虫）传播给人类宿主所必需的。该视频演示了从幼虫（L4）阶段冈 比亚按蚊 中有效分离SG以及L4 SGs的制备以进行进一步分析。
Abstract
蚊子唾液腺（SGs）是传播昆虫传播病原体的必要门户器官。致病因子，包括病毒和引起疟疾的疟原虫寄生虫，积聚在SG细胞的分泌腔中。在这里，它们准备在随后的血粉中传播给脊椎动物宿主。由于成虫腺体形成为幼虫SG导管芽残留物的形成，这些残余物持续存在于早期蛹SG组织分析之后，因此幼虫SG是限制疾病传播的干预措施的理想靶标。了解幼虫SG的发育有助于更好地了解其形态和功能适应性，并有助于评估针对该器官的新干预措施。该视频实验方案展示了一种有效的技术，用于从 冈比亚按蚊中 分离，固定和染色幼虫SG。在25%乙醇溶液中从幼虫中解剖的腺体固定在甲醇 - 冰醋酸混合物中，然后进行冷丙酮洗涤。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗几次后，可以用广泛的标记染料和/或抗血清对SG表达的蛋白质进行SG染色。这种用于幼虫SG分离的方法也可用于收集组织，用于 原位 杂交分析，其他转录组学应用和蛋白质组学研究。
Introduction
疟疾是一项重大公共卫生威胁，2019年造成近2.3亿人感染，估计有40.9万人死亡1。大多数死亡发生在撒哈拉以南非洲，是由寄生虫恶性疟原虫引起的，其昆虫载体是冈比亚按蚊，这是本视频演示的主题。尽管这些数字表明，自世纪之交以来，年死亡率大幅下降（年死亡人数减少了30万>），但从2000年到2015年观察到的疾病发病率的有希望的下降正在逐渐减少，这表明需要采取新的方法来限制疾病传播2。控制和可能消除疟疾的有希望的额外策略之一是使用基于CRISPR / Cas9的基因编辑和基因驱动3，4，5来靶向蚊子媒介的能力。事实上，以蚊媒为目标（通过扩大使用经杀虫剂处理的长效蚊帐）对减少疾病传播产生了最大的影响6。
雌性蚊子在血粉期间从受感染的人类那里获得疟原虫配子体。在受精，成熟，中肠上皮穿越，种群扩张和专性蚊子宿主的血细胞导航之后，数百至数万个疟原虫孢子体侵入蚊子SG并填充组成分泌细胞的分泌腔。一旦进入分泌腔，寄生虫就可以直接进入唾液管，因此准备在下一次血粉时传播给新的脊椎动物宿主。由于SGs对于致疟疾孢子体传播给人类宿主至关重要，并且实验室研究表明SGs对于血液喂养，蚊子存活或繁殖力不是必需的7，8，9，它们代表了阻断传播措施的理想目标。成虫SGs是幼虫SGs中"导管芽"残留物的形成，持续超过早期蛹SG组织分析10，使幼虫SG成为限制成虫期疾病传播的理想目标。
表征SG发育的幼虫阶段不仅有助于更好地了解其形态和功能适应性，还可以帮助评估通过关键SG调节因子的基因编辑靶向该器官的新干预措施。由于先前所有关于幼虫唾液腺结构的研究都早于免疫染色和现代成像技术10，11，我们已经开发出一种用各种抗体和细胞标志物分离和染色唾液腺的方案12。本视频演示了从冈比亚按蚊L4幼虫中提取，固定和染色幼虫SGs以进行共聚焦成像的方法。
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Protocol
1. 准备解决方案和工具
- 解剖液的制备
- 为了制备解剖溶液，在15个塑料管中加入2.5mL的100%乙醇到7.5mL蒸馏H2O中。倒置管子3次混合。
注意：该溶液可以在室温下储存数周。
- 为了制备解剖溶液，在15个塑料管中加入2.5mL的100%乙醇到7.5mL蒸馏H2O中。倒置管子3次混合。
- 制备10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）储备
- 要制备10x PBS储备液，将17.8克Na2HPO4• 2H2O，2.4克KH2PO4，80克NaCl和2克KCl加入800毫升去离子水中。在搅拌板上与搅拌棒混合，直到固体完全溶解。用纯净水将最终体积调节至1升。
注意：该溶液可以在室温下储存数月。
- 要制备10x PBS储备液，将17.8克Na2HPO4• 2H2O，2.4克KH2PO4，80克NaCl和2克KCl加入800毫升去离子水中。在搅拌板上与搅拌棒混合，直到固体完全溶解。用纯净水将最终体积调节至1升。
- 准备 1 个 PBS
- 在无菌玻璃瓶中加入10 mL 10x PBS到90 mL H2O中。盖上盖子，倒置3倍以混合。
注意：该溶液可以在4°C下储存数周。
- 在无菌玻璃瓶中加入10 mL 10x PBS到90 mL H2O中。盖上盖子，倒置3倍以混合。
- 准备固定剂。
- 向200μL冰醋酸中加入600μL甲醇。使解决方案每次都保持新鲜。
- 油灰板（填充硅橡胶的组织培养皿）的构造
- 将环氧树脂（1克）和水（50毫升）的成分（1：50）混合，然后将混合物倒入培养皿中。使用前请等待组件干燥。
注意：一旦建成，腻子板可以使用多年。
- 将环氧树脂（1克）和水（50毫升）的成分（1：50）混合，然后将混合物倒入培养皿中。使用前请等待组件干燥。
2. 腺体解剖（图1A）
- 收集晚期L4幼虫（孵化后约10天; 图 2）从使用塑料移液器的进料托盘。
注意：请参阅此有用的在线手册，了解标准蚊子饲养和幼虫培养13。- 将腻子板放在解剖显微镜的载物台上，并将幼虫转移到腻子板上。
注意：当等分幼虫进行初始解剖时，使用塑料转移移液器一次将约10个幼虫转移到载玻片上是有帮助的。
- 将腻子板放在解剖显微镜的载物台上，并将幼虫转移到腻子板上。
- 将一滴解剖液（1：3 EtOH：H2O）滴到腻子板上，与10个幼虫分开。
- 使用塑料转印移液器或一次性玻璃移液器将一个L4幼虫放入25%EtOH滴剂中。
- 取镊子（#5），每只手一个，用非惯用手握住幼虫的头部。使用惯用手，用镊子抓住头部正下方的幼虫，并以最小的恒定力轻轻拉动，使头部与身体的其他部分分离，腺体仍然附着在头部。丢弃幼虫尸体的身体部分。
注意：解剖时，在附近设置一张纸巾以收集幼虫尸体。 - 将头/腺体收集到1.5 mL微量离心管中的1mL 1x PBS中。使用 1 mL PBS 治疗约 40 个带有连接头的解剖腺体。等待磁头/SG沉入缓冲区的底部。
3. 抗体染色固定（图1B）
- 使用玻璃转印移液管从微量离心管的顶部开始排出PBS，避免粘性蚊子组织，并尽可能多地去除PBS溶液而不会损坏组织。用800μL甲醇与冰醋酸的3：1混合物代替溶液。将管置于4°C过夜（推荐12-24小时;优选19小时）。
- 第二天，沥干溶液，并用1毫升冷的100%丙酮代替。静置 90 秒。
- 取出丙酮，轻轻冲洗组织三次，每次用1毫升1x PBS。
注意：样品应随流量缓慢漂浮，然后在每次PBS添加完成时落回管的底部。
4. 免疫染色（图1B）
- 以适当的稀释度（1：100）加入一抗（例如Rab11）在1x PBS总体积的200μL中。用移液器吸头轻轻旋转试管内容物。在4°C下孵育过夜。
- 取出一抗溶液，用1 mL 1x PBS洗涤三次（轻轻移液移入和移出移液器）。
- 在200μL总体积的适当稀释（1：200）下加入二抗（Alex Fluor 488 Goat抗兔）。用移液器吸头轻轻旋转试管内容物。在室温下孵育90分钟。
- 在此阶段，将染料（如尼罗红（脂质，5 μL 1 μg/μL）和/或Hoechst（DNA，3 μL 1 μg/μL）加入200 μL PBS中。在室温下再孵育60分钟。用 1 次 PBS 轻轻清洗三次。
5. 安装染色腺体进行显微镜检查（图1C）
- 将200μL100%甘油移液到显微镜载玻片上。
注意：由于甘油是粘稠的，请将移液器吸头留在液体中，直到达到适当的体积。当直接进入100%甘油时，没有观察到组织收缩。然而，研究人员可以在将样品移动到100%甘油之前在管中洗涤30%和50%的甘油。 - 使用软刷将带有连接的腺体（以及其他内部结构）的染色头（每张载玻片最多20个）转移到显微镜载玻片上（图3A）。将样品摊开，使其沿着载玻片均匀分布。
注意：当用刷子将腺体沉积在盖玻片上时，可以使用镊子轻轻地定向SG，使它们都朝向同一方向。 - 在解剖显微镜下观察，使用两对镊子将幼虫头部与腺体分开，并小心地将两个组织向相反的方向拉动。
注意：由于完全隔离SG具有挑战性，因此只需移除头部，留下SG和相关的内部结构即可。即使SG仍然与其他组织相关，当用Hoechst和其他标记物染色时，它们也很容易被识别（图3B，C）。 - 取出并丢弃磁头，并重复每个SG的分离过程。
注意：取下磁头时，请在附近设置一张纸巾以收集它们。 - 轻轻地将1.5毫米厚的盖玻片放在顶部（避免气泡），并用透明的指甲油密封。
- 储存在4°C的防光容器中。
注意：准备好的染色腺体载玻片可以在黑暗中保持在4°C长达六个月至一年，质量没有任何显着变化。如果甘油随着时间的流逝开始泄漏，请轻轻抬起盖玻片并移入更多的甘油以填充孔洞。
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Representative Results
唾液腺相对容易从所有4期幼虫中解剖。雄性和雌性幼虫可以在L4幼虫晚期通过沿着雌性而不是雄性的背胸的红色条纹来区分（图2）。我们还观察到，雄性L4幼虫的触角形态比雌性L4幼虫更精细（图2），类似于在成年蚊子中观察到的这种结构的差异。随着L4阶段相当大的整体生长，唾液腺在L412期间也形成一个管腔。从早期L4期幼虫中分离出的唾液腺用Hoechst染色，显示近端和远端叶被狭窄的收缩分开（图3B，C）。形成的管腔将从最近端的唾液管（未显示）一直延伸到远端叶。形成的腔可以在中晚期L4幼虫的免疫染色的远端唾液腺中看到（图4）。形成腔周围的分泌细胞的顶端结构域具有强烈的尼罗河红染色（图4B，C），提示微绒毛样结构。在靠近顶端表面的地方还观察到Rab11染色（图4C，D，箭头）。Rab11定位于顶端回收内体。Rab11染色也沿着腺体的基底表面积聚，由于基底膜的粘性，这是一种人工制品。类似的背景染色在幼虫和成年唾液腺的免疫染色中很常见，并且已被误认为是真正的信号。
图1：从腺体解剖到载玻片制备的免疫染色过程的卡通可视化。 缩写： SGs = 唾液腺;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;MeOH = 甲醇;DAPI = 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚;Abs = 抗体;LH = 左手;RH = 右手。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：雄性和雌性L4期按蚊幼虫（A，B）早期L4幼虫。（C， D）晚期L4幼虫。在L4阶段有相当大的增长。雌性（A，C）被描述为在雄性（B，D）中不存在的胸背（C;黑色箭头）具有明显的红色条纹，但它们的触角也远不如L4早期和晚期的雄性幼虫那么精致（褶边）（放大图像中的白色箭头）。比例尺 = 1 mm。请单击此处查看此图的放大版本。
图3：早期L4唾液腺（A）早期L4雌性幼虫头，唾液腺和其他内脏器官仍然附着。勾勒出唾液腺。比例尺 = 50 μm. （B， C） 用Hoechst染色的分离幼虫腺体。（B）合并了荧光和Nomarski图像，显示了近端和远端叶的形状以及细胞核中的蓝色Hoechst染色。（C） Hoechst荧光图像仅突出显示细胞核。底部面板中的比例尺 = 20 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
图4：免疫染色的远端L4唾液腺（A）腺体已被Hoechst（核DNA，蓝色）和（B）尼罗河红（膜标志物，红色）染色;免疫染成Rab11（顶端循环囊泡，绿色）（C）。（D） 合并的图像。请注意，在所示的阶段（B-D）中存在流明。C和D中的箭头指向与合并中的尼罗河红阳性囊泡染色重叠的顶端表面附近预期的囊泡的 Rab11 染色（白色箭头）。还观察到基底表面周围的非特异性背景染色（星号），这是在幼虫和成年唾液腺中观察到的常见背景类型。比例尺 = 20 μm。请单击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本文中描述的方案改编自果蝇SG解剖方案和成年蚊子解剖方案14、15、16。然而，当使用成人解剖和SG染色方法时，大多数标志物没有穿透基底膜（数据未显示）。成人方案的适应性包括在25%EtOH溶液中解剖腺体，用MeOH和冰醋酸的组合洗涤腺体，以及进行90s丙酮洗涤。在最初的成人方案中，在1xPBS14，15，16中解剖成年SG。在25%EtOH溶液中解剖有助于保存SG并防止染色期间的损伤。在进行初始解剖时，最容易定位幼虫SGs，头部面向非优势手并让优势手轻轻向外拉（因为幼虫非常积极地移动）。通过用MeOH：冰醋酸溶液洗涤腺体而改善的组织渗透表明，幼虫SG基底膜和/或细胞质膜中的脂质含量与成虫SG的脂质含量不同。90 s 丙酮洗涤提高了腺体成像的清晰度。虽然固定期建议至少为19小时（过夜），但较长的固定期同样有效。
SGs的形态可以有很大差异，这取决于幼虫在2天长的L4阶段何时被解剖。在早期的L4解剖（第1天）中，管腔看起来要小得多12。在L4解剖晚期（第2天的下半部分），管腔很大，细胞伸长。我们发现与幼虫一起工作的最佳时期是L4;L1-L3 SG对于手动解剖来说太小了。在成像结果中，在L4中后期解剖的腺体显示较小的细胞与较大的横向细长细胞混合，特别是在远端囊中。
以前关于按蚊SG发展的报告为目前的研究提供了许多指导。这些报告包括解剖胚胎和幼虫SGs17，18，解剖腺体的详细显微镜分析19，20和转录组学研究20，21，22的插图。斯蒂芬西按蚊SG的特征在1950年代由两个不同的组10，11报道。描述了幼虫腺的许多形态学特征，包括SG的整体组织，器官内不同细胞类型的相对位置（导管，成虫SG前体以及幼虫近端和远端分泌囊）10，11。两组还报告了额外的形态测量数据，包括每个囊内分泌细胞的数量和分布以及它们的核大小10，11。瑞诗凯诗表明，与果蝇幼虫SG一样，来自按蚊的幼虫SG染色体被多烯化10。这些重要的基础概述描述了幼虫按蚊SGs的广泛生物学方面。
本文中描述的方法不仅可用于研究 冈比亚 蚊的幼虫SGs，而且还可用于研究其他种类的蚊子。事实上，同样的方案已经成功地用于（未发表 ）An. stephensi，一个经常在实验室研究的物种。该协议的一个局限性是专门针对蚊子蛋白产生的抗体数量有限。虽然使用果蝇抗体治疗高度保守的蛋白质已经绕过了这一限制12，但该领域可以从更多的蚊子蛋白特异性抗体中受益。了解幼虫SG细胞和分子生物学有助于新的控制或靶向策略，并允许发现用于SG破坏的新候选靶基因。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢约翰霍普金斯疟疾研究所获取和饲养 冈比亚 锥虫幼虫。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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