בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.
בלוטות רוק יתושים (SGs) הן איבר שער נדרש להעברת פתוגנים המועברים על ידי חרקים. סוכנים הגורמים למחלות, כולל וירוסים וטפילי פלסמודיום הגורמים למלריה, מצטברים בחללי ההפרשה של תאי SG. כאן, הם מוכנים לשידור למארחים החולייתיים שלהם במהלך ארוחת דם לאחר מכן. כמו בלוטות למבוגרים טופס כמו פירוט של שאריות ניצן צינור SG זחלים הנמשכים מעבר היסטוליזה SG pupal מוקדם, זחל SG הוא יעד אידיאלי להתערבויות המגבילים את העברת המחלה. הבנת פיתוח הזחלים SG יכולה לעזור לפתח הבנה טובה יותר של המורפולוגיה וההתאמות התפקודיות שלה ולסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה. פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקה יעילה לבידוד, תיקון והכתמת SGs זחלים מיתושי אנופלס גמביה. בלוטות ניתחו מזחלים בתמיסת אתנול 25% קבועים בתערובת חומצה אצטית מתנול-קרחוני, ואחריה שטיפת אצטון קרה. לאחר כמה שטיפות מלוחות פוספט (PBS), SGs יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של צבעי סמן ו / או אנטיזרים נגד חלבונים מבוטאים SG. שיטה זו לבידוד זחל SG יכול לשמש גם כדי לאסוף רקמה עבור ניתוח הכלאה במקום, יישומים שעתוק אחרים, ומחקרים פרוטאומיים.
מלריה היא איום גדול על בריאות הציבור הגורמת לכמעט 230 מיליון זיהומים וכ -409,000 מקרי מוות בשנת 20191. רוב מקרי המוות הם באפריקה שמדרום לסהרה והם נגרמים על ידי הטפיל פלסמודיום פאלציפארום, אשר וקטור החרקים שלו הוא אנופלס גמביה, הנושא של הדגמת וידאו זו. למרות שהמספרים מצביעים על ירידה משמעותית בשיעור התמותה השנתי מאז תחילת המאה (>300,000 פחות מקרי מוות שנתיים), הירידה המבטיחה בשיעורי המחלות שנצפו בין השנים 2000 ל -2015 מתחדדת, מה שמצביע על הצורך בגישות חדשות להגבלת העברת המחלה2. בין אסטרטגיות נוספות מבטיחות לשליטה ואולי חיסול מלריה הוא מיקוד קיבולת וקטור יתושים באמצעות CRISPR / Cas9 מבוסס עריכת גנים וכונןגנים 3,4,5. ואכן, זה מיקוד של וקטור יתוש (באמצעות שימוש מורחב של כילות הקשורות קוטלי חרקים לאורך זמן) כי יש את ההשפעה הגדולה ביותר על הפחתת העברת המחלה6.
נקבות יתושים רוכשות גמטוציטים מפלסמודיום מאדם נגוע במהלך ארוחת דם. לאחר הפריה, התבגרות, חציית אפיתל midgut, התרחבות האוכלוסייה, וניווט hemocoel המארחים יתושים מחויב שלהם, מאות עד עשרות אלפי sporozoites פלסמודיום לפלוש SGs יתוש ולמלא את חללי הפרשה של תאי הפרשה המרכיבים. ברגע שהם בתוך חללי ההפרשה, לטפילים יש גישה ישירה לצינור הרוק ולכן הם צפויים להעביר למארח בעל חוליות חדש על ארוחת הדם הבאה. מכיוון ש-SGs הם קריטיים להעברת ספורוזויטים הגורמים למלריה למארחים האנושיים שלהם, ומחקרי מעבדה מראים כי SGs אינם חיוניים להאכלת דם, הישרדות יתושים או פוריות7,8,9, הם מייצגים יעד אידיאלי לאמצעי חסימת שידור. SGs יתוש מבוגר טופס כהרחבה של “ניצן צינור” שרידים SGs זחל הנמשכים מעבר מוקדם SG היסטוליזה10, מה שהופך את זחל SG יעד אידיאלי להתערבויות כדי להגביל את העברת המחלה בשלב למבוגרים.
אפיון השלב הזחלי של פיתוח SG יכול לעזור לפתח לא רק הבנה טובה יותר של המורפולוגיה שלה והתאמות פונקציונליות, אלא גם יכול לסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה באמצעות עריכת גנים של רגולטורים מרכזיים של SG. כי כל המחקרים הקודמים של ארכיטקטורת בלוטת הרוק זחל קדמו חיסוני וטכניקות הדמיה מודרניות10,11, פיתחנו פרוטוקול לבידוד והכתמת בלוטות רוק עם מגוון של נוגדנים וסמני תאים12. וידאו זה מדגים גישה זו להפקה, קיבעון, והכתמה של SGs זחל מ זחלי אנופלס גמביה L4 עבור הדמיה קונפוקלית.
הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפרוטוקול ניתוח Drosophila SG ופרוטוקול ניתוח יתושיםלמבוגרים 14,15,16. עם זאת, רוב הסמנים לא חדרו את קרום המרתף (נתונים לא הראו) בעת שימוש בשיטות הניתוח למבוגרים והכתמת SG. התאמות של הפרוטוקול למבוגרים כללו לנתח את הבלוטו?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות למכון ג’ונס הופקינס לחקר המלריה על הגישה והגידול של זחלי א. גמביה.
KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |