Summary
A glândula salivar de mosquito adulto (SG) é necessária para a transmissão de todos os patógenos transmitidos por mosquitos para seus hospedeiros humanos, incluindo vírus e parasitas. Este vídeo demonstra o isolamento eficiente das OGs do estágio larval (L4) dos mosquitos Anopheles gambiae e a preparação dos SGs L4 para análise posterior.
Abstract
As glândulas salivares de mosquitos (OG) são um órgão de entrada necessário para a transmissão de patógenos transmitidos por insetos. Agentes causadores de doenças, incluindo vírus e parasitas do Plasmodium que causam malária, se acumulam nas cavidades secretas das células SG. Aqui, eles estão prontos para transmissão para seus hospedeiros vertebrados durante uma refeição sanguínea subsequente. À medida que as glândulas adultas se formam como uma elaboração de restos de brotos de sg larval que persistem além da histolise da SG pupal precoce, a SG larval é um alvo ideal para intervenções que limitam a transmissão da doença. Compreender o desenvolvimento de SG larval pode ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de sua morfologia e adaptações funcionais e auxiliar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão. Este protocolo de vídeo demonstra uma técnica eficiente para isolar, fixar e colorir os GGs larvais dos mosquitos Anopheles gambiae. As glândulas dissecadas de larvas em uma solução de 25% de etanol são fixadas em uma mistura de ácido acético metanol-glacial, seguida por uma lavagem de acetona fria. Depois de algumas enxaguadas em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), as SGs podem ser manchadas com uma ampla gama de corantes marcadores e/ou antisera contra proteínas expressas por SG. Este método para o isolamento de SG larval também poderia ser usado para coletar tecidos para análise de hibridização in situ, outras aplicações transcriômicas e estudos proteômicos.
Introduction
A malária é uma grande ameaça à saúde pública que causa quase 230 milhões de infecções e cerca de 409 mil mortes em 20191. A maioria das mortes está na África subsaariana e são causadas pelo parasita Plasmodium falciparum, cujo vetor de insetos é Anopheles gambiae, o tema desta demonstração de vídeo. Embora os números indiquem uma queda significativa na taxa anual de mortalidade desde a virada do século (>300.000 mortes anuais a menos), as reduções promissoras nas taxas de doença observadas de 2000 a 2015 estão diminuindo, sugerindo a necessidade de novas abordagens para limitar a transmissão da doença2. Entre as estratégias adicionais promissoras para controlar e possivelmente eliminar a malária está a capacidade de vetores de mosquitos usando a edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 e unidade genética3,4,5. De fato, é o direcionamento do vetor de mosquitos (através do uso expandido de redes de cama tratadas com inseticida de longa duração) que teve o maior impacto na redução da transmissão da doença6.
Mosquitos fêmeas adquirem gametocitos de Plasmodium de um humano infectado durante uma refeição de sangue. Após fertilização, maturação, travessia de epitélio médio, expansão populacional e navegação de hemocoel em seus obrigatórios hospedeiros de mosquitos, centenas a dezenas de milhares de esporozoitas plasmodium invadem os mosquitos SGs e preenchem as cavidades secretas das células secretas constituintes. Uma vez dentro das cavidades secretas, os parasitas têm acesso direto ao ducto salivar e, portanto, estão preparados para a transmissão para um novo hospedeiro vertebrado na próxima refeição sanguínea. Como os OG são fundamentais para a transmissão de esporozoitas causadores da malária para seus hospedeiros humanos, e estudos laboratoriais sugerem que os GGs não são essenciais para a alimentação sanguínea, sobrevivência de mosquitos ou fecundidade7,8,9, representam um alvo ideal para medidas de bloqueio de transmissão. Os SGs do mosquito adulto formam-se como uma elaboração de remanescentes de "brotos de ducto" nos GGs larvais que persistem além da histolise pupal10,tornando a SG larval um alvo ideal para intervenções para limitar a transmissão da doença em estágio adulto.
Caracterizar o estágio larval do desenvolvimento de SG pode ajudar a desenvolver não apenas uma melhor compreensão de suas morfologia e adaptações funcionais, mas também pode ajudar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão através da edição de genes dos principais reguladores de SG. Como todos os estudos anteriores da arquitetura das glândulas salivares larvais antecedem as técnicas modernas de imunossuagem e de imagem moderna10,11, desenvolvemos um protocolo para isolar e manchar glândulas salivares com uma variedade de anticorpos e marcadores celulares12. Este vídeo demonstra essa abordagem para a extração, fixação e coloração de GGs larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imagens confocal.
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Protocol
1. Elaboração de soluções e ferramentas
- Elaboração da solução de dissecção
- Para preparar a solução de dissecação, adicione 2,5 mL de 100% de etanol a 7,5 mL de H2O destilado em um tubo plástico de 15. Inverta o tubo 3 vezes para misturar.
NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por várias semanas.
- Para preparar a solução de dissecação, adicione 2,5 mL de 100% de etanol a 7,5 mL de H2O destilado em um tubo plástico de 15. Inverta o tubo 3 vezes para misturar.
- Preparação de estoque salino tampão de fosfato de 10x (PBS)
- Para preparar 10x de estoque PBS, adicione 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl e 2 g KCl a 800 mL de água desionizada. Misture com uma barra de mexida em uma placa de mexida até que os sólidos tenham totalmente dissolvido. Ajuste o volume final para 1 L com água purificada.
NOTA: Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por vários meses.
- Para preparar 10x de estoque PBS, adicione 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl e 2 g KCl a 800 mL de água desionizada. Misture com uma barra de mexida em uma placa de mexida até que os sólidos tenham totalmente dissolvido. Ajuste o volume final para 1 L com água purificada.
- Preparação de 1x PBS
- Adicione 10 mL de 10x PBS a 90 mL de H2O em uma garrafa de vidro estéril. Feche bem a tampa e inverta 3x para misturar.
NOTA: A solução pode ser armazenada a 4 °C por várias semanas.
- Adicione 10 mL de 10x PBS a 90 mL de H2O em uma garrafa de vidro estéril. Feche bem a tampa e inverta 3x para misturar.
- Preparação de fixação.
- Adicione 600 μL de metanol a 200 μL de ácido acético glacial. Faça a solução fresca a cada vez.
- Construção de placa de massa (um prato de cultura de tecido cheio de borracha de silicone)
- Misture os componentes (1:50) de epóxi (1 g) e água (50 mL) e despeje a mistura em uma placa de Petri. Aguarde que os componentes sequem antes de usar.
NOTA: Uma vez construído, a placa de massa pode ser usada por anos.
- Misture os componentes (1:50) de epóxi (1 g) e água (50 mL) e despeje a mistura em uma placa de Petri. Aguarde que os componentes sequem antes de usar.
2. Dissecção da glândula (Figura 1A)
- Coletar larvas L4 em estágio final (~10 dias de pós-eclosão; Figura 2) de bandejas de alimentação usando uma pipeta de transferência de plástico.
NOTA: Veja este manual on-line útil para a criação padrão de mosquitos e cultura larval13.- Coloque uma placa de massa no palco de um microscópio dissecando e transfira larvas para a placa de massa.
NOTA: Ao aliquoras larvas para dissecção inicial, é útil transferir ~10 larvas para o slide ao mesmo tempo usando uma pipeta de transferência de plástico.
- Coloque uma placa de massa no palco de um microscópio dissecando e transfira larvas para a placa de massa.
- Coloque uma gota de solução de dissecção (1:3 EtOH:H2O) na placa de massa, separada das 10 larvas.
- Use uma pipeta de transferência de plástico ou pipeta de vidro descartável para colocar uma larva L4 na gota de 25% de EtOH.
- Pegue fórceps (#5), um em cada mão, e com a mão não dominante, segure a cabeça da larva. Usando a mão dominante, segure a larva com fórceps logo abaixo da cabeça e puxe suavemente com força constante mínima, de tal forma que a cabeça se desprende do resto do corpo e as glândulas permaneçam presas à cabeça. Descarte a porção do corpo da carcaça da larva.
NOTA: Ao dissecar, coloque uma toalha de papel nas proximidades para coletar as carcaças das larvas. - Colete a cabeça/glândulas em 1 mL de 1x PBS em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL. Use 1 mL de PBS para ~40 glândulas dissecadas com suas cabeças anexadas. Aguarde que as cabeças/SGs afundem no fundo do buffer.
3. Fixação para coloração de anticorpos (Figura 1B)
- Escorra o PBS a partir do topo do tubo de microcentrifuuge usando uma pipeta de transferência de vidro, evitando os tecidos pegajosos do mosquito e removendo o máximo possível da solução PBS sem danificar os tecidos. Substitua a solução por 800 μL de uma mistura de 3:1 de metanol ao ácido acético glacial. Coloque o tubo a 4 °C durante a noite (12-24 h recomendado; 19 h preferido).
- No dia seguinte, drene a solução e substitua-a por 1 mL de acetona fria 100%. Vá para os anos 90.
- Remova a acetona e enxágue suavemente os tecidos três vezes com 1 mL de 1x PBS cada vez.
NOTA: As amostras devem flutuar lentamente com o fluxo e, em seguida, cair de volta para o fundo do tubo quando cada adição de PBS estiver completa.
4. Imunostaining (Figura 1B)
- Adicione anticorpo primário (por exemplo, Rab11) na diluição apropriada (1:100) em 200 μL do volume total de 1x PBS. Gire o conteúdo do tubo suavemente com uma ponta de pipeta. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Remova a solução de anticorpos primários e lave três vezes com 1 mL de 1x PBS (tubos suavemente para dentro e para fora da pipeta).
- Adicione anticorpo secundário (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) na diluição apropriada (1:200) em 200 μL de volume total. Gire o conteúdo do tubo suavemente com uma ponta de pipeta. Incubar em temperatura ambiente por 90 minutos.
- Adicione corantes, como o Vermelho Nilo (lipídios, 5 μL de 1 μg/μL) e/ou Hoechst (DNA, 3 μL de 1 μg/μL), em 200 μL de PBS nesta fase. Incubar em temperatura ambiente por mais 60 minutos. Lave suavemente três vezes com 1x PBS.
5. Montagem de glândulas manchadas para microscopia (Figura 1C)
- Pipeta 200 μL de 100% glicerol em um slide de microscópio.
NOTA: Como o glicerol é viscoso, deixe a ponta da pipeta no líquido até atingir o volume apropriado. Não foi observado encolhimento tecidual ao ir direto para 100% glicerol. No entanto, os pesquisadores podem passar por lavagens de 30% e 50% de glicerol nos tubos antes de mover as amostras para 100% glicerol. - Transfira as cabeças manchadas (até 20 por slide) com as glândulas anexadas (juntamente com outras estruturas internas) para o slide do microscópio usando uma escova macia(Figura 3A). Espalhe as amostras para que elas sejam distribuídas uniformemente ao longo do escorregador de vidro.
NOTA: Ao depositar glândulas em um slide de cobertura com um pincel, fórceps podem ser usados para orientar suavemente os OGs para que todos sejam orientados na mesma direção. - Visualizando sob um microscópio dissecando, separe a cabeça larval das glândulas usando dois pares de fórceps e puxando cuidadosamente os dois tecidos em direções opostas.
NOTA: Como é desafiador isolar completamente os SGs, basta remover as cabeças, deixando os SGs e estruturas internas associadas. Mesmo que os OGs permaneçam associados a outros tecidos, eles são facilmente reconhecidos quando manchados com Hoechst e outros marcadores(Figura 3B,C). - Remova e descarte as cabeças e repita o processo de separação de cada SG.
NOTA: Ao remover cabeças, coloque uma toalha de papel nas proximidades para recolhê-las. - Coloque delicadamente uma tampa de 1,5 mm de espessura na parte superior (evitando bolhas de ar) e sele com esmalte claro.
- Armazene a 4 °C em um recipiente à prova de luz.
NOTA: Os slides preparados das glândulas manchadas podem ser mantidos a 4 °C no escuro por até seis meses a um ano sem quaisquer mudanças notáveis na qualidade. Se o glicerol começar a vazar com o passar dos meses, levante suavemente a mancha de cobertura e a pipeta em mais glicerol para preencher os orifícios.
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Representative Results
Glândulas salivares são relativamente fáceis de dissecar de todas as larvas estágio 4. Larvas masculinas e femininas podem ser distinguidas no estágio larval L4 tardio por uma listra vermelha ao longo do tórax dorsal das fêmeas, mas não dos machos(Figura 2). Observamos também que a morfologia antenal é muito mais elaborada no masculino do que nas larvas L4 fêmeas (Figura 2),semelhante às diferenças observadas nesta estrutura em mosquitos adultos. Juntamente com o crescimento geral considerável durante a etapa L4, as glândulas salivares também formam um lúmen durante a L412. Glândulas salivares isoladas das larvas do estágio L4 primitiva manchadas com Hoechst revelam os lobos proximais e distais separados por uma constrição estreita(Figura 3B,C). O lúmen formador se estenderá até o duto salivar na extremidade proximal (não mostrada) através do lobo distal. O lúmen formador pode ser visto na glândula salivar distal imunostida de uma larva L4 de médio a final(Figura 4). Os domínios apical das células secretas ao redor do lúmen formador têm uma intensa coloração vermelha do Nilo (Figura 4B,C) sugestiva de estruturas semelhantes a microvilli. Também observada perto da superfície apical está a coloração de Rab11(Figura 4C, D, setas). Rab11 se localiza para endosso de reciclagem apical. A mancha de Rab11 que também se acumula ao longo da superfície basal da glândula é um artefato devido à pegajosa da membrana basal. Manchas de fundo semelhantes são comuns com a imunossuagem de glândulas salivares larval e adulta e foi confundida com sinal de boa fé.
Figura 1: Visualização de desenho animado do processo de imunossuagem da dissecção da glândula através da preparação de slides. Abreviaturas: SGs = glândulas salivares; PBS = soro fisiológico tamponado por fosfato; Meoh = metanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; Abs = anticorpos; LH = mão esquerda; RH = mão direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Larvas anopheles gambaie de estágio L4 masculino e feminino. (A, B) Larvas L4 precoces. (C, D) Larvas L4 tardias. Há um crescimento considerável durante a fase L4. As fêmeas (A, C) têm sido descritas como tendo uma distinta listra vermelha pelo tórax dorsal(C; seta preta) que não está presente nos machos(B, D),mas também suas antenas são muito menos elaboradas (fofas) do que as larvas masculinas do início e do final da L4 (setas brancas em imagens ampliadas). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Glândulas salivares L4 precoces. (A) Cabeça larval feminina L4 precoce com glândulas salivares e outros órgãos internos ainda ligados. A glândula salivar está delineada. Barra de escala = 50 μm. (B, C) Glândulas larvais isoladas manchadas com Hoechst. (B) Mesclagem de imagens fluorescentes e nomarski mostrando a forma dos lobos proximal e distal e a coloração azul hoechst em núcleos. (C) A imagem fluorescente hoechst destaca apenas os núcleos. Barra de escala nos painéis inferiores = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A glândula salivar de distal L4 imunostimentado. (A) Glândula foi manchada com Hoechst (DNA nuclear, azul) e(B) Vermelho Nilo (marcador de membrana, vermelho); imunos detidas para Rab11 (vesículas de reciclagem apical, verde) (C). (D) A imagem mesclada. Note que um lúmen está presente no palco mostrado(B-D). As flechas em C e D apontam para a esperada mancha rab11 de vesículas perto da superfície apical que se sobrepõe à mancha vesicular vermelha-positiva do Nilo na fusão (setas brancas). Também é observada coloração de fundo não específica ao redor da superfície basal (asteriscos), um tipo comum de fundo observado em glândulas larval e salivar adulta. Barras de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir de um protocolo de dissecção Drosophila SG e um protocolo de dissecção de mosquitosadultos 14,15,16. No entanto, a maioria dos marcadores não penetrou na membrana do porão (dados não mostrados) ao utilizar os métodos de dissecção adulta e coloração de SG. As adaptações do protocolo adulto incluíram dissecar as glândulas em uma solução de 25% etoh, lavar as glândulas com uma combinação de MeOH e ácido acético glacial, e ter uma lavagem de acetona de 90 s. No protocolo adulto original, os SGs adultos foram dissecados em 1x PBS14,15,16. A dissecação em uma solução de EtOH de 25% ajudou a preservar os OGs e evitou danos durante os períodos de coloração. Ao realizar a dissecção inicial, foi mais fácil orientar os SGs larvais com a cabeça voltada para a mão não dominante e ter a mão dominante puxando suavemente para fora (porque as larvas são muito ativamente móveis). A melhor penetração tecidual alcançada pela lavagem das glândulas com um MeOH: solução de ácido acético glacial sugere que o conteúdo lipídico na membrana do porão da SG larval e/ou membranas plasmáticas celulares é distinto do da SG adulta. A lavagem de acetona dos anos 90 melhorou a clareza das glândulas para a imagem. Embora o período de fixação tenha sido recomendado para pelo menos 19 h (durante a noite), períodos mais longos funcionaram da forma mais eficaz.
A morfologia dos SGs pode variar muito dependendo de quando as larvas são dissecadas no estágio L4 de 2 dias. Nas dissecções L4 precoces (dia 1), o lúmen aparece muito menor12. No final das dissecções L4 (segunda metade do dia 2), o lúmen é grande, e as células são alongadas. Descobrimos que o período ideal para trabalhar com larvas era o L4; Os SGs L1-L3 são simplesmente muito pequenos para dissecções manuais. Nos resultados de imagem, as glândulas dissecadas no meio do L4 apresentaram células menores misturadas com células maiores e alongadas lateralmente, particularmente no saco distal.
Relatórios anteriores sobre o desenvolvimento de Anopheles SG forneceram muita orientação para os estudos atuais. Estes relatórios incluíram ilustrações de SGs embrionárias e larvais dissecadas17,18, análise microscópica detalhada das glândulas dissecadas19,20e estudos transcriômicos20,21,22. As características do Anopheles stephensi SG foram relatadas durante a década de 1950 por dois grupos diferentes10,11. Muitas das características morfológicas das glândulas larvais foram descritas, incluindo a organização geral do SG, as posições relativas de tipos celulares distintos dentro do órgão (ducto, precursores adultos de SG e os sacos de secreção proximal e distal larval)10,11. Ambos os grupos também relataram dados morfométricos adicionais, incluindo o número e distribuição de células secretas dentro de cada saco e seu tamanho nuclear10,11. Rishikesh mostrou que, como os Drosophila larval SGs, os cromossomos larval SG de Anopheles stephensi são politenizados10. Essas importantes visões fundamentais descreveram amplos aspectos biológicos das OSS de Anopheles larval.
O método aqui descrito deve ser útil para estudar não apenas os GGs larvais de An. gambiae, mas também pode se aplicar àqueles que estudam outras espécies de mosquitos. De fato, o mesmo protocolo tem sido utilizado com sucesso (inédito) com An. stephensi, uma espécie frequentemente estudada em laboratório. Uma limitação ao protocolo é o número limitado de anticorpos que foram especificamente gerados contra proteínas de mosquitos. Embora o uso de anticorpos de Drosophila para proteínas altamente conservadas tenha circum-navegado essa limitação12,o campo poderia se beneficiar de anticorpos mais específicos da proteína do mosquito. A compreensão da biologia celular e molecular da Larval SG pode contribuir para novas estratégias de controle ou alvo e permitir a descoberta de novos genes-alvo candidatos para a interrupção do SG.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Instituto johns Hopkins de pesquisa de malária pelo acesso e criação de larvas an. gambiae.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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