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Biology

Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des moustiques anophèles gambiens

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

La glande salivaire (SG) du moustique adulte est nécessaire pour la transmission de tous les agents pathogènes transmis par les moustiques à leurs hôtes humains, y compris les virus et les parasites. Cette vidéo démontre l’isolement efficace des SG des moustiques anophèles gambiens au stade larvaire (L4) et la préparation des SG L4 pour une analyse plus approfondie.

Abstract

Les glandes salivaires des moustiques (SG) sont un organe passerelle nécessaire à la transmission d’agents pathogènes transmis par les insectes. Les agents pathogènes, y compris les virus et les parasites Plasmodium qui causent le paludisme, s’accumulent dans les cavités sécrétoires des cellules SG. Ici, ils sont prêts à être transmis à leurs hôtes vertébrés lors d’un repas de sang ultérieur. Comme les glandes adultes se forment comme une élaboration de restes de bourgeons de canal SG larvaire qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce, la SG larvaire est une cible idéale pour les interventions qui limitent la transmission de la maladie. Comprendre le développement de la SG larvaire peut aider à mieux comprendre sa morphologie et ses adaptations fonctionnelles et aider à l’évaluation de nouvelles interventions qui ciblent cet organe. Ce protocole vidéo démontre une technique efficace pour isoler, fixer et colorer les SG larvaires des moustiques anophèles gambiens. Les glandes disséquées des larves dans une solution d’éthanol à 25% sont fixées dans un mélange méthanol-acide acétique glacial, suivi d’un lavage à froid à l’acétone. Après quelques rinçages dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les SG peuvent être colorés avec un large éventail de colorants marqueurs et / ou d’antisérums contre les protéines exprimées en SG. Cette méthode d’isolement de sg larvaire pourrait également être utilisée pour prélever des tissus pour l’analyse d’hybridation in situ, d’autres applications transcriptomiques et des études protéomiques.

Introduction

Le paludisme est une menace majeure pour la santé publique causant près de 230 millions d’infections et environ 409 000 décès en 20191. La majorité des décès se trouvent en Afrique subsaharienne et sont causés par le parasite Plasmodium falciparum,dont l’insecte vecteur est Anopheles gambiae,qui fait l’objet de cette démonstration vidéo. Bien que les chiffres indiquent une baisse significative du taux de mortalité annuel depuis le début du siècle (300 000 décès annuels de moins >), les baisses prometteuses des taux de mortalité observées de 2000 à 2015 s’estompent, ce qui suggère la nécessité de nouvelles approches pour limiter la transmission de la maladie2. Parmi les stratégies supplémentaires prometteuses pour contrôler et éventuellement éliminer le paludisme, il y a le ciblage de la capacité des moustiques vecteurs à l’aide de l’édition de gènes basée sur CRISPR / Cas9 et du forçagede gènes 3,4,5. En effet, c’est le ciblage du moustique vecteur (grâce à l’utilisation accrue de moustiquaires imprégnées d’insecticide de longue durée) qui a eu le plus grand impact sur la réduction de la transmission des maladies6.

Les moustiques femelles acquièrent des gamétocytes de Plasmodium d’un humain infecté lors d’un repas de sang. Après la fécondation, la maturation, la traversée de l’épithélium de l’intestin moyen, l’expansion de la population et la navigation de l’hémocèle chez leurs hôtes moustiques obligatoires, des centaines à des dizaines de milliers de sporozoïtes de Plasmodium envahissent les SG de moustiques et remplissent les cavités sécrétoires des cellules sécrétoires constitutives. Une fois à l’intérieur des cavités sécrétoires, les parasites ont un accès direct au canal salivaire et sont donc prêts à être transmis à un nouvel hôte vertébré lors du prochain repas sanguin. Parce que les SG sont essentiels à la transmission des sporozoïtes responsables du paludisme à leurs hôtes humains, et que des études de laboratoire suggèrent que les SG ne sont pas essentiels à l’alimentation sanguine, à la survie des moustiques ou à la fécondité7,8,9,ils représentent une cible idéale pour les mesures de blocage de la transmission. Les SG de moustiques adultes se forment comme une élaboration de restes de « bourgeons de canal » dans les SG larvaires qui persistent au-delà de l’histolyse SG nymphale précoce10, faisantde la SG larvaire une cible idéale pour les interventions visant à limiter la transmission de la maladie au stade adulte.

La caractérisation du stade larvaire du développement de la SG peut aider à développer non seulement une meilleure compréhension de sa morphologie et de ses adaptations fonctionnelles, mais peut également aider à évaluer de nouvelles interventions qui ciblent cet organe grâce à l’édition de gènes de régulateurs clés de la SG. Parce que toutes les études antérieures sur l’architecture des glandes salivaires larvaires sont antérieures à l’immunocoloration et aux techniques d’imagerie modernes10,11, nous avons développé un protocole pour isoler et colorer les glandes salivaires avec une variété d’anticorps et de marqueurs cellulaires12. Cette vidéo démontre cette approche de l’extraction, de la fixation et de la coloration des SG larvaires des larves d’Anopheles gambiae L4 pour l’imagerie confocale.

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Protocol

1. Préparation des solutions et des outils

  1. Préparation de la solution de dissection
    1. Pour préparer la solution disséquante, ajouter 2,5 mL d’éthanol à 100 % à 7,5 mL deH2Odistillé dans un tube en plastique de 15. Inverser le tube 3 fois pour mélanger.
      REMARQUE: Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs semaines.
  2. Préparation de 10x stock de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
    1. Pour préparer 10x bouillon PBS, ajouter 17,8 g de Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g de KH2PO4,80 g de NaCl et 2 g de KCl à 800 mL d’eau désionisée. Mélanger avec une barre d’agitation sur une plaque d’agitation jusqu’à ce que les solides soient complètement dissous. Réglez le volume final à 1 L avec de l’eau purifiée.
      REMARQUE: Cette solution peut être conservée à température ambiante pendant plusieurs mois.
  3. Préparation de 1x PBS
    1. Ajouter 10 mL de 10x PBS à 90 mL deH2Odans une bouteille en verre stérile. Fermez hermétiquement le couvercle et inversez 3x pour mélanger.
      REMARQUE: La solution peut être conservée à 4 °C pendant plusieurs semaines.
  4. Préparation du fixateur.
    1. Ajouter 600 μL de méthanol à 200 μL d’acide acétique glacial. Rendez la solution fraîche à chaque fois.
  5. Construction d’une plaque de mastic (un plat de culture tissulaire rempli de caoutchouc de silicone)
    1. Mélanger les composants (1:50) d’époxy (1 g) et d’eau (50 mL) et verser le mélange dans une boîte de Pétri. Attendez que les composants sèchent avant de les utiliser.
      REMARQUE: Une fois construite, la plaque de mastic peut être utilisée pendant des années.

2. Dissection des glandes (Figure 1A)

  1. Recueillir les larves L4 à un stade avancé (~ 10 jours après l’éclosion; Graphique 2) à partir de plateaux d’alimentation à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
    REMARQUE: Voir ce manuel en ligne utile pour l’élevage standard des moustiques et la culturelarvaire 13.
    1. Placez une plaque de mastic sur la scène d’un microscope à dissection et transférez les larves sur la plaque de mastic.
      REMARQUE: Lors de la citation de larves pour la dissection initiale, il est utile de transférer environ 10 larves sur la lame en même temps à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
  2. Placer une goutte de solution de dissection (1:3 EtOH:H2O) sur la plaque de mastic, séparée des 10 larves.
  3. Utilisez une pipette de transfert en plastique ou une pipette en verre jetable pour placer une larve de L4 dans la goutte d’EtOH de 25%.
  4. Prenez des pinces (#5), une dans chaque main, et avec la main non dominante, saisissez la tête de la larve. À l’aide de la main dominante, saisissez la larve avec une pince juste en dessous de la tête et tirez doucement avec une force constante minimale, de sorte que la tête se détache du reste du corps et que les glandes restent attachées à la tête. Jetez la partie du corps de la carcasse de la larve.
    REMARQUE: Lors de la dissection, placez une serviette en papier à proximité pour recueillir les carcasses de larves.
  5. Recueillir la tête ou les glandes dans 1 mL de 1x PBS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Utilisez 1 mL de PBS pour ~40 glandes disséquées avec leurs têtes attachées. Attendez que les têtes/SG s’enfoncent au fond de la mémoire tampon.

3. Fixation pour la coloration des anticorps (Figure 1B)

  1. Égouttez le PBS à partir du haut du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette de transfert en verre, en évitant les mouchoirs collants et en retirant autant de solution de PBS que possible sans endommager les tissus. Remplacer la solution par 800 μL d’un mélange 3:1 de méthanol en acide acétique glacial. Placez le tube à 4 °C pendant la nuit (12-24 h recommandé; 19 h de préférence).
  2. Le lendemain, égoutter la solution et la remplacer par 1 mL d’acétone froide à 100 %. Laisser pour 90 s.
  3. Retirez l’acétone et rincez doucement les tissus trois fois avec 1 mL de 1x PBS à chaque fois.
    REMARQUE: Les échantillons doivent flotter lentement vers le haut avec le flux, puis retomber au fond du tube au moment où chaque ajout de PBS est terminé.

4. Immunocoloration (Figure 1B)

  1. Ajouter l’anticorps primaire (p. ex. Rab11) à la dilution appropriée (1:100) dans 200 μL du volume total de 1x PBS. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette. Incuber toute la nuit à 4 °C.
  2. Retirer la solution d’anticorps primaire et laver trois fois avec 1 mL de 1x PBS (en pipetant doucement la solution à l’intérieur et à l’extérieur de la pipette).
  3. Ajouter l’anticorps secondaire (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) à la dilution appropriée (1:200) dans 200 μL de volume total. Faites tourbillonner doucement le contenu du tube avec une pointe de pipette. Incuber à température ambiante pendant 90 min.
  4. Ajouter des colorants, tels que Nile Red (lipides, 5 μL de 1 μg/μL) et/ou Hoechst (ADN, 3 μL de 1 μg/μL), dans 200 μL de PBS à ce stade. Incuber à température ambiante pendant 60 minutes supplémentaires. Laver doucement trois fois avec 1x PBS.

5. Montage de glandes colorées pour la microscopie (Figure 1C)

  1. Pipette 200 μL de glycérol à 100% sur une lame de microscope.
    REMARQUE: Comme le glycérol est visqueux, laissez l’extrémité de la pipette dans le liquide jusqu’à ce qu’elle atteigne le volume approprié. Aucun rétrécissement tissulaire n’a été observé lors de l’entrée directe dans le glycérol à 100%. Cependant, les chercheurs peuvent passer par 30% et 50% de lavages de glycérol dans les tubes avant de déplacer les échantillons dans 100% de glycérol.
  2. Transférer les têtes tachées (jusqu’à 20 par lame) avec les glandes attachées (ainsi que d’autres structures internes) sur la lame du microscope à l’aide d’une brosse douce (Figure 3A). Étalez les échantillons de manière à ce qu’ils soient répartis uniformément le long de la lame de verre.
    REMARQUE: Lors du dépôt de glandes sur une glissière de couverture avec une brosse, des pinces peuvent être utilisées pour orienter doucement les SG afin qu’ils soient tous orientés dans la même direction.
  3. En regardant sous un microscope à dissection, séparez la tête larvaire des glandes à l’aide de deux paires de pinces et tirez soigneusement les deux tissus dans des directions opposées.
    REMARQUE: Comme il est difficile d’isoler complètement les SG, retirez simplement les têtes, laissant les SG et les structures internes associées. Même si les SG restent associés à d’autres tissus, ils sont facilement reconnaissables lorsqu’ils sont colorés avec Hoechst et d’autres marqueurs (Figure 3B, C).
  4. Retirez et jetez les têtes et répétez le processus de séparation pour chaque SG.
    REMARQUE: Lorsque vous retirez les têtes, placez une serviette en papier à proximité pour les collecter.
  5. Placez doucement un couvercle de 1,5 mm d’épaisseur sur le dessus (en évitant les bulles d’air) et scellez avec du vernis à ongles transparent.
  6. Conserver à 4 °C dans un récipient à l’épreuve de la lumière.
    REMARQUE: Les lames préparées de glandes colorées peuvent être maintenues à 4 ° C dans l’obscurité jusqu’à six mois à un an sans aucun changement notable de qualité. Si le glycérol commence à fuir au fil des mois, soulevez doucement le couvercle et pipetez plus de glycérol pour remplir les trous.

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Representative Results

Les glandes salivaires sont relativement faciles à disséquer de toutes les larves de stade 4. Les larves mâles et femelles peuvent être distinguées à la fin du stade larvaire L4 par une bande rouge le long du thorax dorsal des femelles mais pas des mâles (Figure 2). Nous observons également que la morphologie des antennes est beaucoup plus élaborée chez les larves mâles que chez les larves femelles L4(Figure 2),similaire aux différences observées dans cette structure chez les moustiques adultes. En plus de la croissance globale considérable au cours de la phase L4, les glandes salivaires forment également une lumière pendant L412. Les glandes salivaires isolées des larves de stade L4 précoce colorées avec Hoechst révèlent les lobes proximaux et distaux séparés par une étroite constriction (Figure 3B, C). La lumière en formation s’étendra du canal salivaire à l’extrémité proximale (non montrée) à travers le lobe distal. La lumière en formation peut être observée dans la glande salivaire distale immunocolorée d’une larve L4 moyenne à tardive (Figure 4). Les domaines apicals des cellules sécrétoires entourant la lumière formatrice ont une coloration rouge du Nil intense(Figure 4B,C)suggérant des structures de type microvillosité. On observe également près de la surface apicale une coloration Rab11(Figure 4C,D,flèches). Rab11 se localise en endosomes de recyclage apical. La coloration Rab11 qui s’accumule également le long de la surface basale de la glande est un artefact dû à l’adhérence de la membrane basale. Une coloration de fond similaire est fréquente avec l’immunocoloration des glandes salivaires larvaires et adultes et a été confondue avec un signal de bonne foi.

Figure 1
Figure 1: Visualisation cartoon du processus d’immunocoloration de la dissection des glandes à la préparation des lames. Abréviations: SG = glandes salivaires; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; MeOH = méthanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole; Abdominaux = anticorps; LH = main gauche; RH = main droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Larves mâles et femelles d’Anopheles gambaie de stade L4. (A, B) Larves L4 précoces. (C, D) Larves L4 tardives. Il y a une croissance considérable au cours de la phase L4. Les femelles (A, C) ont été décrites comme ayant une bande rouge distinctive le long du thorax dorsal (C; flèche noire) qui n’est pas présente chez les mâles (B, D), mais aussi leurs antennes sont beaucoup moins élaborées (fringales) que celles des larves mâles du début et de la fin de L4 (flèches blanches dans les images agrandies). Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Glandes salivaires L4 précoces. (A) Tête larvaire femelle L4 précoce avec glandes salivaires et autres organes internes encore attachés. La glande salivaire est décrite. Barre d’échelle = 50 μm. (B, C) Glandes larvaires isolées colorées avec Hoechst. (B) Fusion d’images fluorescentes et de Nomarski montrant la forme des lobes proximaux et distaux et la coloration de Hoechst bleu dans les noyaux. (C) L’image fluorescente Hoechst ne met en évidence que les noyaux. Barre d’échelle dans les panneaux inférieurs = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Glande salivaire L4 distale immunocolorée. (A) La glande a été colorée avec Hoechst (ADN nucléaire, bleu) et (B) Nile Red (marqueur membranaire, rouge); immunocoloré pour Rab11 (vésicules de recyclage apical, vert) (C). (D) Image fusionnée. Notez qu’un lumen est présent au stade indiqué (B-D). Les flèches en C et D pointent vers la coloration Rab11 attendue des vésicules près de la surface apicale qui chevauche la coloration vésiculeuse rouge positive du Nil dans la fusion (flèches blanches). Une coloration de fond non spécifique autour de la surface basale (astérisques) est également observée, un type de fond commun observé dans les glandes salivaires larvaires et adultes. Barres d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit ici a été adapté d’un protocole de dissection de Drosophila SG et d’un protocole de dissection de moustique adulte14,15,16. Cependant, la plupart des marqueurs n’ont pas pénétré dans la membrane basale (données non présentées) lors de l’utilisation des méthodes de dissection adulte et de coloration SG. Les adaptations du protocole adulte comprenaient la dissection des glandes dans une solution d’EtOH à 25%, le lavage des glandes avec une combinaison de MeOH et d’acide acétique glacial, et un lavage à l’acétone de 90 s. Dans le protocole adulte original, les SG adultes étaient disséqués dans 1x PBS14,15,16. La dissection dans une solution d’EtOH à 25% a permis de préserver les SG et de prévenir les dommages pendant les périodes de coloration. Lors de la dissection initiale, il était plus facile d’orienter les SG larvaires avec la tête face à la main non dominante et d’avoir la main dominante tirant doucement vers l’extérieur (car les larves se déplacent très activement). L’amélioration de la pénétration tissulaire obtenue en lavant les glandes avec une solution d’acide acétique glacial MeOH: suggère que la teneur en lipides de la membrane basale SG larvaire et / ou des membranes plasmiques cellulaires est distincte de celle de la SG adulte. Le lavage à l’acétone de 90 s a amélioré la clarté des glandes pour l’imagerie. Bien qu’il ait été recommandé que la période de fixation soit d’au moins 19 h (pendant la nuit), des périodes plus longues ont fonctionné tout aussi efficacement.

La morphologie des SG peut varier considérablement en fonction du moment où les larves sont disséquées au stade L4 de 2 jours. Dans les premières dissections L4 (jour 1), la lumière apparaît beaucoup plus petite12. Dans les dissections tardives de L4 (deuxième moitié du jour 2), la lumière est grande et les cellules sont allongées. Nous avons constaté que la période optimale pour travailler avec les larves était la L4; Les SG L1-L3 sont tout simplement trop petits pour les dissections manuelles. Dans les résultats d’imagerie, les glandes disséquées entre le milieu et la fin de la L4 ont montré des cellules plus petites mélangées à des cellules plus grandes et allongées latéralement, en particulier dans le sac distal.

Les rapports précédents sur le développement d’Anopheles SG ont fourni de nombreuses orientations pour les études actuelles. Ces rapports ont inclus des illustrations de SG embryonnaires et larvaires disséqués17,18, une analyse microscopique détaillée des glandes disséquées19,20, et des études transcriptomiques20,21,22. Les caractéristiques de l’Anopheles stephensi SG ont été rapportées au cours des années 1950 par deux groupes différents10,11. De nombreuses caractéristiques morphologiques des glandes larvaires ont été décrites, y compris l’organisation globale de la SG, les positions relatives de types cellulaires distincts dans l’organe (canal, précurseurs de la SG adulte et sacs sécrétoires proximaux et distaux larvaires)10,11. Les deux groupes ont également rapporté des données morphométriques supplémentaires, y compris le nombre et la distribution des cellules sécrétoires dans chaque sac et leur taille nucléaire10,11. Rishikesh a montré que, comme les SG larvaires de la drosophile, les chromosomes SG larvaires d’Anopheles stephensi sont polyténisés10. Ces aperçus fondamentaux importants décrivaient les grands aspects biologiques des SG larvaires d’Anophèles.

La méthode décrite ici devrait être utile pour étudier non seulement les SG larvaires d’An. gambiae, mais peut également s’appliquer à ceux qui étudient d’autres espèces de moustiques. En effet, le même protocole a été utilisé avec succès (inédit) avec An. stephensi,une espèce fréquemment étudiée en laboratoire. Une limitation du protocole est le nombre limité d’anticorps qui ont été spécifiquement générés contre les protéines des moustiques. Bien que l’utilisation d’anticorps contre la drosophile pour des protéines hautement conservées ait contourné cette limitation12,le domaine pourrait bénéficier d’un plus grand nombre d’anticorps spécifiques aux protéines des moustiques. Comprendre la biologie cellulaire et moléculaire de la SG larvaire peut contribuer à de nouvelles stratégies de contrôle ou de ciblage et permettre la découverte de nouveaux gènes cibles candidats pour la perturbation de la SG.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Johns Hopkins Malaria Research Institute pour l’accès et l’élevage des larves d’An. gambiae.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie numéro 175
Dissection et immunocoloration des glandes salivaires larvaires des <em>moustiques anophèles gambiens</em>
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Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti,… More

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

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