Summary
Den voksne mygg spyttkjertelen (SG) er nødvendig for overføring av alle myggbårne patogener til sine menneskelige verter, inkludert virus og parasitter. Denne videoen demonstrerer effektiv isolasjon av bærekraftsmålene fra larvalstadiet (L4) Anopheles gambiae mygg og forberedelse av L4-bærekraftsmålene for videre analyse.
Abstract
Mygg spyttkjertler (SGs) er et nødvendig gateway organ for overføring av insektbårne patogener. Sykdomsfremkallende midler, inkludert virus og Plasmodium-parasittene som forårsaker malaria, akkumuleres i sekretoriske hulrom av SG-celler. Her er de klar for overføring til vertebratvertene sine under et påfølgende blodmåltid. Ettersom voksne kjertler dannes som en utarbeidelse av larval SG-kanalknopprester som vedvarer utover tidlig pupal SG-histolyse, er larval SG et ideelt mål for intervensjoner som begrenser sykdomsoverføring. Forståelse av larval SG-utvikling kan bidra til å utvikle en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger og hjelpe til med å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet. Denne videoprotokollen demonstrerer en effektiv teknikk for å isolere, fikse og farge larval SGs fra Anopheles gambiae mygg. Kjertler dissekert fra larver i en 25% etanoloppløsning er festet i en metanol-issyreblanding, etterfulgt av en kald acetonvask. Etter noen skyllinger i fosfatbufret saltvann (PBS) kan SGs farges med et bredt utvalg av markørfarger og/eller antisera mot SG-uttrykte proteiner. Denne metoden for larval SG-isolasjon kan også brukes til å samle vev for in situ hybridiseringsanalyse, andre transkripsjonsapplikasjoner og proteomiske studier.
Introduction
Malaria er en stor folkehelsetrussel som forårsaker nesten 230 millioner infeksjoner og anslagsvis 409 000 dødsfall i 20191. De fleste dødsfall er i Afrika sør for Sahara og er forårsaket av parasitten Plasmodium falciparum, hvis insektvektor er Anopheles gambiae, emnet for denne videodemonstrasjonen. Selv om tallene indikerer et betydelig fall i årlig dødsrate siden århundreskiftet (> 300.000 færre årlige dødsfall), er den lovende nedgangen i sykdomsraten observert fra 2000 til 2015 avsmalnende, noe som tyder på behovet for nye tilnærminger til å begrense sykdomsoverføring2. Blant lovende tilleggsstrategier for å kontrollere og muligens eliminere malaria er rettet mot myggvektorkapasitet ved hjelp av CRISPR / Cas9-basert genredigering og gen-drive3,4,5. Faktisk er det målrettingen av myggvektoren (gjennom utvidet bruk av langvarige insektmiddelbehandlede sengenett) som har hatt størst innvirkning på å redusere sykdomsoverføring6.
Kvinnelige mygg kjøper Plasmodium gametocytter fra et infisert menneske under et blodmåltid. Etter befruktning, modning, midgut epiteltraversering, befolkningsutvidelse og hemocoelnavigasjon i sine obligatoriske myggverter, invaderer hundrevis til titusenvis av Plasmodium-sporozoitter myggsmulene og fyller sekretoriske hulrom i de bestanddelene sekretoriske celler. Når de er inne i sekretoriske hulrom, har parasittene direkte tilgang til spyttkanalen og er dermed klar for overføring til en ny virveldyrvert ved neste blodmel. Fordi bærekraftsmål er avgjørende for overføring av malariafremkallende sporozoitter til sine menneskelige verter, og laboratoriestudier tyder på at bærekraftsmålene ikke er avgjørende for blodfôring, myggoverlevelse eller fecundity7,8,9, representerer de et ideelt mål for overføringsblokkerende tiltak. Voksen mygg SGs dannes som en utarbeidelse av "duct bud" rester i larval SGs som vedvarer utover tidlig pupal SG histolyse10, noe som gjør larval SG et ideelt mål for intervensjoner for å begrense overføring av sykdom i voksenstadiet.
Karakterisering av larvestadiet av SG-utvikling kan bidra til å utvikle ikke bare en bedre forståelse av morfologi og funksjonelle tilpasninger, men kan også bidra til å vurdere nye intervensjoner som retter seg mot dette organet gjennom genredigering av viktige SG-regulatorer. Fordi alle tidligere studier av larval spyttkjertelarkitektur predate immunostaining og moderne bildeteknikker10,11, har vi utviklet en protokoll for isolering og farging av spyttkjertler med en rekke antistoffer og cellemarkører12. Denne videoen demonstrerer denne tilnærmingen til utvinning, fiksering og farging av larval SGs fra Anopheles gambiae L4 larver for konfikal avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av løsninger og verktøy
- Utarbeidelse av disseksjonsløsning
- For å forberede disseksjonsløsningen, tilsett 2,5 ml 100% etanol til 7,5 ml destillert H2O i et 15 plastrør. Snu røret 3 ganger for å blande.
MERK: Denne løsningen kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker.
- For å forberede disseksjonsløsningen, tilsett 2,5 ml 100% etanol til 7,5 ml destillert H2O i et 15 plastrør. Snu røret 3 ganger for å blande.
- Tilberedning av 10x fosfatbufret saltvannsbestand (PBS)
- For å klargjøre 10x PBS-lager, tilsett 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl og 2 g KCl til 800 ml deionisert vann. Bland med en rørestang på en røreplate til faststoffene er helt oppløst. Juster det endelige volumet til 1 L med renset vann.
MERK: Denne løsningen kan oppbevares ved romtemperatur i flere måneder.
- For å klargjøre 10x PBS-lager, tilsett 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl og 2 g KCl til 800 ml deionisert vann. Bland med en rørestang på en røreplate til faststoffene er helt oppløst. Juster det endelige volumet til 1 L med renset vann.
- Fremstilling av 1x PBS
- Tilsett 10 ml 10x PBS til 90 ml H2O i en steril glassflaske. Lukk lokket tett og snu 3x for å blande.
MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i flere uker.
- Tilsett 10 ml 10x PBS til 90 ml H2O i en steril glassflaske. Lukk lokket tett og snu 3x for å blande.
- Forberedelse av fikseringsmiddel.
- Tilsett 600 μL metanol til 200 μL issyre. Gjør løsningen frisk hver gang.
- Konstruksjon av kittplate (en vevskulturrett fylt med silikongummi)
- Bland komponentene (1:50) epoksy (1 g) og vann (50 ml) og hell blandingen i en Petri-tallerken. Vent til komponentene tørker før bruk.
MERK: Når den er konstruert, kan kittplaten brukes i årevis.
- Bland komponentene (1:50) epoksy (1 g) og vann (50 ml) og hell blandingen i en Petri-tallerken. Vent til komponentene tørker før bruk.
2. Kjertel disseksjon (Figur 1A)
- Samle sen-stadium L4 larver (~ 10 dager etter luke; Figur 2) fra fôringsbrett ved hjelp av en plastoverføringspipette.
MERK: Se denne nyttige netthåndboken for standard mygghold og larvekultur13.- Legg en kittplate på scenen av et dissekerende mikroskop og overfør larver på kittplaten.
MERK: Når aliquoting larver for første disseksjon, er det nyttig å overføre ~ 10 larver på lysbildet på en gang ved hjelp av en plastoverføring pipette.
- Legg en kittplate på scenen av et dissekerende mikroskop og overfør larver på kittplaten.
- Legg en dråpe disseksjonsløsning (1:3 EtOH:H2O) på kittplaten, skilt fra de 10 larver.
- Bruk en plastoverføringspipette eller engangs glasspipette for å plassere en L4-larve i 25% EtOH-dråpen.
- Ta tang (# 5), en i hver hånd, og med den ikke-dominerende hånden, ta tak i larvens hode. Ved hjelp av den dominerende hånden, ta tak i larven med tang like under hodet og trekk forsiktig med minimal konstant kraft, slik at hodet løsner fra resten av kroppen og kjertlene forblir festet til hodet. Kast kroppsdelen av larvekroppen.
MERK: Når du dissekerer, sett et papirhåndkle i nærheten for å samle larverkroppene. - Samle hodet/kjertlene i 1 ml 1x PBS i et 1,5 ml mikrosenterrør. Bruk 1 ml PBS for ~40 dissekerte kjertler med festet hode. Vent til hodene/bærekraftsmålene synker til bunnen av bufferen.
3. Fiksering for antistofffarging (Figur 1B)
- Tøm PBS fra toppen av mikrocentrifugerøret ved hjelp av en glassoverføringspipette, unngå klebrig myggvev og fjern så mye av PBS-løsningen som mulig uten å skade vevet. Erstatt oppløsningen med 800 μL av en 3:1 blanding av metanol til iseddik. Plasser røret ved 4 °C over natten (12-24 timer anbefales; 19 timer foretrukket).
- Neste dag, tøm løsningen og erstatt den med 1 ml kaldt 100% aceton. La i 90 s.
- Fjern acetonen og skyll forsiktig vevet tre ganger med 1 ml 1 ml 1x PBS hver gang.
MERK: Prøvene skal flyte sakte opp med strømmen, og deretter falle tilbake til bunnen av røret når hvert PBS-tillegg er fullført.
4. Immunstaining (Figur 1B)
- Tilsett primært antistoff (f.eks. Rab11) ved riktig fortynning (1:100) i 200 μL av det totale volumet på 1x PBS. Virvle rørinnholdet forsiktig med en pipettespiss. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Fjern den primære antistoffløsningen og vask tre ganger med 1 ml 1x PBS (rør oppløsningen forsiktig inn og ut av pipetten).
- Tilsett sekundært antistoff (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) ved riktig fortynning (1:200) i 200 μL totalt volum. Virvle rørinnholdet forsiktig med en pipettespiss. Inkuber ved romtemperatur i 90 min.
- Tilsett fargestoffer, som Nil Red (lipider, 5 μL 1 μg/μL) og/eller Hoechst (DNA, 3 μL 1 μg/μL), i 200 μL PBS på dette stadiet. Inkuber ved romtemperatur i ytterligere 60 min. Vask forsiktig tre ganger med 1x PBS.
5. Montering av fargede kjertler for mikroskopi (Figur 1C)
- Pipette 200 μL 100% glyserol på et mikroskop lysbilde.
MERK: Siden glyserol er viskøs, la pipettespissen ligge i væsken til den når riktig volum. Ingen vevskrymping ble observert når du gikk rett inn i 100% glyserol. Imidlertid kan forskere gå gjennom 30% og 50% glyserolvasker i rørene før de flytter prøvene til 100% glyserol. - Overfør de fargede hodene (opptil 20 per lysbilde) med de vedlagte kjertlene (sammen med andre indre strukturer) til mikroskopet med en myk børste (Figur 3A). Spre prøvene ut slik at de fordeles jevnt langs glasssklie.
MERK: Ved deponering av kjertler på en dekselsklie med en børste, kan tang brukes til å orientere tannhjulene forsiktig slik at de alle er orientert i samme retning. - Se under et dissekerende mikroskop, skille larvehodet fra kjertlene ved hjelp av to par tang og forsiktig trekke de to vevene i motsatte retninger.
MERK: Siden det er utfordrende å isolere bærekraftsmålene fullstendig, fjerner du bare hodene, forlater bærekraftsmålene og tilhørende interne strukturer. Selv om bærekraftsmålene forblir forbundet med andre vev, gjenkjennes de lett når de farges med Hoechst og andre markører (Figur 3B,C). - Fjern og kast hodene og gjenta separasjonsprosessen for hver SG.
MERK: Når du fjerner hoder, setter du inn et papirhåndkle i nærheten for å hente dem. - Plasser forsiktig en 1,5 mm tykk deksleslip på toppen (unngå luftbobler) og forsegle med klar neglelakk.
- Oppbevars ved 4 °C i en lyssikker beholder.
MERK: Forberedte lysbilder av fargede kjertler kan holdes ved 4 °C i mørket i opptil seks måneder til ett år uten merkbare kvalitetsendringer. Hvis glyserol begynner å lekke etter hvert som månedene går, løft forsiktig dekslene og pipetten i mer glyserol for å fylle hull.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spyttkjertler er relativt enkle å dissekere fra alle stadium 4 larver. Mannlige og kvinnelige larver kan skille seg ut på slutten av L4 larvalstadiet med en rød stripe langs kvinners dorsale thorax, men ikke menn (Figur 2). Vi observerer også at antennemorfologi er mye mer forseggjort hos menn enn hos kvinnelige L4 larver (Figur 2), som ligner forskjellene som er observert i denne strukturen i voksne mygg. Sammen med den betydelige samlede veksten i L4-stadiet danner spyttkjertlene også en lumen under L412. Spyttkjertler isolert fra tidlige L4-stadium larver farget med Hoechst avslører de proksimale og distale lober skilt av en smal innsnevring (Figur 3B,C). Den dannende lumen vil strekke seg helt fra spyttkanalen i den proksimale enden (ikke vist) gjennom den distale loben. Den dannende lumen kan ses i den immunosterte distale spyttkjertelen til en midten til slutten av L4-larven (figur 4). De apikale domenene til sekretoriske celler rundt de dannende lumen har intens Nilen Rød farging (Figur 4B, C) som tyder på mikrovilli-lignende strukturer. Også observert nær den apikale overflaten er Rab11 farging (Figur 4C, D, piler). Rab11 lokaliserer til apikale resirkulering endosomer. Rab11-fargingen som også akkumuleres langs basaloverflaten av kjertelen, er en gjenstand på grunn av basalmembranens klebrighet. Lignende bakgrunnsfarging er vanlig med immunisering av både larve og voksne spyttkjertler og har blitt forvekslet med bona fide signal.
Figur 1: Tegneserievisualisering av immunoppfatningsprosessen fra kjertel disseksjon gjennom lysbildeforberedelse. Forkortelser: SGs = spyttkjertler; PBS = fosfatbufret saltvann; MeOH = metanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; Abs = antistoffer; LH = venstre hånd; RH = høyre hånd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mannlig og kvinnelig L4-stadium Anopheles gambaie larver. (A, B) Tidlig L4 larver. (C, D) Sen L4 larver. Det er betydelig vekst i L4-fasen. Kvinner (A, C) har blitt beskrevet som å ha en fremtredende rød stripe ned dorsal thorax (C; svart pil) som ikke er til stede hos menn (B, D), men også deres antenner er mye mindre forseggjorte (frilly) enn de av mannlige larver fra både tidlig og sen L4 (hvite piler i forstørrede bilder). Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidlige L4 spyttkjertler. (A) Tidlig L4 kvinnelig larvalhode med spyttkjertler og andre indre organer fortsatt festet. Spyttkjertelen er skissert. Skalastang = 50 μm. (B, C) Isolerte larvalkjertler farget med Hoechst. (B) Sammenslåing av fluorescerende og Nomarski-bilder som viser formen på de proksimale og distale lobene og den blå Hoechst-fargingen i kjerner. (C) Hoechst fluorescerende bilde fremhever bare kjerner. Skalalinje i bunnpaneler = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunostert distal L4 spyttkjertel. (A) Kjertelen har blitt farget med Hoechst (kjernefysisk DNA, blå) og (B) Nil Rød (membranmarkør, rød); immunostert for Rab11 (apikale resirkulerings vesikler, grønn) (C). (D) Det sammenslåtte bildet. Vær oppmerksom på at det finnes en lumen på det stadiet som vises (B-D). Pilene i C og D peker på den forventede Rab11-fargingen av vesikler nær den apikale overflaten som overlapper den Nil Rød-positive vesikulære fargingen i fusjonen (hvite piler). Ikke-spesifikk bakgrunnsfarging rundt basaloverflaten (stjerner) observeres også, en vanlig type bakgrunn observert i larve- og voksen spyttkjertler. Skalastenger = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet heri ble tilpasset fra en Drosophila SG disseksjonsprotokoll og en voksen mygg disseksjonsprotokoll14,15,16. Imidlertid trengte de fleste markører ikke inn i kjellermembranen (data ikke vist) ved bruk av voksen disseksjon og SG-fargingsmetoder. Tilpasninger av voksenprotokollen inkluderte dissekering av kjertlene i en 25% EtOH-løsning, vasking av kjertlene med en kombinasjon av MeOH og issyre, og å ha en 90-s acetonvask. I den opprinnelige voksenprotokollen ble voksne SGs dissekert i 1x PBS14,15,16. Dissekering i en 25% EtOH-løsning bidro til å bevare bærekraftsmålene og forhindret skade i fargingsperiodene. Når du utfører den første disseksjonen, var det enklest å orientere larval-bærekraftsmålene med hodet vendt mot den ikke-dominerende hånden og ha den dominerende hånden forsiktig trekke utover (fordi larvene er veldig aktivt bevegelige). Den forbedrede vevsgjennomtrengningen oppnådd ved å vaske kjertlene med en MeOH: glasial eddiksyreoppløsning antyder at lipidinnholdet i larval SG kjellermembran og / eller cellulære plasmamembraner er forskjellig fra den voksne SG. 90-tallets acetonvask forbedret klarheten i kjertlene for avbildning. Selv om fikseringsperioden ble anbefalt å være minst 19 timer (over natten), fungerte lengre perioder like effektivt.
Morfologien til bærekraftsmålene kan variere mye avhengig av når larvene dissekeres i det 2-dagers lange L4-stadiet. I tidlig L4 disseksjoner (dag 1) vises lumen mye mindre12. På slutten av L4 disseksjoner (andre halvdel av dag 2) er lumen stor, og cellene er langstrakte. Vi fant ut at den optimale perioden for å jobbe med larver var L4; L1-L3 bærekraftsmålene er rett og slett for små til manuell disseksjon. I bilderesultater viste kjertler dissekert ved midten til slutten av L4 mindre celler blandet med større, lateralt langstrakte celler, spesielt i den distale sekken.
Tidligere rapporter om Anopheles SG-utvikling har gitt mye veiledning for de aktuelle studiene. Disse rapportene har inkludert illustrasjoner av dissekerte embryonale og larval SGs17,18, detaljert mikroskopisk analyse av dissekerte kjertler19,20og transcriptomiske studier20,21,22. Egenskapene til Anopheles stephensi SG ble rapportert i løpet av 1950-tallet av to forskjellige grupper10,11. Mange av de morfologiske egenskapene til larvalkjertlene ble beskrevet, inkludert den generelle organiseringen av SG, de relative posisjonene til forskjellige celletyper i orgelet (kanal, voksne SG-forløpere og larval proksimale og distale sekretoriske sekker)10,11. Begge gruppene rapporterte også ytterligere morfometriske data, inkludert antall og fordeling av sekretoriske celler i hver sak og deres kjernefysiske størrelse10,11. Rishikesh viste at, som Drosophila larval SGs, larval SG kromosomer fra Anopheles stephensi er polytenisert10. Disse viktige grunnleggende oversiktene beskrev brede biologiske aspekter ved larval Anopheles SGs.
Metoden beskrevet heri bør være nyttig for å studere ikke bare larval SGs of An. gambiae, men kan også gjelde for de som studerer andre myggarter. Faktisk har den samme protokollen blitt vellykket brukt (upublisert) med An. stephensi, en art som ofte studeres i laboratoriet. En begrensning i protokollen er det begrensede antallet antistoffer som er spesielt generert mot myggproteiner. Selv om bruk av Drosophila antistoffer for svært konserverte proteiner har omskåret denne begrensningen12, kan feltet dra nytte av mer myggproteinspesifikke antistoffer. Forståelse av larval SG cellulær og molekylærbiologi kan bidra til nye kontroll- eller målstrategier og muliggjøre oppdagelse av nye kandidatmålgener for SG-forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Johns Hopkins Malaria Research Institute for tilgang til og oppdrett av An. gambiae larver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
