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Biology

アノフェレスガンビー蚊からの幼虫唾液腺の解剖と免疫染色

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

成体の蚊の唾液腺(SG)は、ウイルスや寄生虫を含む人間の宿主にすべての蚊媒介病原体の伝染に必要である。このビデオは、幼虫(L4)ステージ アノフェレスガンビア 蚊からのSGの効率的な分離とさらなる分析のためのL4 SGの調製を示しています。

Abstract

蚊の唾液腺(SG)は、昆虫媒介病原体の伝染に必要なゲートウェイ器官である。ウイルスやマラリアを引き起こすマラリア原虫を含む疾患を引き起こす薬剤は、SG細胞の分泌空洞に蓄積する。ここでは、その後の血液食事中に脊椎動物の宿主に伝染する準備ができています。成人の腺は、幼虫SG芽の残骸の精緻化として形成され、初期のプパルSGのヒストリシスを超えて持続するので、幼虫SGは病気の伝染を制限する介入のための理想的な標的である。幼虫SGの開発を理解することは、その形態と機能的適応のより良い理解を開発し、この器官を標的とする新しい介入の評価に役立ちます。このビデオプロトコルは、 アノフェレスガンビア 蚊から幼虫SGを単離、固定、染色するための効率的な技術を示しています。25%エタノール溶液中で幼虫から解剖した腺は、メタノール・氷酢酸混合物中に固定され、続いて冷たいアセトン洗浄が行われます。リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で数回のリンスの後、SG発現タンパク質に対する広範なマーカー染料および/またはアンチセラでSGを染色することができます。幼虫SGの分離のためのこの方法はまた、 その他の転 写応用、およびプロテオミクス研究における組織を収集するために使用することができる。

Introduction

マラリアは公衆衛生上の主要な脅威であり、2019年には約2億3000万人の感染と推定409,000人の死亡を引き起こしている。死者の大半はサハラ以南のアフリカで、このビデオデモンストレーションの主題であるアノフェレス・ガンビアである寄生虫熱帯熱マラリア原虫によって引き起こされます。この数字は、世紀の変わり目以来、年間死亡率の大幅な低下(年間死亡者数>30万人減少)を示しているが、2000年から2015年まで観察された疾患率の有望な減少は先細りであり、疾患伝染を制限するための新しいアプローチの必要性を示唆している2。マラリアを制御し、おそらく排除するための有望な追加戦略の中で、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集および遺伝子駆動3、4、5を使用して蚊ベクター容量を標的にしている。実際、病気の伝染を減らすに最も大きな影響を与えたのは、蚊ベクターの標的化(長期にわたる殺虫剤処理されたベッドネットの拡大を通じて)である。

雌の蚊は、血液中に感染したヒトからプラスモジウム様の解剖学を取得する。受精、成熟、中腸上皮横断、集団拡張、および彼らの義務的な蚊の宿主におけるヘモコウムナビゲーションに続いて、数百から数万のプラスモジウム・スポロゾイテが蚊SGに侵入し、構成分泌細胞の分泌空洞を埋める。分泌空洞内に入ると、寄生虫は唾液管に直接アクセスし、次の血液食事時に新しい脊椎動物宿主に伝染する準備ができている。SGはマラリアを引き起こすスポロゾアをヒト宿主に伝染させるのに重要であり、実験室での研究は、SGが血液供給、蚊の生存、または胎児性7、8、9に不可欠ではないことを示唆しているので、伝達遮断対策の理想的な標的である。成虫の蚊SGは、初期の子犬SGヒストリシス10を超えて持続する幼虫SGの「ダクト芽」残骸の精緻化として形成され、幼虫SGは成人期疾患の伝染を制限するための介入のための理想的な標的となる。

SG開発の幼虫段階を特徴付けても、その形態と機能適応の理解を深めるだけでなく、主要なSGレギュレータの遺伝子編集を通じてこの器官を標的とする新しい介入を評価するのにも役立ちます。幼虫唾液腺アーキテクチャのこれまでの研究は、免疫染色および現代のイメージング技術10,11より前に、種々の抗体および細胞マーカー12を用いて唾液腺を単離および染色するためのプロトコルを開発した。このビデオは、共焦点イメージングのためのアノフェレスガンビアL4幼虫からの幼虫SGの抽出、固定、染色に対するこのアプローチを示しています。

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Protocol

1. ソリューションとツールの準備

  1. 解剖液の調製
    1. 解剖液を調製するには、15個のプラスチックチューブに7.5mLの蒸留H2Oに2.5mLのエタノールを加えます。チューブを3回反転して混ぜます。
      注:このソリューションは、室温で数週間保存することができます。
  2. リン酸緩衝生理食塩分10倍の調製(PBS)ストック
    1. 10x PBSストックを調製するには、17.8 g Na2HPO4• 2H2O, 2.4 g KH2PO4,80 g NaCl, 2 g KCl を 800 mL の脱イオン水に加えます。固形物が完全に溶解するまで、攪拌プレートの上に攪拌棒と混合します。精製水で最終体積を1Lに調整します。
      注:このソリューションは、数ヶ月間室温で保存することができます。
  3. 1x PBSの調製
    1. 滅菌ガラス瓶に10mLを90mLのH2Oに加えます。蓋をしっかりと閉め、3倍を反転して混ぜます。
      注:溶液は、数週間4°Cで保存することができます。
  4. 固定剤の調製。
    1. 600 μL のメタノールを 200 μLの氷酢酸に加えます。毎回ソリューションを新鮮にします。
  5. パテプレート(シリコーンゴムを充填した組織培養皿)の構成
    1. エポキシ(1g)と水(50mL)の成分(1:50)を混ぜ、ペトリ皿に注ぎます。使用する前に、コンポーネントが乾くのを待ちます。
      注:一度構築すると、パテプレートは、年間使用することができます。

2. 腺解剖 (図 1A)

  1. 後期L4幼虫を収集する(〜10日後のハッチ; 図2)プラスチック転写ピペットを使用して給餌トレイから。
    注:標準的な蚊の畜産と幼虫文化13のためのこの役に立つオンラインマニュアルを参照してください。
    1. 解剖顕微鏡のステージにパテプレートを置き、幼虫をパテプレートに移します。
      注:最初の解剖のために幼虫をアリクォートする場合、プラスチック転写ピペットを使用して一度に10の幼虫をスライドに移すと便利です。
  2. 10の幼虫とは別に、解剖液(1:3 EtOH:H2O)をパテプレートに一滴置きます。
  3. プラスチック転写ピペットまたは使い捨てのガラスピペットを使用して、1つのL4幼虫を25%のEtOHドロップに入れます。
  4. 鉗子(#5)を取り、各手に1つ、そして非支配的な手で、幼虫の頭をつかみます。支配的な手を使って、頭のすぐ下に鉗子で幼虫をつかみ、頭が体の残りの部分から切り離され、腺が頭部に取り付けられたままになるように、最小限の一定の力で穏やかに引っ張ります。幼虫の死体の体の部分を捨てます。
    注:解剖する際は、近くにペーパータオルをセットして幼虫の死体を採取してください。
  5. 1.5 mLマイクロ遠心チューブで1x PBSの1 mLにヘッド/腺を収集します。1 mL の PBS を、頭部を取り付けた状態で約 40 個の解剖腺に使用してください。ヘッド/SG がバッファの底面に沈むのを待ちます。

抗体染色のための3.固定(図1B)

  1. ガラストランスファーピペットを使用してマイクロ遠心チューブの上部からPBSを排出し、粘着性の蚊組織を避け、組織を損傷することなくできるだけ多くのPBS溶液を取り除きます。溶液をメタノールから氷酢酸までの3:1混合物の800 μLに交換してください。チューブを一晩4°Cに置きます(12〜24時間推奨;19時間が好ましい)。
  2. 翌日、溶液を水切りし、1mLの冷たい100%アセトンに交換します。90 sに残します。
  3. アセトンを取り出し、毎回1mLの1倍のPBSで組織を3回軽くすすます。
    注:サンプルは流れに合わせてゆっくりと浮いてから、PBSの追加が完了するまでにチューブの底に戻ります。

4. 免疫染色 (図1B)

  1. 1x PBSの全容量の200 μLに適切な希釈液(1:100)で一次抗体(例えば、Rab11)を加える。ピペットチップでチューブの内容物をそっと旋回します。4°Cで一晩インキュベートする。
  2. 一次抗体溶液を取り出し、1mLの1x PBSで3回洗浄します(溶液をピペットの出入りで静かにピペットします)。
  3. 200 μL の全容で適切な希釈液(1:200)に二次抗体(アレックス・フルーター 488 ヤギ抗ウサギ)を加えます。ピペットチップでチューブの内容物をそっと旋回します。室温で90分間インキュベートします。
  4. この段階で、ナイルレッド(脂質、5 μLの1 μg/μL)および/またはHoechst(DNA、3 μLの1 μg/μL)などの色素をPBSの200 μLに加えます。室温で60分のインキュベートを行います。1倍PBSで3回やさしく洗います。

5. 顕微鏡用染色腺の取り付け (図 1C)

  1. ピペット200μLの100%グリセロールを顕微鏡スライドに取り付けます。
    注:グリセロールは粘性であるため、ピペットチップは適切な体積になるまで液体に入れておきます。100%グリセロールに直進する際に組織の縮小は認められなかった。しかし、研究者は、サンプルを100%グリセロールに移動する前に、チューブ内のグリセロールの 30% と 50% のスロッシュを通過することができます。
  2. 染色された頭部(スライドあたり最大20個)を、柔らかいブラシを使用して(他の内部構造と共に)取り付けた腺を顕微鏡スライドに移す(図3A)。サンプルを広げて、ガラススライドに沿って均等に分散させます。
    注: ブラシでカバースライドに腺を堆積させる場合、鉗子を使用して SG の向きを穏やかにして、すべての方向が同じ方向に向くようにすることができます。
  3. 解剖顕微鏡で見て、2組の鉗子を使って腺から幼虫の頭部を分離し、2つの組織を慎重に反対方向に引っ張る。
    注: SG を完全に分離するのは難しいので、SG と関連する内部構造を残したまま、ヘッドを取り外すだけです。SGが他の組織と関連し続けても、Hoechstや他のマーカーで染色すると容易に認識されます(図3B,C)。
  4. ヘッドを取り外して破棄し、各SGの分離プロセスを繰り返します。
    注:ヘッドを取り外す際は、近くにペーパータオルをセットして集めます。
  5. 厚さ1.5mmのカバースリップを上にそっと置き(気泡を避ける)、透明なマニキュアで密封します。
  6. 4°Cで軽量容器に保管してください。
    注:染色腺の準備スライドは、品質の顕著な変更なしに1年まで6ヶ月まで暗闇の中で4°Cに保つことができます。月が経つうにつれてグリセロールが漏れ始めたら、カバースリップとピペットをよりグリセロールでそっと持ち上げて穴を埋めます。

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Representative Results

唾液腺は、すべてのステージ4の幼虫から比較的容易に解剖できる。男性と女性の幼虫は、後期L4幼虫期において、女性の胸郭に沿った赤い縞によって区別することができるが、男性は区別できない(図2)。また、この構造の違いが、成体の蚊に見られるのと同様に、女性のL4幼虫(図2)よりも、男性の方が触形形態の方がはるかに精巧であることを観察しています。L4段階でのかなりの全体的な成長に伴い、唾液腺はL412の間に内腔を形成する。Hoechstで染色された初期のL4段階から分離された唾液腺は狭い収縮によって分離された近位および遠位の葉を明らかにする(図3B,C)。形成管腔は、近位最も近い端(図示されていない)の唾液管から遠位葉を通ってずっと伸びる。形成管腔は、中~後期L4幼虫の免疫染色遠位唾液腺に見ることができる(図4)。形成された内腔を取り囲む分泌細胞の素端ドメインは、濃いナイルレッド染色(図4B,C)微小絨毛様構造を示唆する。また、有端表面の近くに観察されるRab11染色(図4C、D、矢印)。Rab11は、エドーソームの補助的なリサイクルに局地化します。また、腺の基底面に沿って蓄積するRab11染色は、基底膜の粘着性によるアーティファクトです。同様のバックグラウンド染色は、幼虫腺と成人唾液腺の両方の免疫染色と一般的であり、ボナフィデスシグナルと間違えられている。

Figure 1
図1:腺解剖からスライド調製までの免疫染色プロセスのカートゥーンビジュアライゼーション 略語: SG = 唾液腺;PBS = リン酸緩衝生理食塩分;MeOH = メタノール;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;腹筋 =抗体;LH = 左手;RH = 右手。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:男性と女性のL4ステージアノフェレスガンベイ幼虫(A,B)初期L4幼虫(C, D)故L4幼虫。L4ステージではかなりの成長があります。女性(A、C)は、男性(B、D)には存在しない胸郭(C;黒矢印)の下に区別する赤いストライプを持っていると説明されていますが、そのアンテナは、初期と後半の両方から男性の幼虫のものよりもはるかに精巧ではありません(フリフリ)。スケールバー= 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:初期L4唾液腺(A)唾液腺および他の内臓を伴う初期のL4女性の幼虫頭部。唾液腺の概要が示されている。スケールバー=50μm(B、C)は、Hoechstで染色された単離の幼虫腺。(B) 近位葉と遠位葉の形状を示す蛍光とノマルスキーの画像と、核内の青いヘックスト染色の結合。(C)Hoechst蛍光画像は核のみをハイライトします。下のパネルのスケールバー = 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:免疫染色遠位L4唾液腺(A)腺は、Hoechst(核DNA、青)および(B)ナイルレッド(膜マーカー、赤色)で染色されています。Rab11(アプリカルリサイクル小胞、緑色)の免疫染色(C).(D) マージされたイメージ。ルーメンは、示されている段階に存在していることに注意してください (B-D)。CとDの矢印は、マージでナイルレッド陽性の小胞染色(白い矢印)と重なる尖語表面付近の小胞の予想されるRab11染色を指しています。基底面(アスタリスク)の周囲の非特異的な背景染色も観察され、幼虫および成人唾液腺において観察される一般的なタイプの背景である。スケールバー= 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

本明細書に記載されたプロトコルは、ショウジョウバエSG解剖プロトコルおよび成体蚊解剖プロトコル14、15、16から適応した。しかし、成人解剖およびSG染色法を使用する場合、ほとんどのマーカーは、元素膜(データは示さない)に浸透しなかった。成人プロトコルの適応には、25%のEtOH溶液中の腺の解剖、MeOHと氷河酢酸の組み合わせで腺を洗浄すること、および90 sアセトン洗浄を含む。元の成人の議定書では、成人SGは1x PBS14、15、16で解剖された。25%のEtOH溶液で解剖することでSGを保存し、染色期間中の損傷を防ぎました。最初の解剖を行うとき、頭を非支配的な手に向け、支配的な手をそっと外側に引っ張るようにして幼虫SGを向けるのが最も簡単でした(幼虫は非常に活発に動いているためです)。MeOHで腺を洗浄することによって達成された組織浸透の改善:氷河酢酸溶液は、幼虫SG基質膜および/または細胞形質膜中の脂質含有量が成人SGのものとは異なっていることを示唆している。90 sアセトン洗浄により、イメージング用の腺の透明度が改善されました。固定期間は少なくとも19時間(一晩)であることが推奨されたが、より長い期間は同じように効果的に働いた。

SGの形態は、幼虫が2日間のL4段階で解剖される時期によって大きく異なる可能性があります。初期のL4の分節(1日目)では、ルーメンははるかに小さく見える12.L4後期(2日目の後半)では、内腔が大きく、細胞が細長く伸びる。幼虫を扱う最適期間はL4であることがわかった。L1-L3 SGは、手動の切り分けには小さすぎます。イメージングの結果では、L4中期から後期に解剖した腺は、特に遠位嚢において、より大きく、横に細長い細胞と混合された小さな細胞を示した。

アノフェレスSG開発に関する以前の報告は、現在の研究のための多くのガイダンスを提供してきました.これらの報告には、解剖された胚および幼虫SG17、18、解剖腺19、20の詳細な顕微鏡分析、および転写研究20、21、22の図が含まれている。アノフェレス・ステパシSGの特徴は、1950年代に2つの異なるグループ10、11によって報告されました。幼虫腺の形態学的特徴の多くは、SGの全体的な組織、器官内の異なる細胞タイプの相対的な位置(管、成体SG前駆体、および幼虫近位および歪位分泌嚢)10、11を含む記載された。両グループは、各嚢内の分泌細胞の数と分布、およびそれらの核サイズ10,11を含む追加の形態測定データも報告した。リシケシュは、ショウジョウバエ幼虫SGと同様に、アノフェレス・ステファシ由来の幼虫SG染色体がポリテン化された10であることを示した。これらの重要な基礎的概観は幼虫アノフェレスSGの広範な生物学的側面を説明した。

本明細書に記載されている方法は 、An.ガンビア の幼虫SGだけでなく、蚊の他の種を研究している人にも適用できる研究に有用であるべきである。実際、同じプロトコルが、研究室で頻繁に研究されている種 であるAn. stephensiとの間で、正常に(未発表)利用されています。プロトコルの1つの制限は、蚊タンパク質に対して特異的に生成された抗体の数が限られている。高度に保存されたタンパク質に対してショウジョウバエ抗体を使用すると、この制限を12周回していますが、この分野はより多くの蚊タンパク質特異的抗体の恩恵を受ける可能性があります。幼虫SG細胞および分子生物学を理解することは、新しい制御または標的戦略に寄与し、SG破壊のための新しい候補標的遺伝子の発見を可能にする。

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Disclosures

著者らは開示する利益相反はない。

Acknowledgments

ジョンズ・ホプキンスマラリア研究所の アンガンビア 幼虫へのアクセスと飼育に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

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References

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生物学,175号
<em>アノフェレスガンビー</em>蚊からの幼虫唾液腺の解剖と免疫染色
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Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti,… More

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

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