Summary
تصف هذه المساهمة كيفية إعداد بلورة البروتين على أجهزة الكريستال على الكريستال وكيفية إجراء جمع البيانات التسلسلية الآلية في درجة حرارة الغرفة باستخدام منصة التبلور على الرقاقة.
Abstract
يمكن فهم التفاعلات الكيميائية الحيوية والعمليات البيولوجية بشكل أفضل من خلال توضيح كيفية انتقال البروتينات بين حالاتها الوظيفية. نظرا لأن درجات الحرارة المبردة غير فسيولوجية وقد تمنع أو تردع أو حتى تغير ديناميكيات بنية البروتين ، فإن الطريقة القوية لتجارب حيود الأشعة السينية الروتينية في درجة حرارة الغرفة أمر مرغوب فيه للغاية. تم تصميم جهاز الكريستال على البلورة والأجهزة والبرامج المصاحبة له المستخدمة في هذا البروتوكول لتمكين حيود الأشعة السينية في الموقع في درجة حرارة الغرفة لبلورات البروتين ذات الأحجام المختلفة دون أي معالجة للعينات. نقدم هنا بروتوكولات الخطوات الرئيسية من تجميع الجهاز ، والتبلور على الرقاقة ، والمسح الضوئي ، والتعرف على الكريستال إلى تخطيط لقطات الأشعة السينية وجمع البيانات الآلي. نظرا لأن هذه المنصة لا تتطلب حصادا بلوريا أو أي معالجة أخرى للعينات ، يمكن إدخال مئات إلى آلاف بلورات البروتين المزروعة على الرقاقة في حزمة الأشعة السينية بطريقة قابلة للبرمجة وعالية الإنتاجية.
Introduction
بسبب التأثيرات المؤينة للإشعاع بالأشعة السينية ، اقتصر علم البلورات البروتيني ، إلى حد كبير ، على الظروف المبردة في العقود الثلاثة الماضية. لذلك ، فإن المعرفة الحالية لحركات البروتين أثناء وظيفتها تنشأ إلى حد كبير من المقارنات بين الهياكل الثابتة التي لوحظت في حالات مختلفة في ظل ظروف مبردة. ومع ذلك ، فإن درجات الحرارة المبردة تعيق حتما تطور التفاعل الكيميائي الحيوي أو التحويل بين الحالات التوافقية المختلفة أثناء عمل جزيئات البروتين. لمراقبة ديناميكيات بنية البروتين مباشرة عند الدقة الذرية عن طريق علم البلورات ، هناك حاجة إلى طرق قوية وروتينية لإجراء تجارب الحيود في درجة حرارة الغرفة ، الأمر الذي يتطلب ابتكارات تقنية في تسليم العينات وجمع البيانات وتحليل البيانات الخلفية. تحقيقا لهذه الغاية ، قدمت التطورات الحديثة في علم البلورات التسلسلي طرقا جديدة لالتقاط الصور الجزيئية للأنواع الهيكلية الوسيطة وقصيرة العمر في درجة حرارة الغرفة1،2،3. على النقيض من استراتيجية "مجموعة بيانات بلورة واحدة" المستخدمة على نطاق واسع في علم البلورات بالتبريد التقليدي ، يعتمد علم البلورات التسلسلي استراتيجية لجمع البيانات مماثلة لتلك الخاصة بالمجهر الإلكتروني بالتبريد أحادي الجسيم. على وجه التحديد ، يتم جمع البيانات التجريبية في علم البلورات التسلسلي في أجزاء صغيرة من عدد كبير من العينات الفردية ، تليها معالجة البيانات المكثفة التي يتم فيها تقييم كسور البيانات ودمجها في مجموعة بيانات كاملة لتحديد بنية 3D4. تخفف استراتيجية "البلورة الواحدة والطلقة الواحدة" بشكل فعال من تلف الأشعة السينية لبلورات البروتين في درجة حرارة الغرفة عبر استراتيجية الحيود قبل التدمير5.
نظرا لأن علم البلورات التسلسلي يتطلب عددا كبيرا من بلورات البروتين لإكمال مجموعة البيانات ، فإنه يطرح تحديات تقنية كبيرة للعديد من الأنظمة البيولوجية حيث تكون عينات البروتين محدودة و / أو تنطوي على معالجة بلورية دقيقة. هناك اعتبار مهم آخر وهو أفضل طريقة للحفاظ على سلامة البلورات في تجارب الحيود التسلسلي. تعالج طرق الحيود في الموقع هذه المخاوف من خلال السماح لبلورات البروتين بالحيود مباشرة من مكان نموها دون كسر ختم غرفة التبلور6،7،8،9. تتوافق هذه الطرق الخالية من المناولة بشكل طبيعي مع الحيود التسلسلي واسع النطاق. لقد أبلغنا مؤخرا عن تصميم وتنفيذ جهاز تبلور للحيود في الموقع بناء على مفهوم بلورة على بلورة - بلورات بروتينية تنمو مباشرة على الكوارتز أحادي البلورية11. يوفر هذا الجهاز "الكريستال على الكريستال" العديد من المزايا. أولا ، يتميز بالأشعة السينية ونافذة شفافة خفيفة مصنوعة من ركيزة كوارتز أحادية البلورية ، والتي تنتج القليل من تشتت الخلفية ، مما يؤدي إلى نسب إشارة إلى ضوضاء ممتازة في صور الحيود من بلورات البروتين. ثانيا ، الكوارتز أحادي البلورة هو حاجز بخار ممتاز مكافئ للزجاج ، وبالتالي يوفر بيئة مستقرة لتبلور البروتين. في المقابل ، تكون أجهزة التبلور الأخرى التي تستخدم ركائز قائمة على البوليمر عرضة للتجفيف بسبب نفاذية البخار ما لم يكن لمادة البوليمر سمك كبير ، مما يساهم بالتالي في تشتت الخلفية العالية10. ثالثا ، يتيح هذا الجهاز توصيل عدد كبير من بلورات البروتين إلى حزمة الأشعة السينية دون أي شكل من أشكال التلاعب بالبلورات أو حصادها ، وهو أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة البلورات11.
لتبسيط تجارب حيود الأشعة السينية التسلسلية باستخدام أجهزة الكريستال على الكريستال ، قمنا بتطوير نموذج أولي لمقياس الحيود لتسهيل التبديل السهل بين المسح الضوئي ووسائط حيود الأشعة السينية12. مقياس الحيود هذا له بصمة صغيرة وقد تم استخدامه لجمع البيانات التسلسلية في خطين شعاعيين لمصدر الفوتون المتقدم (APS) في مختبر أرغون الوطني. على وجه التحديد ، استخدمنا BioCARS 14-ID-B لحيود Laue و LS-CAT 21-ID-D للتذبذب أحادي اللون. جهاز مقياس الحيود هذا غير مطلوب إذا كان خط شعاع ليزر السنكروترون أو الأشعة السينية الإلكترون الحر مزودا بقدرتين رئيسيتين: (1) تحديد موضع العينة الآلية مع نطاق سفر يبلغ ±12 مم حول حزمة الأشعة السينية في جميع الاتجاهات. و (2) كاميرا رقمية على المحور لمشاهدة الكريستال تحت إضاءة الضوء آمنة لبلورات البروتين قيد الدراسة. يشكل جهاز الكوارتز أحادي البلورية جنبا إلى جنب مع مقياس الحيود المحمول وبرنامج التحكم للمسح البصري والتعرف على الكريستال وجمع البيانات الآلي في الموقع بشكل جماعي منصة inSituX لعلم البلورات التسلسلي. على الرغم من أن هذا التطور مدفوع في المقام الأول بتطبيقات علم البلورات الديناميكية باستخدام مصدر أشعة سينية متعدد الألوان ، فقد أثبتنا إمكانات هذه التقنية لدعم طرق التذبذب أحادية اللون10,12. مع الأتمتة ، توفر هذه المنصة طريقة جمع بيانات تسلسلية عالية الإنتاجية في درجة حرارة الغرفة مع استهلاك بروتين ميسور التكلفة.
في هذه المساهمة ، نصف بالتفصيل كيفية إعداد التبلور على الرقاقة في مختبر رطب وكيفية إجراء جمع بيانات الأشعة السينية التسلسلية على خط شعاع السنكروترون باستخدام منصة inSituX.
تستخدم طريقة الدفعات لإعداد التبلور على الرقاقة في ظل ظروف مماثلة لطريقة نشر البخار التي تم الحصول عليها لنفس عينة البروتين (الجدول 1). كنقطة بداية، نوصي باستخدام المرسب بتركيز 1.2-1.5x لطريقة انتشار البخار. إذا لزم الأمر ، يمكن تحسين حالة تبلور الدفعات بشكل أكبر عن طريق فحص الشبكة الدقيقة. رقائق الكوارتز ليست ضرورية لتجارب التحسين ؛ يمكن استخدام أغطية الزجاج بدلا من ذلك (انظر أدناه). يوصى باستخدام أجهزة التبلور المحملة جزئيا للحفاظ على تجارب التحسين على نطاق أصغر. تم تبلور عدد من عينات البروتين بنجاح على هذه الأجهزة باستخدام طريقة الدفعات10 (الجدول 1).
يتكون الجهاز نفسه من الأجزاء التالية: 1) حلقة خارجية. 2) اثنين من رقائق الكوارتز. 3) رقاقة واحدة تشبه غسالة من البلاستيك أو الفولاذ المقاوم للصدأ ؛ 4) حلقة الاحتفاظ ؛ 5) زيت الغمر المجهري كمادة مانعة للتسرب (الشكل 1). يعتمد الحجم الكلي لمحلول التبلور المحمل على شريحة واحدة على الغرض من التجربة. يمكن تعديل سعة غرفة التبلور عن طريق اختيار رقاقة بسماكات مختلفة و / أو قطر داخلي. نقوم بشكل روتيني بإعداد أجهزة تبلور بسعة 10-20 ميكرولتر باستخدام حشوات بسمك 50-100 ميكرومتر. يمكن لجهاز نموذجي إنتاج عشرات إلى آلاف بلورات البروتين الكافية لجمع البيانات التسلسلية (الشكل 2).
عند نجاحها ، ستنتج التبلور على الرقاقة عشرات إلى مئات أو حتى آلاف بلورات البروتين على كل جهاز كوارتز جاهز لحيود الأشعة السينية. عند خط شعاع السنكروترون ، يتم تثبيت هذا الجهاز على مرحلة ترجمة ثلاثية المحاور لمقياس الحيود باستخدام آلية حركية. يتم مسح نافذة التبلور لجهاز مثبت بصريا وتصويرها في عشرات إلى مئات الصور المجهرية. ثم يتم خياطة هذه الصور المجهرية في مونتاج عالي الدقة. بالنسبة للبلورات الحساسة للضوء ، يمكن إجراء المسح الضوئي تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء (IR) لتجنب التنشيط الضوئي غير المقصود. تم تطوير برنامج رؤية الكمبيوتر لتحديد وتحديد بلورات البروتين الموزعة عشوائيا على الجهاز. ثم يتم تصنيف هذه البلورات وفقا لحجمها وشكلها وموقعها لإعلام أو توجيه استراتيجية جمع البيانات في علم البلورات التسلسلي. على سبيل المثال ، يمكن وضع لقطات مفردة أو متعددة على كل بلورة مستهدفة. يمكن للمستخدمين التخطيط لمسار واحد أو طرق متعددة من خلال البلورات المستهدفة. لقد قمنا بتنفيذ برنامج لحساب طرق السفر المختلفة. على سبيل المثال ، يتم حساب أقصر طريق باستخدام الخوارزميات التي تعالج مشكلة البائع المتجول13. بالنسبة للتطبيقات البلورية الديناميكية لمسبار المضخة ، يمكن اختيار توقيت ومدة لقطات الليزر (المضخة) والأشعة السينية (المسبار). تتم برمجة جمع البيانات التسلسلية الآلية لنقل كل بلورة مستهدفة إلى حزمة الأشعة السينية واحدة تلو الأخرى.
تشمل المكونات الرئيسية لمقياس حيود insituX ما يلي: 1) حامل الجهاز. 2) مرحلة ترجمة ثلاثية المحاور ؛ 3) مصدر ضوء للمسح البصري ؛ 4) توقف شعاع الأشعة السينية. 5) ضخ الليزر إذا تمت دراسة البروتينات الحساسة للضوء ؛ 6) الحواسيب الصغيرة Raspberry Pi مجهزة بكاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء ؛ 7) برنامج التحكم لمزامنة المحركات والكاميرا ومصادر الضوء ومضخة الليزر والتفاعل مع عناصر التحكم في خط الشعاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التجميع المسبق للجهاز
- قم بتسمية الحلقة الخارجية (قطر 30 مم) لتحديد العينة. إذا لزم الأمر ، قم بتضمين اسم المشروع ورقم الجهاز وحالة التبلور والتاريخ (الشكل 1 أ). ضع الحلقة الخارجية رأسا على عقب على سطح نظيف (الشكل 1 ب) ، وضع رقاقة كوارتز واحدة بعناية داخل الحلقة (الشكل 1 ج). تعمل رقاقة الكوارتز الأولى هذه كنافذة مدخل للأشعة السينية الحادثة.
- صب كمية صغيرة من زيت الغمر المجهر (لزوجة 150 cSt) في طبق بتري. اغمس رقاقة في الزيت ، وتأكد من أن جانبي الرقاقة مزيتان بشكل صحيح (الشكل 1 د). قم بإزالة الزيت الزائد عن طريق وضع الرقاقة على سطح نظيف.
- ضع الرقاقة المزيتة فوق رقاقة الكوارتز الأولى (الشكل 1E).
ملاحظة: زيت الغمر هو مادة مانعة للتسرب ممتازة تحمي غرفة التبلور من فقدان البخار المحتمل. عادة ما تستمر الرقائق المجمعة بشكل صحيح لأسابيع دون تجفيف مرئي. يتم تنفيذ خطوة التجميع المسبق هذه تحت ضوء الغرفة. بالنسبة للعينات الحساسة للضوء ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة ، بما في ذلك تحميل العينات وتخزين الجهاز والمراقبة ، تحت ضوء الأمان.
2. تحميل العينة وتجميع الجهاز
- استخدم ماصة لخلط محلول البروتين ومحلول التبلور تماما على رقاقة الكوارتز الأولى. تتراوح نسبة الحجم بين عينة البروتين والمخزن المؤقت عادة من 2: 1 إلى 1: 2 (الشكل 1F). تأكد من أن الحجم الكلي لمحلول التبلور لا يتجاوز السعة القصوى لغرفة التبلور التي يحددها حجم الرقاقة وسمكها. تجنب فقاعات الهواء أثناء الخلط.
ملاحظة: يختلف تكوين مخزن التبلور المؤقت من تجربة إلى أخرى. راجع الجدول 1 لمعرفة ظروف التبلور. - ضع رقاقة الكوارتز الثانية فوق المحلول المختلط عندما يبدأ المحلول في الانتشار (الشكل 1G). تعمل رقاقة الكوارتز الثانية هذه كنافذة خروج للأشعة السينية المنحرفة.
- اضغط على رقاقة الكوارتز الثانية برفق على الحافة للمساعدة في نشر الزيت أثناء دفع الهواء للخارج. قم بتأمين الجهاز عن طريق شد حلقة التثبيت في الحلقة الخارجية (الشكل 1H). استخدم أداة شد إذا لزم الأمر (الشكل 1I). ضع في اعتبارك أن الإفراط في الشد قد يتسبب في تشوه رقائق الكوارتز الرقيقة أو حتى تشققها.
3. تخزين الجهاز وتحسين التبلور
- قم بتخزين الأجهزة المجمعة (الشكل 1J) في صندوق في درجة حرارة الغرفة أو داخل حاضنة مع التحكم في درجة الحرارة.
ملاحظة: قد تظهر بلورات البروتين في غضون ساعات قليلة إلى أيام بعد تجميع جهاز التبلور. يتم عرض النتائج النموذجية من التبلور على الرقاقة للعديد من عينات البروتين التمثيلية (الشكل 2). - مراقبة نمو البلورات من خلال مراقبة جهاز التبلور تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، قم بتحسين ظروف التبلور عن طريق تكرار الأقسام 1-3.
4. المعايرة
ملاحظة: يتم تشغيل البرامج والأوامر المذكورة في الأقسام أدناه في برنامج inSituX.
- قم بتركيب بلورة رقيقة من عقيق الألومنيوم الإيتريوم المخدر على حامل الرقائق (الشكل 3). تثبيت توقف شعاع. التقط صورا مضان بالأشعة السينية للشعاع المباشر عن طريق تشغيل البرنامج:
burnmark.py <الجهاز>.param
حيث <الجهاز> هو اسم يختاره المستخدم لجهاز التبلور..param هو اسم ملف يحتوي على معلمات تحكم خاصة بالجهاز. سيتم استبدال القيم الافتراضية تدريجيا بقيم محددة على طول البروتوكول. يتم عرض نموذج ملف <جهاز>.param في الملف التكميلي 1. - ابحث عن الموضع الدقيق لحزمة الأشعة السينية المباشرة عن طريق تشغيل برنامج تركيب ملف تعريف الحزمة:
beam.py <حرق الصورة> -d <الجهاز>
حيث <حرق الصورة> هو اسم ملف صورة مضان الأشعة السينية (الشكل 4).
ملاحظة: يحسب هذا البرنامج مواضع الحزمة المباشرة الدقيقة بالإضافة إلى حجم الحزمة. يشير موضع الشعاع إلى وجهة النقل لجميع البلورات من نفس الجهاز. يستخدم حجم الحزمة أيضا لتخطيط الهدف.
5. المسح الضوئي
- ضع جهاز تبلور في حامل الشريحة وقم بتأمين الجهاز باستخدام برغي إبهام (الشكل 3 أ).
- قم بتركيب حامل الشريحة على مرحلة الترجمة لمقياس الحيود من خلال آلية حركية (الشكل 3 ب).
- قم بتثبيت مصدر ضوء مناسب لالتقاط الصور المجهرية من النافذة البصرية للجهاز. يمكن استخدام الضوء الأبيض أو ضوء الأشعة تحت الحمراء أو أي ضوء آخر من اختيارك اعتمادا على حساسية الضوء لعينة البروتين بالإضافة إلى الغرض من التجربة.
- قم بتشغيل برنامج الفحص:
scan.py <الجهاز>.param
يلتقط هذا البرنامج مجموعة من الصور المجهرية التي يتم نقلها تلقائيا إلى أجهزة كمبيوتر مستخدم محددة. - قم بتشغيل برنامج التجانب على كمبيوتر مستخدم:
tile.py <الجهاز> -x-y
حيث < x > و
ملاحظة: عادة ما تستغرق الخطوتان 5.4 و5.5 بضع دقائق. يتراوح العدد الإجمالي للصور المجهرية من عدة عشرات إلى مئات حسب منطقة المسح والتكبير. - قم بتشغيل برنامج البحث عن البلورات:
findX.py <مونتاج> -c <الطول> <العرض> -w <إسفين> -x <حجم الشعاع>
حيث <المونتاج> هي الصورة المتجانبة. يقوم هذا البرنامج بالتعرف على الكريستال وتخطيط اللقطة. يشير <الطول > و <العرض> إلى حجم البلورة التي يمكن العثور عليها. إذا رغب المستخدم في تجنب البلورات الأصغر ، فيمكن استخدام <العرض> كقطع عن طريق تعيين رقم أكبر من أحجام البلورات الصغيرة غير المرغوب فيها. <إسفين> هي قيمة زاوية تحدد التسامح مع بلورات الشكل غير المنتظم. يشير <حجم الحزمة> إلى حجم الحزمة المباشر الذي تم الحصول عليه من ملف التعريف المناسب أعلاه (الخطوة 4.2 ؛ الشكل 4). أيضا ، يمكن للمستخدمين تعيين قيمة اسمية لزيادة تباعد اللقطات المستهدفة. تتيح هذه المعلمات الرئيسية اختيار بلورة محددة وتخطيط الهدف (الشكل 6).
6. حيود الأشعة السينية
- قم بإزالة مصدر الضوء وتثبيت توقف الشعاع. اضبط مسافة كاشف مناسبة. اتبع بروتوكول أمان خط الشعاع للبحث في قفص الأشعة السينية. افتح غالق الأشعة السينية ومصراع الليزر إن أمكن.
- قم بتشغيل برنامج جمع البيانات للحيود التسلسلي:
collect.py <الجهاز>.param -l <مدة الضوء>
يقوم هذا الأمر بتشغيل جمع البيانات حيث تتم زيارة جميع اللقطات المخطط لها واحدة تلو الأخرى وفقا لتسلسل مبرمج مسبقا. يتم نقل كل بلورة مستهدفة إلى موضع الحزمة (الخطوة 4.2). في كل محطة ، يتم أخذ التعرض للأشعة السينية مع أو بدون إضاءة ليزر في تأخير زمني محدد. يعرض الفيلم 1 تسلسلا آليا لجمع البيانات يعمل بتردد 1 هرتز. يتم جمع عشرات إلى مئات صور الحيود بشكل روتيني من جهاز تبلور واحد (الفيلم 2).
ملاحظة: معايرة القسم 4 والمسح البصري للقسم 5 قائمان بذاتهما في منصة inSituX ، وبالتالي ، يمكن نقلهما بالكامل إلى خط شعاع آخر. القسم 6 حيود الأشعة السينية يجب أن ينطوي على بعض التفاصيل في تشغيل خط الشعاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم نشر العديد من مجموعات البيانات التمثيلية في السنوات القليلة الماضية 10,12 جنبا إلى جنب مع النتائج البلورية والنتائج العلمية من مجموعة متنوعة من عينات البروتين ، بما في ذلك بروتينات وإنزيمات المستقبلات الضوئية ، على سبيل المثال ، مستقبلات ضوئية للأشعة فوق البنفسجية UV-B النباتية UVR8 ، وهو حمض نووي يعمل بالضوء لإصلاح photolyase PhrB10 ، وهو بروتين جديد لاستشعار الضوء الأحمر البعيد من كيناز الهستيدين الحسي متعدد المجالات 14 ، ومجالات المستشعر المزدوج الليجند / الضوء ، والوحدة الأساسية الحسية الضوئية ل bacteriophytochrome12. كنتائج تمثيلية ، نقوم بإدراج ظروف التبلور على الرقاقة لهذه البروتينات في الجدول 1 ، ونقارنها مباشرة بالظروف المستخدمة في طريقة انتشار البخار. نعرض هنا أربع دراسات حالة إضافية للتبلور على الرقاقة (الشكل 2) ومجموعة من أنماط الحيود في الموقع في فيلم (الفيلم 2). ويرد في الجدول 2 موجز لمجموعات البيانات التمثيلية في الموقع التي جمعت باستخدام هذا البروتوكول.
في حالة تمثيلية ، أدى علم البلورات بالتبريد إلى حيود ضعيف لبروتين مستقبلات ضوئية مستشعرة للضوء الأحمر البعيد على الأرجح بسبب حساسية الضوء ومحتوى المذيبات العالي (~ 80٪) من هذه البلورات14. كانت كثافات الإلكترون التي تم الحصول عليها من بيانات علم البلورات بالتبريد ملطخة للغاية بحيث لا يمكنها حل تشكل الكروموفور ، والذي يقع في قلب سؤالنا العلمي. باستخدام البروتوكول في الموقع ، تمكنا من تجنب تنشيط الضوء غير المقصود قبل الحيود وحصلنا على مجموعة بيانات داكنة في درجة حرارة الغرفة من أكثر من 800 بلورة. أدت مجموعة البيانات المظلمة هذه من حيود Laue التسلسلي في الموقع إلى كثافات إلكترونية تم حلها بشكل أفضل ، مما يسمح ببناء نموذج واثق لكروموفور bilin الذي يظهر شكلا غير معروف حتى الآن all-Z ، syn (الشكل 7A) 12،14. كشفت تجاربنا البلورية الديناميكية عن تغيرات مستحثة بالضوء في هذا البروتين المستقبلات الضوئية الحمراء البعيدة من خلال مقارنة البيانات من 4,352 بلورة في الظلام و 8,287 بلورة بعد إضاءة الضوء (الشكل 7). كشف تحليل أولي لخرائط الفرق المستحثة بالضوء عن حركات منسقة في ورقة β المركزية ، مما يشير إلى أهمية تكديس π-π بين حلقات البيرول للكروموفور والعديد من المخلفات العطرية (الشكل 7 ب ، ج). سيتم تقديم تحليل متعمق ونتائج علمية في مكان آخر.
الشكل 1: تجميع جهاز التبلور. تقدر تكلفة كل تجميع بمبلغ 30 دولارا أمريكيا مع رقاقتين من الكوارتز أحادي البلورية أو 10 دولارات أمريكية مع غطاءين زجاجيين. مكونات الأجهزة باستثناء الرقاقة قابلة لإعادة الاستخدام. (أ) الجانب المسطح للحلقة الخارجية محدد لأغراض تحديد الهوية. (ب) الحلقة الخارجية موضوعة رأسا على عقب على سطح نظيف. (ج) يتم وضع رقاقة كوارتز قطرها 1 بوصة بعناية في الداخل. يمكن أيضا استخدام رقاقة زجاجية بدلا من ذلك أثناء تجارب التبلور ولكنها غير متوافقة مع حيود الأشعة السينية. د: يتزيت كلا جانبي الرقاقة. (ه) توضع الرقاقة المزيتة على رقاقة الكوارتز الأولى. (و) يتم سحب محاليل البروتين والتبلور إلى مركز الشريحة وخلطها. (ز) تغطي شريحة كوارتز أو زجاج ثانية القطرة بحيث تنتشر بالتساوي على الشريحة. (H) حلقة التثبيت مثبتة فوق رقاقة الكوارتز الثانية. (I) يتم استخدام أداة شد لتشديد حلقة التجنيب برفق. (ي) جهاز مجمع بالكامل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: بلورات بروتينية تمثيلية تنمو على أجهزة الكوارتز. (أ) الوحدة الأساسية الحسية الضوئية لبكتيريا نباتية اللون (Pa497 في الجدول 1). (ب، ج) تركيبات مختلفة لمجال GAF الثالث من كيناز الهستيدين الحسي متعدد المجالات (2551g3 و 2551g3Δα1 في الجدول 1). (د) المجالات الحسية الترادفية من كيناز الهستيدين ثنائي الاستشعار (RECGAF في الجدول 1). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مقياس حيود InSituX . (أ) يتم تركيب جهاز تبلور في حامل الشريحة. على الرغم من أن الجهاز مثبت عموديا ، إلا أن البلورات المزروعة على الرقاقة لن تسقط ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الطبقة السائلة في الجهاز المجمع رقيقة جدا ، ويتم تثبيت البلورات على نواتها عند النمو. (ب) تم تركيب مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء للمسح البصري. تلتقط الكاميرا المنظر المضمن لبلورات البروتين على طول شعاع الأشعة السينية من خلال مرآة منشور (غير مرئية في الصورة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تركيب ملف تعريف الشعاع المباشر. تستخدم القنوات الحمراء والخضراء والزرقاء لصورة مضان الأشعة السينية لتناسب وظيفة غاوسية ثنائية الأبعاد. يعرض العمود الأيسر الصورة الأولية للقنوات الحمراء والخضراء والزرقاء. العمود الأوسط هو نتيجة التركيب مع موضع الشعاع الدقيق وحجمه. يعرض العمود الأيمن بقايا التركيب. إذا كانت سعة بقايا التركيب تمتد على جزء صغير من الصورة الأولية ، فإن تركيب ملف التعريف للحزمة المباشرة يكون ناجحا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تجانب الصورة . (أ) يتم التقاط مجموعة من الصور المجهرية البلورية أثناء المسح البصري. عادة ما يستغرق المسح الضوئي ونقل البيانات 1-2 دقيقة. تشترك الصور المجهرية المجاورة في شريط من المساحة المتداخلة ، أفقيا ورأسيا ، كما هو موضح بمربعات صفراء. (ب) يتم خياطة الصور المجهرية معا لعمل مونتاج عالي الدقة بناء على الارتباط الأمثل في المناطق المتداخلة. تستغرق هذه العملية عادة دقيقة على جهاز كمبيوتر محمول. يوضح المربع الأصفر المنطقة التي تم التقاطها بواسطة 2 × 2 صور مجهرية موضحة في (A). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التعرف على الكريستال وتخطيط اللقطة. تشير كل دائرة وردية إلى اللقطة الأساسية للبلورة. تشير الدوائر الصفراء إلى لقطات إضافية إذا كانت البلورة طويلة بما يكفي لوضع هذه اللقطات. تشير الخطوط الوردية إلى الطريق كحل لمشكلة البائع المتجول. يتم تجنب البلورات العنقودية والبلورات الأصغر إلى حد كبير. يمكن تعديل عدوانية العثور على البلورات كخيار findX.py (الخطوة 5.6). لن تترك استراتيجية "المبالغة" للقوة الغاشمة أي بلورة بدون لقطة ولكنها يمكن أن تنتج الكثير من صور الحيود ، ولكن لا يمكن معالجتها12. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: خرائط الكثافة الإلكترونية لمجال استشعار الضوء الأحمر البعيد لكيناز الهستدين . (أ) توضح خريطة 2Fo-Fc المحددة عند 2.5σ كثافات الإلكترونات المرتبطة بكروموفور البيلين في تشكل all-Z,syn 14. يتم تمييز حلقات Pyrrole من A إلى D. (B و C) خرائط الفرق بين الضوء والظلام المحددة عند ±2.5σ باللون الأخضر والأحمر ، على التوالي ، تسلط الضوء على اكتساب وفقدان كثافة الإلكترون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: مقارنة ظروف التبلور بين انتشار البخار وطريقة الدفعات على الرقاقة. يرتبط انتشار البخار وطرق التبلور ارتباطا وثيقا 10،14،15،16،17،18،19. بدءا من حالة انتشار البخار ، يمكن تحسين حالة مماثلة للتبلور على الرقاقة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 2: ملخص لمجموعات البيانات في الموقع التي تم جمعها مباشرة من أجهزة الكوارتز. يمكن جمع الآلاف من أنماط حيود Laue من عدة أجهزة تبلور. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الفيلم 1: مجموعة بيانات وهمية. يتم نقل البلورات المستهدفة إلى شعاع الأشعة السينية كما هو موضح بدائرة حمراء. تسلسل البلورات المستهدفة في هذا الفيلم لا يتبع حلا لمشكلة البائع المتجول. يتم إطلاق التعرض لأشعة الليزر والأشعة السينية في كل محطة مع تأخير مبرمج. يتم جمع صور الحيود. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 2: صور الحيود. يمكن جمع المئات من صور الحيود من جهاز تبلور واحد. تكفي العديد من الأجهزة لإنتاج مجموعة بيانات كاملة وزائدة عن الحاجة (الجدول 2). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الملف التكميلي 1: نموذج ملف
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واجه علم بلورات البروتين في السنوات الأولى الذي تم إجراؤه في درجة حرارة الغرفة صعوبة هائلة في مكافحة أضرار الأشعة السينية. وبالتالي ، فقد تم استبداله بطريقة البلورات بالتبريد الأكثر قوة حيث أصبحت مصادر الأشعة السينية السنكروترونية متاحة بسهولة20. مع ظهور ليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية ، تم إحياء علم بلورات البروتين في درجة حرارة الغرفة في السنوات الأخيرة ، مع العديد من التطورات الجديدة المدفوعة بالرغبة في مراقبة ديناميكيات بنية البروتين عند درجة حرارة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية 2,21. كان الدافع وراء تطوير منصة inSituX القائمة على أجهزة الكريستال على الكريستال هو نفس الطموح ، أي إنشاء طرق روتينية وقوية لجمع البيانات لدراسات علم البلورات الديناميكية في درجة حرارة الغرفة. طريقة حيود الأشعة السينية التسلسلية الآلية هذه قابلة للتطبيق أيضا على تحديد البنية الثابتة لبلورات البروتين غير القابلة للتجميد14. في هذا البروتوكول ، نقدم الاعتبارات الفنية الرئيسية جنبا إلى جنب مع الخطوات الحاسمة اللازمة لتقديم جمع بيانات درجة حرارة الغرفة باستخدام هذه المنصة. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لبلورات البروتين الهشة الحساسة للمعالجة الميكانيكية أو تلف الأشعة السينية أو التعرض للهواء.
تم اختبار النموذج الأولي للمنصة على نطاق واسع في خطين شعاعيين لعلم البلورات البروتينية في مصدر الفوتون المتقدم (APS) في مختبر أرجون الوطني. في حين أنه من السهل إلى حد ما إعداد التبلور على الرقاقة وفقا لهذا البروتوكول ، فإن خطوة جمع البيانات تتضمن العديد من مكونات الأجهزة والبرامج المخصصة. ونتيجة لذلك، قد يتطلب تطبيقه وتنفيذه لاستراتيجيات جمع البيانات الخاصة بمشروع معين تعاونا وثيقا بين المستخدمين وعلماء الخطوط الشعاعية. بمعنى آخر ، تقتصر هذه التقنية في شكلها الحالي على المستخدمين الذين لديهم وصول كاف إلى السنكروترونات مثل APS. ومع ذلك ، فإن سير العمل العام والخطوات الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول ستكون بمثابة مرجع أو دليل لأي مجموعة بحثية مهتمة بعلم البلورات البروتينية في درجة حرارة الغرفة.
الميزة الأكثر أهمية لهذه المنصة هي أنه لا يلزم التلاعب بالبلورات مثل التركيب أو التجميد بحيث تنحرف بلورات البروتين الحساسة في ظروف نقية. ميزة رئيسية أخرى هي أن استخدام ركيزة الكوارتز أحادية البلورية يؤدي إلى تشتت الخلفية قليلا جدا لصور حيود البروتين مع توفير بيئات مستقرة لتبلور البروتين على مدى فترة طويلة (أسابيع إلى شهور). ومع ذلك ، فإن هذه المنصة ليست مناسبة لفحص البلورات المتناثرة لأنها مخصصة لإنتاج الكريستال على نطاق واسع. على هذا النحو ، يلزم معرفة مسبقة بظروف التبلور لإعداد تجارب تبلور أولية على الرقاقة لعينة بروتين معينة.
في الممارسة العملية ، نجد أن بعض خطوات تجميع الجهاز ، مثل كيفية زيت الرقاقة (الخطوة 1.2) وكيفية إغلاق الجهاز (الخطوة 2.3) ، بقدر ما تبدو تافهة ، غالبا ما تؤثر بشكل مباشر على نتائج التبلور. قد يجف الجهاز بسرعة إذا لم يتم التزييت بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي الإفراط في شد الجهاز في الخطوة الأخيرة من التجميع إلى تشويه رقائق الكوارتز ، بينما يؤدي الشد الناقص إلى تسرب محتمل و / أو تبخر غير متحكم فيه من الجهاز. خطوة أخرى حاسمة هي التخطيط للقطات الأشعة السينية. يجب على المرء أن يتعامل بعناية مع البلورات العنقودية أو المزدحمة لتجنب أنماط الحيود المتداخلة التي يصعب معالجتها في كثير من الأحيان. يمكن التخفيف من هذه المشكلة عن طريق استخدام شعاع الأشعة السينية ذات التركيز الدقيق. من المحتمل أن يكون من الصعب الحصول على مجموعة بيانات كاملة إذا كان التشكل البلوري عبارة عن صفيحة رقيقة كبيرة بحيث تكون معظم الألواح موازية لنوافذ الكوارتز. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعادة تدوير رقائق الكوارتز أحادية البلورة وإعادة استخدامها بعد إجراء التنظيف الذي يتضمن الصابون والمذيبات العضوية التي تزيل حطام الزيت والبروتين. عادة ، يمكن تنظيف حوالي 80-90 ٪ من هذه الرقائق الحساسة دون ضرر للتجارب التالية. في حالة البلورات الصغيرة على خط شعاع دقيق التركيز ، عندما يجب تحقيق دقة أفضل في تحديد المواقع البلورية ، يمكن ترقية العديد من مكونات الأجهزة ، مثل المحركات الدقيقة ، والكاميرا والبصريات الأفضل ، والتكبير الأكبر ، وما إلى ذلك. ومع ذلك ، لا يقترب أي منها من القيود الحديثة. لذلك ، يتوفر متسع كبير للتحسين دون صعوبة كبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR هو مخترع رقائق الكريستال على الكريستال على براءة الاختراع الأمريكية 9632042 الممنوحة لشركة Renz Research، Inc.
Acknowledgments
تم دعم استخدام مصدر الفوتون المتقدم ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم يديره مختبر أرجون الوطني لوزارة الطاقة الأمريكية ، بموجب العقد DE-AC02-06CH11357. تم دعم استخدام BioCARS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب المنحة رقم R24GM111072. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تم دعم استخدام قطاع LS-CAT 21 من قبل مؤسسة ميشيغان للتنمية الاقتصادية ومنحة Michigan Technology Tri-Corridor 085P1000817. يتم دعم هذا العمل من خلال منح من جامعة إلينوي في شيكاغو ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01EY024363) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 2017274) إلى XY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M.
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N.
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W.
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
