Summary
この寄稿では、結晶オンクリスタルデバイスでタンパク質結晶化をセットアップする方法と、オンチップ結晶化プラットフォームを使用して室温で自動シリアルデータ収集を実行する方法について説明します。
Abstract
生化学反応と生物学的プロセスは、タンパク質がそれらの機能状態間でどのように移行するかを示すことによって最もよく理解できます。極低温は非生理学的であり、タンパク質の構造ダイナミクスを防止、抑止、さらには変化させる可能性があるため、室温での日常的なX線回折実験のための堅牢な方法が非常に望ましいです。このプロトコルで使用されるクリスタルオンクリスタルデバイスとその付属のハードウェアおよびソフトウェアは、サンプルを操作することなく、さまざまなサイズのタンパク質結晶を室温で その場 X線回折できるように設計されています。ここでは、デバイスの組み立て、オンチップ結晶化、光学スキャン、水晶認識からX線ショット計画、自動データ収集までの重要なステップのプロトコルを紹介します。このプラットフォームは、結晶の収穫やその他のサンプル操作を必要としないため、チップ上で成長した数百から数千のタンパク質結晶を、プログラム可能なハイスループットな方法でX線ビームに導入できます。
Introduction
X線放射の電離効果により、タンパク質結晶構造解析は、過去30年間の極低温条件に大部分が限定されてきました。したがって、その機能中のタンパク質運動に関する現在の知識は、主に極低温条件下で異なる状態で観察された静的構造間の比較から生じます。しかし、極低温は、タンパク質分子が働いている間、生化学反応または異なる立体構造状態間の相互変換の進行を必然的に妨げます。結晶構造解析によりタンパク質の構造ダイナミクスを原子分解能で直接観察するためには、室温での回折実験を行うための堅牢でルーチン的な方法が必要であり、サンプルデリバリー、データ収集、事後データ解析の技術革新が必要です。この目的のために、最近の連続結晶学の進歩は、室温で中間体および短寿命構造種の分子画像をキャプチャするための新しい手段を提供しました1,2,3。従来のクライオ結晶学で広く使用されている「1結晶1データセット」戦略とは対照的に、シリアル結晶構造解析は、単粒子クライオ電子顕微鏡と同様のデータ収集戦略を採用しています。具体的には、シリアル結晶学の実験データを多数の個々のサンプルから小さなフラクションに収集し、その後、データフラクションを評価して3D構造決定のための完全なデータセットに結合する集中的なデータ処理を行います4。この「ワンクリスタルワンショット」戦略は、破壊前の回折戦略5を介して、室温でのタンパク質結晶へのX線放射損傷を効果的に緩和します。
連続結晶構造解析は、データセットを完成させるために多数のタンパク質結晶を必要とするため、タンパク質サンプルが限られている、および/または繊細な結晶の取り扱いが伴う多くの生物学的システムにとって大きな技術的課題となります。もう一つの重要な考慮事項は、連続回折実験において結晶の完全性を最もよく維持する方法です。in situ回折法は、タンパク質結晶が結晶化チャンバー6,7,8,9のシールを壊すことなく、タンパク質結晶が成長する場所から直接回折できるようにすることで、これらの懸念に対処します。これらの取り扱い不要の方法は、大規模な連続回折と自然に互換性があります。我々は最近、単結晶水晶11上で直接成長させたタンパク質結晶という結晶オンクリスタルの概念に基づくin situ回折のための結晶化装置の設計と実装を報告した。この「クリスタルオンクリスタル」デバイスには、いくつかの利点があります。第一に、単結晶石英基板で作られたX線および光透過性の窓を特徴としており、バックグラウンド散乱がほとんどないため、タンパク質結晶からの回折画像において優れたS/N比が得られます。第二に、単結晶石英はガラスと同等の優れた蒸気バリアであり、それによってタンパク質結晶化のための安定した環境を提供する。対照的に、ポリマーベースの基板を使用する他の結晶化デバイスは、ポリマー材料が実質的な厚さを有しない限り、蒸気透過性のために乾燥する傾向があり、その結果、高いバックグラウンド散乱に寄与する10。第三に、この装置は、結晶の完全性を維持するために重要な、いかなる形態の結晶操作または収穫もなしに、多数のタンパク質結晶をX線ビームに送達することを可能にする11。
結晶オンクリスタルデバイスを使用した連続X線回折実験を合理化するために、光学スキャンモードとX線回折モードの切り替えを容易にする回折計のプロトタイプを開発しました12。この回折計は設置面積が小さく、アルゴンヌ国立研究所の先端光子源(APS)の2つのビームラインでのシリアルデータ収集に使用されています。具体的には、ラウエ回折にはBioCARS 14-ID-Bを、単色振動にはLS-CAT 21-ID-Dを用いました。この回折計ハードウェアは、シンクロトロンまたはX線自由電子レーザービームラインに2つの重要な機能を備えている場合は必要ありません:(1)X線ビームの周りの移動範囲が±12mmのすべての方向への電動サンプル位置決め。(2)研究中のタンパク質結晶に対して安全な光照明下での結晶観察用の軸上デジタルカメラ。単結晶石英デバイスは、ポータブル回折計、光学スキャン、結晶認識、および自動in situデータ収集用の制御ソフトウェアとともに、シリアル結晶学用のinSituXプラットフォームを構成します。この開発は主に多色X線源を用いた動的結晶学アプリケーションによって動機付けられていますが、単色振動法をサポートするこの技術の可能性を実証しました10,12。自動化により、このプラットフォームは、手頃な価格のタンパク質消費で室温での高スループットのシリアルデータ収集方法を提供します。
本稿では、ウェットラボでのオンチップ結晶化のセットアップ方法や、inSituXプラットフォームを用いたシンクロトロンビームラインでの連続X線データ収集方法について詳しく説明します。
バッチ法は、同じタンパク質サンプルに対して得られた蒸気拡散法と同様の条件下でオンチップ結晶化をセットアップするために使用されます(表1)。出発点として、蒸気拡散法の1.2〜1.5倍の濃度の沈殿剤を使用することをお勧めします。必要に応じて、バッチ結晶化条件は、ファイングリッドスクリーニングによってさらに最適化することができます。石英ウェーハは最適化試験には必要ありません。代わりにガラスカバースリップを使用できます(以下を参照)。最適化試行を小規模に保つために、部分的に負荷された結晶化装置をお勧めします。多数のタンパク質試料が、バッチ法10 を用いてそのような装置上で首尾よく結晶化された(表1)。
デバイス自体は次の部分で構成されています:1)外輪。2)2枚の石英ウェーハ。3)プラスチックまたはステンレス鋼の1つのワッシャーのようなシム。4)保持リング;5)シーラントとして顕微鏡浸漬油(図1)。1つのチップに装填された結晶化溶液の総量は、実験の目的によって異なります。結晶化チャンバーの容量は、異なる厚さおよび/または内径のシムを選択することによって調整することができる。厚さ50〜100μmのシムを用いて、容量10〜20μLの結晶化装置を日常的に設置しています。一般的なデバイスは、シリアルデータ収集に適した数万から数千のタンパク質結晶を生成できます(図2)。
オンチップ結晶化が成功すると、X線回折の準備が整った各石英デバイス上に数十から数百または数千のタンパク質結晶が生成されます。シンクロトロンビームラインでは、このような装置を運動機構を用いて回折計の3軸並進ステージに実装します。マウントされたデバイスの結晶化ウィンドウは、光学的にスキャンされ、数十から数百の顕微鏡写真で画像化されます。次に、これらの顕微鏡写真を高解像度のモンタージュにステッチします。感光性結晶の場合、意図しない光活性化を避けるために、赤外線(IR)光下で光学走査を行うことができます。デバイス上にランダムに分布するタンパク質結晶を識別して特定するためのコンピュータービジョンソフトウェアが開発されました。次に、これらの結晶は、そのサイズ、形状、および位置に従ってランク付けされ、シリアル結晶学におけるデータ収集戦略に情報を提供またはガイドします。たとえば、単一または複数のショットを各ターゲットクリスタルに配置することができます。ユーザーは、ターゲットのクリスタルを通過する単一のパスまたは複数のルートを計画できます。様々な走行ルートを計算するためのソフトウェアを実装しています。たとえば、最短ルートは、巡回セールスマン問題13 に対処するアルゴリズムを使用して計算されます。ポンププローブ動的結晶学アプリケーションでは、レーザー(ポンプ)およびX線(プローブ)ショットのタイミングと持続時間を選択できます。自動シリアルデータ収集は、ターゲットの各結晶を次々にX線ビームに移すようにプログラムされています。
insituX回折計の主要コンポーネントには、1)デバイスホルダーが含まれます。2)3軸平行移動ステージ。3)光学スキャン用の光源。4)X線ビームストップ。5)光感受性タンパク質が研究されている場合はレーザーを励起します。6)IR感度カメラを搭載したラズベリーパイマイコン。7)モーター、カメラ、光源、ポンプレーザーを同期させ、ビームライン制御とインターフェースするための制御ソフトウェア。
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Protocol
1.デバイスの事前組み立て
- サンプル識別のために外輪(直径30 mm)にラベルを付けます。必要に応じて、プロジェクト名、デバイス番号、結晶化条件、および日付を含めます(図1A)。外側のリングを裏返してきれいな面に置き(図1B)、リングの内側に石英ウェーハを1枚慎重に置きます(図1C)。この最初の石英ウェーハは、入射X線の入口窓として機能します。
- 少量の顕微鏡浸漬油(粘度150 cSt)をペトリ皿に注ぎます。シムをオイルに浸し、シムの両側に適切にオイルが塗られていることを確認します(図1D)。きれいな表面にシムを軽くたたいて、余分な油を取り除きます。
- 油を塗ったシムを最初の石英ウェーハの上に置きます(図1E)。
注意: 浸漬油は、結晶化チャンバーを潜在的な蒸気損失から保護する優れたシーラントです。適切に組み立てられたチップは通常、目に見える乾燥なしに数週間持続します。この組み立て前のステップは、室内の照明の下で実行されます。光に敏感なサンプルの場合、サンプルのローディング、デバイスの保管、観察など、後続のすべてのステップは安全灯の下で実行する必要があります。
2.サンプルローディングとデバイスアセンブリ
- ピペットを使用して、タンパク質溶液と結晶化バッファーを最初の石英ウェーハ上で完全に混合します。タンパク質サンプルとバッファーの容量比は、通常2:1から1:2の範囲です(図1F)。結晶化溶液の総体積が、シムのサイズと厚さによって決定される結晶化チャンバーの最大容量を超えないことを確認してください。混合中の気泡を避けてください。
注:結晶化バッファーの組成は実験ごとに異なります。結晶化条件については 表1 を参照されたい。 - 溶液が広がり始めたら、2番目の石英ウェーハを混合溶液の上に置きます(図1G)。この第2の石英ウェーハは、回折X線の出口窓として機能する。
- 2枚目の石英ウェーハの端を軽くたたいて、空気を押し出しながらオイルを広げます。保持リングを外輪にねじ込んでデバイスを固定します(図1H)。必要に応じて締め付け工具を使用します(図1I)。締めすぎると、デリケートな石英ウェーハが変形したり、ひびが入ったりする可能性があることに注意してください。
3. デバイスの保存と結晶化の最適化
- 組み立てたデバイス(図1J)を室温の箱に入れるか、温度制御付きのインキュベーター内に保管します。
注:タンパク質の結晶は、結晶化装置が組み立てられてから数時間から数日で現れることがあります。いくつかの代表的なタンパク質サンプルについて、オンチップ結晶化の典型的な結果を示します(図2)。 - 結晶化装置を顕微鏡で観察することにより、結晶成長をモニターする。必要に応じて、セクション1〜3の反復によって結晶化条件を最適化します。
4. キャリブレーション
メモ: 以下のセクションで説明するプログラムとコマンドは、inSituXソフトウェアで実行されます。
- ドープされたイットリウムアルミニウムガーネットの薄い結晶をチップホルダーに取り付けます(図3)。ビームストップを取り付けます。プログラムを実行して、直接ビームの蛍光X線画像を撮影します。
burnmark.py <デバイス>.param
ここで 、<デバイス> は、結晶化デバイスのユーザーが選択した名前です。 <デバイス>.param は、デバイス固有の制御パラメーターを含むファイル名です。デフォルト値は、プロトコルに沿って特定の値に徐々に置き換えられます。サンプル.param ファイルを 補足ファイル 1 に示します。 - ビームプロファイルフィッティングプログラムを実行して、直接X線ビームの正確な位置を見つけます。
beam.py <イメージの書き込み> -d <デバイス>
ここで 、<書き込み画像> は蛍光X線画像のファイル名です(図4)。
注:このプログラムは、正確な直接ビーム位置とビームサイズを計算します。ビーム位置は、同じデバイスからのすべての結晶の転座先を示します。ビームサイズは、ターゲット計画にも使用されます。
5.光学スキャン
- 結晶化デバイスをチップホルダーに入れ、つまみネジを使用してデバイスを固定します(図3A)。
- チップホルダーを運動機構を介して回折計の平行移動ステージに取り付けます(図3B)。
- デバイスの光学窓から顕微鏡写真を撮影するための適切な光源を設置します。白色光、IR光、またはタンパク質サンプルの光感度および実験の目的に応じて、選択した他の光を使用することができる。
- スキャンプログラムを実行します。
scan.py.param
このプログラムは、指定されたユーザーのコンピューターに自動的に転送される顕微鏡写真のセットをキャプチャします。 - ユーザーのコンピューターでタイル プログラムを実行します。
tile.py <デバイス> -x-y
ここで、
メモ: 手順 5.4 および 5.5 には通常数分かかります。顕微鏡写真の総数は、スキャン領域と倍率に応じて数十から数百の範囲です。 - 結晶探知プログラムを実行します。
findX.py <モンタージュ> -c <長さ> <幅> -w <ウェッジ> -x <ビームサイズ>
ここで 、<モンタージュ> はタイル画像です。このプログラムは、水晶認識とショットプランニングを実行します。 <長さ> と <幅> は、検出する結晶サイズを示します。ユーザーが小さな結晶を避けたい場合は、不要な小さな結晶のサイズよりも大きい数値を設定することにより、 <幅> をカットオフとして使用できます。 <くさび> は、不規則な形状の結晶の公差を設定する角度値です。 <ビームサイズ> は、上記のプロファイルフィッティングから得られる直接ビームサイズを指します(ステップ4.2; 図4)。また、ユーザーが公称値を設定して、ターゲットショットの間隔をさらに空けることができます。これらの重要なパラメータにより、特定の結晶の選択とターゲットの計画が可能になります(図6)。
6. X線回折
- 光源を取り外し、ビームストップを取り付けます。適切な検出器距離を設定します。ビームラインの安全プロトコルに従って、X線ハッチを検索します。該当する場合は、X線シャッターとレーザーシャッターを開きます。
- シリアル回折のデータ収集プログラムを実行します。
collect.py.param -l <光の持続時間>
このコマンドは、事前にプログラムされたシーケンスに従って、計画されたすべてのショットが次々に訪問されるデータ収集をトリガーします。ターゲットの各結晶はビーム位置に移動します(ステップ4.2)。各停止で、X線被曝は、スケジュールされた時間遅延でレーザー照明の有無にかかわらず撮影されます。動画 1 は、1Hzの周波数で動作する自動データ収集シーケンスを示しており、1つの結晶化装置から日常的に数十から数百の回折画像が収集されます(動画2)。
注:セクション4のキャリブレーションとセクション5の光学スキャンは、inSituXプラットフォームに自己完結型であるため、別のビームラインに完全に転送できます。セクション6 X線回折は、ビームラインの操作にいくつかの詳細を含める必要があります。
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Representative Results
いくつかの代表的なデータセットが過去数年間に公開されています10,12、例えば植物UV-B光受容体UVR8、光駆動DNA修復フォトリアーゼPhrB 10、マルチドメイン感覚ヒスチジンキナーゼからの新規遠赤色光センシングタンパク質など、光受容体タンパク質および酵素を含む多様なタンパク質サンプルからの結晶学的結果および科学的発見とともに14、リガンド/光デュアルセンサードメイン、およびバクテリオフィトクロム12の光感覚コアモジュール。代表的な結果として、これらのタンパク質のオンチップ結晶化条件を表1に列挙し、蒸気拡散法に用いた条件と直接比較した。ここでは、オンチップ結晶化の4つのケーススタディ(図2)と、動画のin situ回折パターンのコレクション(動画2)を示します。このプロトコルを使用して収集された代表的なin situデータセットを表2にまとめます。
代表的なケースでは、クライオ結晶構造解析は、おそらくこれらの結晶の光感受性と高い溶媒含有量(~80%)が原因で、遠赤色光感知光受容体タンパク質の回折不良を引き起こしました14。クライオ結晶構造解析データから得られた電子密度は、私たちの科学的問題の中心である発色団の立体配座を解決するにはあまりにも汚れていました。in situプロトコルを使用して、回折前の意図しない光の活性化を回避し、800を超える結晶から室温で暗いデータセットを取得することができました。in situシリアルラウエ回折からのこの暗いデータセットは、よりよく分解された電子密度をもたらし、これまで知られていなかったall-Z,synコンフォメーションを示すビリン発色団の信頼性の高いモデル構築を可能にしました(図7A)12,14。私たちの動的結晶構造解析実験は、暗闇の4,352個の結晶と光照射後の8,287個の結晶のデータを比較することにより、この遠赤色光受容体タンパク質の光誘起変化をさらに明らかにしました(図7)。光誘起差分マップの予備解析により、中央βシートに協調運動が見られ、発色団のピロール環といくつかの芳香族残基との間のπ πスタックの重要性が示唆されました(図7B、C)。詳細な分析と科学的発見は他の場所で提示されます。
図1:結晶化装置の組み立て。 各アセンブリの費用は、2枚の単結晶石英ウェーハで30米ドル、ガラスカバーガラス2枚で10米ドルと見積もられています。シム以外のハードウェアコンポーネントは再利用可能です。(A)外輪の平らな面は、識別のためにラベルが付けられています。(B)外輪をきれいな面に逆さまに置きます。(C)直径1インチの石英ウェーハを慎重に内部に配置します。結晶化試験中にガラスチップを代わりに使用することもできますが、X線回折とは互換性がありません。(D)シムの両側に油をさします。(E)油を塗ったシムを最初の石英チップに置きます。(F)タンパク質と結晶化溶液をチップの中心にピペットで移し、混合する。(G)2番目の石英またはガラスチップが液滴を覆い、チップ上に均等に広がるようにします。(h)保持リングを第2の石英ウェーハにねじ込みます。(I)締め付け工具を使用して、保持リングを穏やかに締めます。(J)完全に組み立てられたデバイス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:石英デバイス上で成長させた代表的なタンパク質結晶。 (a)バクテリオフィトクロム(表1のPa497)の光感覚コアモジュール。(B,C)マルチドメイン感覚ヒスチジンキナーゼからの第3のGAFドメインの異なる構築物(表1の2551g3および2551g3Δα1)。(d)デュアルセンサーヒスチジンキナーゼ(表1のRECGAF)由来のタンデム感覚ドメイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:inSituX回折計 。 (A)チップホルダーに結晶化装置を搭載。デバイスは垂直に取り付けられていますが、主に組み立てられたデバイスの液層が非常に薄く、成長時に結晶が核に固定されているため、チップ上に成長した結晶は落下しません。(B)光学スキャン用にIR光源が設置されています。カメラは、プリズムミラー(写真には見えない)を通してX線ビームに沿ったタンパク質結晶のインラインビューをキャプチャします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ダイレクトビームプロファイルフィッティング。 蛍光X線画像の赤、緑、青のチャンネルは、2次元ガウス関数を当てはめるために使用されます。左側の列には、赤、緑、青のチャンネルの生の画像が表示されます。中央の列は、正確なビーム位置とサイズのフィッティング結果です。右側の列には、フィット残差が表示されます。フィッティング残差の振幅が生画像のごく一部にまたがる場合、ダイレクトビームのプロファイルフィッティングは成功しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:画像のタイリング 。 (A)光学スキャン中に一連の結晶顕微鏡写真がキャプチャされます。光学スキャンとデータ転送には通常1〜2分かかります。隣接する顕微鏡写真は、黄色のボックスでマークされているように、水平方向と垂直方向に重なり合う領域のストリップを共有しています。(B)顕微鏡写真をつなぎ合わせて、重なり合う領域の最適な相関に基づいて高解像度のモンタージュを作成します。このプロセスは通常、ラップトップコンピュータで1分かかります。黄色のボックスは、(A)に示す2×2の顕微鏡写真で撮影した領域の輪郭です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:水晶認識とショットプランニング。 各ピンクの円は、クリスタルのプライマリショットを示します。黄色の円は、クリスタルがこれらのショットを配置するのに十分な長さである場合、追加のショットを示します。ピンクの線は、巡回セールスマン問題の解決策としてのルートを示しています。クラスター化された結晶やより小さな結晶はほとんど避けられます。結晶発見の積極性は、 findX.py のオプションとして調整できます(ステップ5.6)。ブルートフォースの「オーバーキル」戦略では、クリスタルがショットされないままになることはありませんが、多くの回折画像を生成できますが、処理できません12。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ヒスチジンキナーゼの遠赤色光センシングドメインの電子密度マップ 。 (A)2.5σ で輪郭を描いた2Fo-Fcマップは、オールZ,syn コンフォメーション14におけるビリン発色団に関連する電子密度を示しています。ピロール環A〜Dが記されている。(B と C)緑と赤でそれぞれ±2.5σ で輪郭を描かれた明暗差マップは、電子密度のゲインと損失を強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:蒸気拡散法とオンチップバッチ法の結晶化条件の比較。結晶化の蒸気拡散およびバッチ法は高度に相関している10、14、15、16、17、18、19。蒸気拡散条件から始めて、同様の条件をオンチップ結晶化用に最適化できます。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:水晶デバイスから直接収集された in situ データセットの要約。 何千ものラウエ回折パターンをいくつかの結晶化装置から収集することができます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ムービー 1: 模擬データ収集。 ターゲット結晶は、赤い円でマークされているようにX線ビームに変換されます。この映画のターゲットクリスタルのシーケンスは、巡回セールスマン問題の解決策に従っていません。レーザーとX線の露出は、プログラムされた遅延で各ストップで発射されます。回折画像が収集されます。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:回折画像。 1つの結晶化装置から数百の回折画像を収集することができます。完全で冗長性の高いデータセットを生成するには、いくつかのデバイスで十分です(表2)。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: サンプル <デバイス>.param ファイル。 小さなテキストファイルは、各結晶化装置に固有のいくつかの制御パラメータを収集します。これらのパラメータはデフォルト値で始まり、プロトコルが進むにつれてセクション4、5、および6でそれに応じて変更されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
室温で行われた初期のタンパク質結晶構造解析は、X線放射線損傷と戦うのに非常に困難でした。したがって、シンクロトロンX線源が容易に利用可能になったため、より堅牢なクライオ結晶学法に取って代わられました20。X線自由電子レーザーの出現により、室温のタンパク質結晶構造解析が近年復活し、生理学的に関連する温度でタンパク質の構造ダイナミクスを観察したいという願望に駆り立てられて多くの新しい開発が行われました2,21。クリスタルオンクリスタルデバイスに基づくinSituXプラットフォームの開発は、室温での動的結晶学研究のためのルーチンで堅牢なデータ収集方法を確立するという同じ野心によって動機付けられてきました。この自動シリアルX線回折法は、凍結に適さないタンパク質結晶の静的構造決定にも適用可能である14。このプロトコルでは、このプラットフォームを使用して室温データ収集を提供するために必要な重要な手順とともに、重要な技術的考慮事項を示します。この方法は、機械的取り扱い、X線放射線損傷、または空気曝露に敏感な壊れやすいタンパク質結晶に特に適しています。
プラットフォームのプロトタイプは、アルゴンヌ国立研究所のAdvanced Photon Source(APS)にある2つのタンパク質結晶構造解析ビームラインで広範囲にテストされています。このプロトコルに従ってオンチップ結晶化を設定するのはかなり簡単ですが、データ収集ステップには、いくつかのカスタムメイドのハードウェアおよびソフトウェアコンポーネントが含まれます。その結果、プロジェクト固有のデータ収集戦略の適用と実装には、ユーザーとビームライン科学者の間の緊密なコラボレーションが必要になる場合があります。言い換えれば、現在の形のこの技術は、APSなどのシンクロトロンに適切にアクセスできるユーザーに限定されています。それにもかかわらず、このプロトコルで説明されている全体的なワークフローと重要なステップは、室温タンパク質結晶学に関心のある研究グループの参照またはガイドとして役立ちます。
このプラットフォームの最も重要な利点は、繊細なタンパク質結晶が手付かずの状態で回折されるように、取り付けや凍結などの結晶操作が必要ないことです。もう一つの大きな利点は、単結晶石英基板を使用することで、タンパク質回折画像へのバックグラウンド散乱がほとんど発生せず、長期間(数週間から数ヶ月)にわたってタンパク質結晶化のための安定した環境を提供することです。ただし、このプラットフォームは大規模な結晶生産を目的としているため、スパースマトリックス結晶スクリーニングには適していません。そのため、特定のタンパク質サンプルの初期オンチップ結晶化試験を設定するには、結晶化条件に関する予備知識が必要です。
実際には、シムに油をさす方法(ステップ1.2)やデバイスをシールする方法(ステップ2.3)などのいくつかのデバイスアセンブリステップは、見た目は些細なことですが、結晶化の結果に直接影響することがよくあります。給油が適切に行われていないと、デバイスがすぐに乾く可能性があります。さらに、組み立ての最終ステップでデバイスを締めすぎると、石英ウェーハが変形する可能性があり、締め付けが不十分になると、デバイスからの潜在的な漏れや制御不能な蒸発が発生します。もう一つの重要なステップは、X線ショットの計画です。クラスター状または密集した結晶は、処理が困難な回折パターンが重なり合らないように慎重に処理する必要があります。この問題は、マイクロフォーカシングX線ビームを使用することで軽減できます。潜在的に、結晶形態が大きな薄いプレートであり、ほとんどのプレートが石英窓と平行である場合、完全なデータセットを取得することは困難になる可能性があります。さらに、単結晶石英チップは、油やタンパク質の破片を除去する石鹸や有機溶剤を含む洗浄手順の後にリサイクルおよび再利用できます。通常、これらの繊細なチップの約80〜90%は、次の実験のために損傷することなく洗浄できます。マイクロフォーカスビームライン上の小さな結晶の場合、結晶の位置決めでより高い精度を達成する必要がある場合、より細かいモーター、より優れたカメラと光学系、より大きな倍率など、いくつかのハードウェアコンポーネントをアップグレードすることができます。ただし、これらのいずれも最先端の制限に近いものではありません。したがって、それほど困難なく改善の余地は十分にあります。
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Disclosures
ZRは、レンツ・リサーチ社に付与された米国特許9632042上のクリスタル・オン・クリスタルチップの発明者です。
Acknowledgments
アルゴンヌ国立研究所が米国エネルギー省のために運営する科学局のユーザー施設であるAdvanced Photon Sourceの使用は、契約DE-AC02-06CH11357によってサポートされていました。BioCARSの使用は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所によって助成金番号R24GM111072で支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。LS-CATセクター21の使用は、ミシガン経済開発公社とミシガンテクノロジートライコリドー助成金085P1000817によってサポートされました。この研究は、イリノイ大学シカゴ校、国立衛生研究所(R01EY024363)、および国立科学財団(MCB 2017274)からのXYへの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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