Summary
Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.
Abstract
Biyokimyasal reaksiyonlar ve biyolojik süreçler, proteinlerin fonksiyonel durumları arasında nasıl geçiş yaptığını göstererek en iyi şekilde anlaşılabilir. Kriyojenik sıcaklıklar fizyolojik olmadığından ve protein yapısal dinamiklerini önleyebileceğinden, caydırabileceğinden ve hatta değiştirebileceğinden, oda sıcaklığında rutin X-ışını kırınım deneyleri için sağlam bir yöntem oldukça arzu edilir. Bu protokolde kullanılan kristal üzerine kristal cihazı ve beraberindeki donanım ve yazılım, herhangi bir numune manipülasyonu olmadan farklı boyutlardaki protein kristalleri için oda sıcaklığında in situ X-ışını kırınımını sağlamak üzere tasarlanmıştır. Burada cihaz montajı, çip üzerinde kristalizasyon, optik tarama, kristal tanımadan X-ışını çekim planlamasına ve otomatik veri toplamaya kadar önemli adımlar için protokolleri sunuyoruz. Bu platform kristal hasadı veya başka bir numune manipülasyonu gerektirmediğinden, çip üzerinde yetiştirilen yüz ila binlerce protein kristali, programlanabilir ve yüksek verimli bir şekilde bir X-ışını ışınına sokulabilir.
Introduction
X-ışını radyasyonunun iyonlaştırıcı etkileri nedeniyle, protein kristalografisi, büyük ölçüde, son otuz yılda kriyojenik koşullarla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, fonksiyonu sırasında protein hareketlerinin mevcut bilgisi, büyük ölçüde, kriyojenik koşullar altında farklı durumlarda gözlenen statik yapılar arasındaki karşılaştırmalardan kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, kriyojenik sıcaklıklar kaçınılmaz olarak biyokimyasal reaksiyonun ilerlemesini veya protein molekülleri çalışırken farklı konformasyonel durumlar arasındaki karşılıklı dönüşümü engeller. Kristalografi ile atomik çözünürlükte protein yapısal dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için, oda sıcaklığında kırınım deneyleri yapmak için sağlam ve rutin yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da numune sunumu, veri toplama ve posterior veri analizinde teknik yenilikler gerektirir. Bu amaçla, seri kristalografideki son gelişmeler,ara ürünlerin ve kısa ömürlü yapısal türlerin moleküler görüntülerini oda sıcaklığında 1,2,3 olarak yakalamak için yeni yollar sunmuştur. Geleneksel kriyokristalografide yaygın olarak kullanılan "bir-kristal-bir-veri kümesi" stratejisinin aksine, seri kristalografi, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobuna benzer bir veri toplama stratejisi benimser. Spesifik olarak, seri kristalografideki deneysel veriler, çok sayıda bireysel örneklemden küçük fraksiyonlar halinde toplanır, bunu veri fraksiyonlarının değerlendirildiği ve 3D yapı belirleme için eksiksiz bir veri kümesinde birleştirildiği yoğun veri işlemeizler 4. Bu "tek kristalli tek atış" stratejisi, yıkım stratejisi5'ten önce bir kırınım yoluyla oda sıcaklığında protein kristallerine X-ışını radyasyon hasarını etkili bir şekilde hafifletir.
Seri kristalografi, bir veri kümesini tamamlamak için çok sayıda protein kristali gerektirdiğinden, protein örneklerinin sınırlı olduğu ve / veya hassas kristal kullanımının söz konusu olduğu birçok biyolojik sistem için büyük teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bir diğer önemli husus, seri kırınım deneylerinde kristal bütünlüğünün en iyi şekilde nasıl korunacağıdır. In situ kırınım yöntemleri, protein kristallerinin kristalleşme odası 6,7,8,9'un mührünü kırmadan doğrudan büyüdükleri yerden difüzyon yapmalarına izin vererek bu endişeleri ele almaktadır. Bu elleçlemesiz yöntemler, büyük ölçekli seri kırınımla doğal olarak uyumludur. Son zamanlarda, kristal üzerine kristal konseptine dayanan in situ kırınım için bir kristalizasyon cihazının tasarımını ve uygulanmasını bildirdik - doğrudan monokristalin kuvars11 üzerinde yetiştirilen protein kristalleri. Bu "kristal üzerine kristal" cihaz çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, çok az arka plan saçılması üreten monokristalin kuvars substrattan yapılmış bir X-ışını ve ışık şeffaf pencereye sahiptir, bu nedenle protein kristallerinden kırınım görüntülerinde mükemmel sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanır. İkincisi, tek kristalli kuvars, cama eşdeğer mükemmel bir buhar bariyeridir, böylece protein kristalizasyonu için kararlı bir ortam sağlar. Buna karşılık, polimer bazlı substratlar kullanan diğer kristalizasyon cihazları, polimer malzeme önemli bir kalınlığa sahip olmadığı sürece buhar geçirgenliği nedeniyle kurumaya eğilimlidir, bu da sonuç olarak yüksek arka plan saçılmasına katkıda bulunur10. Üçüncüsü, bu cihaz, kristal bütünlüğünü korumak için kritik olan herhangi bir kristal manipülasyonu veya hasadı olmadan X-ışını ışınına çok sayıda protein kristalinin verilmesini sağlar11.
Kristal üzerine kristal cihazları kullanarak seri X-ışını kırınım deneylerini kolaylaştırmak için, optik tarama ve X-ışını kırınım modları12 arasında kolay geçişi kolaylaştırmak için bir difraktometre prototipi geliştirdik. Bu difraktometre küçük bir ayak izine sahiptir ve Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı'nın (APS) iki ışın çizgisinde seri veri toplama için kullanılmıştır. Özellikle, Laue kırınımı için BioCARS 14-ID-B ve tek renkli salınım için LS-CAT 21-ID-D kullandık. Bu difraktometre donanımı, bir senkrotron veya X-ışını serbest elektron lazer ışın hattı iki temel yetenekle donatılmışsa gerekli değildir: (1) X-ışını ışını etrafında her yöne ±12 mm'lik bir hareket aralığına sahip motorlu numune konumlandırma; ve (2) incelenen protein kristalleri için güvenli olan ışık aydınlatması altında kristal görüntüleme için eksen üstü bir dijital kamera. Monokristal kuvars cihazı, taşınabilir bir difraktometre ve optik tarama, kristal tanıma ve otomatik yerinde veri toplama kontrol yazılımı ile birlikte seri kristalografi için inSituX platformunu oluşturur. Bu gelişme öncelikle polikromatik bir X-ışını kaynağı kullanan dinamik kristalografi uygulamalarından kaynaklansa da, bu teknolojinin monokromatik salınım yöntemlerini destekleme potansiyelini gösterdik10,12. Otomasyon ile bu platform, uygun fiyatlı protein tüketimi ile oda sıcaklığında yüksek verimli bir seri veri toplama yöntemi sunar.
Bu katkıda, ıslak bir laboratuvarda çip üzerinde kristalizasyonun nasıl kurulacağını ve inSituX platformunu kullanarak bir senkrotron ışın hattında seri X-ışını veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Toplu iş yöntemi, aynı protein numunesi için elde edilen buhar difüzyon yöntemine benzer bir koşul altında çip üzerinde kristalizasyonu ayarlamak için kullanılır (Tablo 1). Başlangıç noktası olarak, buhar difüzyon yöntemi için bunun 1.2-1.5x konsantrasyonunda çökeltici kullanmanızı öneririz. Gerekirse, parti kristalizasyon koşulu ince ızgara taraması ile daha da optimize edilebilir. Kuvars gofretler optimizasyon denemeleri için gerekli değildir; bunun yerine cam kapaklar kullanılabilir (aşağıya bakınız). Optimizasyon denemelerini daha küçük ölçekte tutmak için kısmen yüklü kristalizasyon cihazları önerilir. Bir dizi protein örneği, parti yöntemi10 kullanılarak bu tür cihazlarda başarıyla kristalize edilmiştir (Tablo 1).
Cihazın kendisi aşağıdaki parçalardan oluşur: 1) bir dış halka; 2) iki kuvars gofret; 3) plastik veya paslanmaz çelikten bir yıkayıcı benzeri şim; 4) bir tutma halkası; 5) sızdırmazlık maddesi olarak mikroskop daldırma yağı (Şekil 1). Bir çipe yüklenen kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, deneyin amacına bağlıdır. Kristalizasyon odasının kapasitesi, farklı kalınlıklarda ve / veya iç çaplarda bir şim seçilerek ayarlanabilir. 50-100 μm kalınlığında şimler kullanarak rutin olarak 10-20 μL kapasiteli kristalizasyon cihazları kuruyoruz. Tipik bir cihaz, seri veri toplama için yeterli on binlerce protein kristali üretebilir (Şekil 2).
Başarılı olduğunda, çip üzerinde kristalizasyon, X-ışını kırınımı için hazır her kuvars cihazında onlarca ila yüzlerce hatta binlerce protein kristali üretecektir. Bir senkrotron ışın hattında, böyle bir cihaz, kinematik bir mekanizma kullanılarak difraktometrenin üç eksenli bir çeviri aşamasına monte edilir. Monte edilmiş bir cihazın kristalleşme penceresi optik olarak taranır ve onlarca ila yüzlerce mikrografta görüntülenir. Bu mikrograflar daha sonra yüksek çözünürlüklü bir montaja dikilir. Işığa duyarlı kristaller için, istenmeyen fotoaktivasyonu önlemek için kızılötesi (IR) ışık altında optik tarama yapılabilir. Cihaz üzerinde rastgele dağıtılan protein kristallerini tanımlamak ve bulmak için bir bilgisayarlı görme yazılımı geliştirilmiştir. Bu kristaller daha sonra seri kristalografide veri toplama stratejisini bilgilendirmek veya yönlendirmek için boyutlarına, şekillerine ve konumlarına göre sıralanır. Örneğin, hedeflenen her kristal üzerinde tek veya birden fazla atış bulunabilir. Kullanıcılar hedeflenen kristaller aracılığıyla tek bir geçiş veya birden fazla rota planlayabilirler. Çeşitli seyahat rotalarını hesaplamak için yazılım uyguladık. Örneğin, en kısa yol, seyahat eden satıcı problemini ele alan algoritmalar kullanılarak hesaplanır13. Pompa-prob dinamik kristalografik uygulamalar için, lazer (pompa) ve X-ışını (prob) çekimlerinin zamanlaması ve süresi seçilebilir. Otomatik bir seri veri toplama, hedeflenen her kristali birbiri ardına X-ışını ışınına dönüştürmek için programlanmıştır.
InsituX difraktometrenin temel bileşenleri şunlardır: 1) bir cihaz tutucu; 2) üç eksenli çeviri aşaması; 3) optik tarama için bir ışık kaynağı; 4) bir X-ışını ışını durdurma; 5) ışığa duyarlı proteinler incelenirse lazerleri pompalayın; 6) IR'ye duyarlı bir kamera ile donatılmış Raspberry Pi mikrobilgisayarı; 7) motorları, kamerayı, ışık kaynaklarını, pompa lazerini senkronize etmek ve ışın hattı kontrolleri ile arayüz oluşturmak için kontrol yazılımı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cihaz ön montajı
- Numune tanımlama için dış halkayı (30 mm çap) etiketleyin. Gerekirse, proje adını, cihaz numarasını, kristalleşme durumunu ve tarihini ekleyin (Şekil 1A). Dış halkayı temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirin (Şekil 1B) ve halkanın içine dikkatlice bir kuvars gofret yerleştirin (Şekil 1C). Bu ilk kuvars gofret, olay X-ışınları için bir giriş penceresi görevi görür.
- Petri kabına az miktarda mikroskop daldırma yağı (150 cSt'lik viskozite) dökün. Bir şimin yağa batırın ve şimin her iki tarafının da uygun şekilde yağlandığından emin olun (Şekil 1D). Şimleri temiz bir yüzeye sürterek fazla yağı çıkarın.
- Yağlanmış şimleri ilk kuvars gofretin üzerine yerleştirin (Şekil 1E).
NOT: Daldırma yağı, kristalizasyon odasını potansiyel buhar kaybından koruyan mükemmel bir sızdırmazlık maddesidir. Düzgün bir şekilde monte edilmiş talaşlar genellikle görünür kuruma olmadan haftalarca dayanır. Bu ön montaj adımı oda ışığı altında gerçekleştirilir. Işığa duyarlı numuneler için, numune yükleme, cihaz depolama ve gözlem dahil olmak üzere sonraki tüm adımlar güvenlik ışığı altında gerçekleştirilmelidir.
2. Numune yükleme ve cihaz montajı
- İlk kuvars gofret üzerindeki protein çözeltisini ve kristalizasyon tamponunu iyice karıştırmak için bir pipet kullanın. Protein numunesi ve tampon arasındaki hacim oranı tipik olarak 2: 1 ila 1: 2 arasında değişmektedir (Şekil 1F). Kristalizasyon çözeltisinin toplam hacminin, şim boyutu ve kalınlığı tarafından belirlenen kristalizasyon odasının maksimum kapasitesini aşmadığından emin olun. Karıştırma sırasında hava kabarcıklarından kaçının.
NOT: Bir kristalleşme tamponunun bileşimi bir deneyden diğerine değişir. Kristalleşme koşulları için Tablo 1'e bakınız. - İkinci kuvars gofreti, çözelti yayılmaya başladığında karışık çözeltinin üzerine yerleştirin (Şekil 1G). Bu ikinci kuvars gofret, kırınımlı X-ışınlarının çıkış penceresi olarak işlev görür.
- Havayı dışarı iterken yağın yayılmasına yardımcı olmak için ikinci kuvars gofrete hafifçe kenardan dokunun. Bir tutma halkasını dış bileziğe vidalayarak cihazı sabitleyin (Şekil 1H). Gerekirse bir sıkma aleti kullanın (Şekil 1I). Aşırı sıkmanın hassas kuvars gofretlerin deforme olmasına ve hatta çatlamasına neden olabileceğini unutmayın.
3. Cihaz depolama ve kristalizasyon optimizasyonu
- Monte edilen cihazları (Şekil 1J) oda sıcaklığında bir kutuda veya sıcaklık kontrollü bir inkübatörün içinde saklayın.
NOT: Protein kristalleri, bir kristalizasyon cihazı monte edildikten birkaç saat ila birkaç gün sonra ortaya çıkabilir. Birkaç temsili protein örneği için çip üzerinde kristalleşmeden elde edilen tipik sonuçlar gösterilmiştir (Şekil 2). - Kristalleşme cihazını mikroskop altında gözlemleyerek kristal büyümesini izleyin. Gerekirse, kristalleşme koşullarını bölüm 1-3'ün yinelemeleriyle optimize edin.
4. Kalibrasyon
NOT: Aşağıdaki bölümlerde belirtilen programlar ve komutlar inSituX yazılımında çalıştırılmaktadır.
- Talaş tutucuya ince bir katkılı itriyum alüminyum garnet kristali takın (Şekil 3). Kiriş durağını takın. Programı çalıştırarak doğrudan ışının X-ışını floresan görüntülerini alın:
burnmark.py.param
Burada, kristalizasyon aygıtı için kullanıcı tarafından seçilen bir addır. .param , cihaza özgü kontrol parametrelerini içeren bir dosya adıdır. Varsayılan değerler kademeli olarak protokol boyunca belirli değerlerle değiştirilecektir. Örnek bir.param dosyası Ek Dosya 1'de gösterilmiştir. - Kiriş profili uygulama programını çalıştırarak doğrudan X-ışını ışınının kesin konumunu bulun:
beam.py-d
Burada, X-ışını floresan görüntüsünün dosya adıdır (Şekil 4).
NOT: Bu program, hassas doğrudan ışın konumlarını ve ışın boyutunu hesaplar. Işın konumu, aynı cihazdan gelen tüm kristaller için translokasyon hedefini işaretler. Kiriş boyutu ayrıca hedef planlaması için de kullanılır.
5. Optik tarama
- Talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı yerleştirin ve cihazı bir parmak vida kullanarak sabitleyin (Şekil 3A).
- Talaş tutucuyu kinematik bir mekanizma ile difraktometrenin çeviri aşamasına monte edin (Şekil 3B).
- Mikrografları cihazın optik penceresinden almak için uygun bir ışık kaynağı takın. Beyaz ışık, IR ışığı veya tercih edilen diğer ışıklar, protein numunesinin ışık hassasiyetine ve deneyin amacına bağlı olarak kullanılabilir.
- Tarama programını çalıştırın:
scan.py.param
Bu program, belirtilen kullanıcı bilgisayarlarına otomatik olarak aktarılan bir dizi mikrografı yakalar. - Döşeme programını bir kullanıcı bilgisayarında çalıştırın:
tile.py-x -y
burada < x > ve
NOT: Adım 5.4 ve 5.5 genellikle birkaç dakika sürer. Toplam mikrograf sayısı, tarama alanına ve büyütmeye bağlı olarak birkaç on ila yüzlerce arasında değişmektedir. - Kristal bulma programını çalıştırın:
findX.py-c -w < kama> -x < boy>
buradadöşenmiş görüntüdür. Bu program kristal tanıma ve atış planlaması yapar. ve bulunacak kristal boyutunu gösterir. Kullanıcı daha küçük kristallerden kaçınmak isterse, , istenmeyen küçük kristallerin boyutlarından daha büyük bir sayı ayarlayarak kesme olarak kullanılabilir. , düzensiz şekilli kristallerin toleransını ayarlayan açısal bir değerdir. , yukarıdaki profil bağlantısından elde edilen doğrudan kiriş boyutunu ifade eder (adım 4.2; Şekil 4). Ayrıca, hedeflenen çekimleri daha fazla boşluk bırakmak için kullanıcılar tarafından nominal bir değer ayarlanabilir. Bu anahtar parametreler spesifik kristal seçimi ve hedef planlaması sağlar (Şekil 6).
6. X-ışını kırınımı
- Işık kaynağını çıkarın ve ışın durdurucuyu takın. Uygun bir dedektör mesafesi ayarlayın. X-ışını kulübesini aramak için ışın hattı güvenlik protokolünü izleyin. Varsa X-ışını deklanşörünü ve lazer deklanşörü açın.
- Seri kırınım için veri toplama programını çalıştırın:
collect.py.param -l <ışık süresi>
Bu komut, planlanan tüm çekimlerin önceden programlanmış bir diziye göre birbiri ardına ziyaret edildiği veri toplamayı tetikler. Hedeflenen her kristal ışın konumuna taşınır (adım 4.2). Her durakta, X-ışını maruziyeti, planlanan bir zaman gecikmesinde lazer aydınlatmalı veya lazer aydınlatmasız olarak alınır. Film 1, 1 Hz frekansında çalıştırılan otomatik bir veri toplama dizisini gösterir. rutin olarak onlarca ila yüzlerce kırınım görüntüsü tek bir kristalizasyon cihazından toplanır (Film 2).
NOT: Bölüm 4 kalibrasyonu ve bölüm 5 optik tarama, inSituX platformunda bağımsız olarak bulunur, bu nedenle tamamen başka bir ışın hattına aktarılabilir. Bölüm 6 X-ışını kırınımı, ışın hattı çalışmasında bazı detaylar içermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birkaç temsili veri kümesi yayınlanmıştır Son birkaç yılda 10,12, fotoreseptör proteinleri ve enzimleri de dahil olmak üzere çeşitli protein örneklerinden elde edilen kristalografik sonuçlar ve bilimsel bulgularla birlikte, örneğin, bir bitki UV-B fotoreseptörü UVR8, ışıkla çalışan bir DNA onarım fotoliyaz PhrB10, çok alanlı bir duyusal histidin kinazından yeni bir uzak kırmızı ışık algılama proteini 14 , ligand/ışık çift sensör alanları ve bir bakteriyofitokromun fotosensör çekirdek modülü12. Temsili sonuçlar olarak, bu proteinlerin çip üzerindeki kristalleşme koşullarını Tablo 1'de listeledik ve bunları buhar difüzyon yöntemi için kullanılan koşullarla doğrudan karşılaştırdık. Burada, çip üzerinde kristalleşmenin dört ek vaka çalışmasını (Şekil 2) ve bir filmdeki in situ kırınım modellerinin bir koleksiyonunu (Film 2) gösteriyoruz. Bu protokol kullanılarak toplanan temsili in situ veri kümeleri Tablo 2'de özetlenmiştir.
Temsili bir durumda, kriyokristalografi, muhtemelen ışık duyarlılığı ve bu kristallerin yüksek çözücü içeriği (~% 80) nedeniyle uzak kırmızı ışık algılayan bir fotoreseptör proteini için zayıf kırınıma yol açmıştır14. Kriyokristalografi verilerinden elde edilen elektron yoğunlukları, bilimsel sorumuzun merkezinde yer alan kromofor konformasyonunu çözemeyecek kadar bulaşmıştır. In situ protokolünü kullanarak, kırınımdan önce istenmeyen ışık aktivasyonunu önleyebildik ve 800'den fazla kristalden oda sıcaklığında karanlık bir veri kümesi elde ettik. In situ seri Laue kırınımından elde edilen bu karanlık veri kümesi, daha iyi çözülmüş elektron yoğunlukları ile sonuçlandı ve şimdiye kadar bilinmeyen bir all-Z, syn konformasyonu sergileyen iki kromozomun güvenli bir şekilde modellenmesini sağladı (Şekil 7A)12,14. Dinamik kristalografi deneylerimiz, karanlıkta 4.352 kristalden ve ışık aydınlatmasından sonra 8.287 kristalden elde edilen verileri karşılaştırarak bu uzak kırmızı fotoreseptör proteinindeki ışık kaynaklı değişiklikleri daha da ortaya çıkardı (Şekil 7). Işık kaynaklı fark haritalarının ön analizi, merkezi β tabakadaki uyumlu hareketleri ortaya çıkarmış ve bu da kromoforun pirrol halkaları ile çeşitli aromatik kalıntılar arasındaki π π istiflemenin önemini düşündürmektedir (Şekil 7B, C). Derinlemesine bir analiz ve bilimsel bulgular başka bir yerde sunulacaktır.
Resim 1: Kristalizasyon cihazı tertibatı. Her montajın iki monokristal kuvars gofret ile 30 ABD Doları'na veya iki cam kapak kayışı ile 10 ABD Doları'na mal olduğu tahmin edilmektedir. Şim dışındaki donanım bileşenleri yeniden kullanılabilir. (A) Dış halkanın düz tarafı tanımlama amacıyla etiketlenir. (B) Dış bilezik temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirilir. (C) 1 inç çapında bir kuvars gofret dikkatlice içine yerleştirilir. Bunun yerine kristalizasyon denemeleri sırasında bir cam çip de kullanılabilir, ancak X-ışını kırınımı ile uyumlu değildir. (D) Şimin her iki tarafı da yağlanmıştır. (E) Yağlanmış şim ilk kuvars çip üzerine yerleştirilir. (F) Protein ve kristalizasyon çözeltileri çipin merkezine pipetlenir ve karıştırılır. (G) İkinci bir kuvars veya cam çip, damlayı çipin üzerine eşit şekilde yayılacak şekilde kaplar. (H) İkinci kuvars gofret üzerine bir tutma halkası vidalanır. (I) Tutucu halkayı nazikçe sıkmak için bir sıkma aleti kullanılır. (J) Tamamen monte edilmiş bir cihaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kuvars cihazlarda yetiştirilen temsili protein kristalleri. (A) Bir bakteriyofitokromun fotosensoriyel çekirdek modülü (Tablo 1'de Pa497). (B,C) Üçüncü GAF alanının çok alanlı duyusal histidin kinazdan farklı yapıları (Tablo 1'de 2551g3 ve 2551g3Δα1). (D) Çift sensörlü histidin kinazdan tandem duyusal alanlar (Tablo 1'deki REGGAF). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: inSituX difraktometre . (A) Talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı monte edilmiştir. Cihaz dikey olarak monte edilmesine rağmen, çip üzerinde yetiştirilen kristaller düşmeyecektir, çünkü öncelikle monte edilmiş bir cihazdaki sıvı tabakası çok incedir ve kristaller büyürken çekirdeklerine sabitlenir. (B) Optik tarama için bir IR ışık kaynağı takılıdır. Kamera, X-ışını ışını boyunca protein kristallerinin satır içi görüntüsünü bir prizma aynasından yakalar (resimde görünmez). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Doğrudan kiriş profili bağlantısı. X-ışını floresan görüntüsünün kırmızı, yeşil ve mavi kanalları, iki boyutlu bir Gauss fonksiyonuna uymak için kullanılır. Sol sütunda kırmızı, yeşil ve mavi kanalların ham görüntüsü gösterilir. Orta kolon, hassas kiriş konumu ve boyutu ile montaj sonucudur. Sağ sütunda bağlantı artıkları görüntülenir. Bağlantı artıklarının genliği ham görüntünün küçük bir kısmını kapsıyorsa, doğrudan ışının profil montajı başarılı olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Görüntü döşeme . (A) Optik tarama sırasında bir dizi kristal mikrograf yakalanır. Optik tarama ve veri aktarımı genellikle 1-2 dakika sürer. Bitişik mikrograflar, sarı kutularla işaretlenmiş yatay ve dikey olarak üst üste binen bir alan şeridini paylaşır. (B) Mikrograflar, üst üste binen alanlardaki optimum korelasyona dayalı yüksek çözünürlüklü bir montaj yapmak için bir araya getirilir. Bu işlem genellikle bir dizüstü bilgisayarda bir dakika sürer. Sarı kutu, (A)'da gösterilen 2 x 2 mikrograf tarafından yakalanan alanı özetler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 6: Kristal tanıma ve atış planlaması. Her pembe daire bir kristalin birincil atışını işaret eder. Sarı daireler, bir kristal bu çekimleri konumlandırmak için yeterince uzunsa ek atışları işaretler. Pembe çizgiler, seyahat eden satıcı sorununa bir çözüm olarak bir rotayı işaretler. Kümelenmiş kristallerden ve daha küçük kristallerden büyük ölçüde kaçınılır. Kristal bulmanın agresifliği , findX.py için bir seçenek olarak ayarlanabilir (adım 5.6). Bir kaba kuvvet "aşırı öldürme" stratejisi, hiçbir kristali vurulmamış bırakmaz, ancak çok sayıda kırınım görüntüsü üretebilir, ancak işlenemez12. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bir histidin kinazının uzak-kırmızı-ışık algılama alanının elektron yoğunluk haritaları . (A) 2.5σ'de konturlanmış 2Fo-Fc haritası, bir all-Z, syn konformasyonu14'te iki kromofor ile ilişkili elektron yoğunluklarını göstermektedir. Pyrrole halkaları A'dan D'ye kadar işaretlenmiştir. (B ve C) Sırasıyla yeşil ve kırmızı renkte ±2,5σ konturlu açık-karanlık fark haritaları, elektron yoğunluklarının kazancını ve kaybını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Buhar difüzyonu ve talaş üstü parti yöntemi arasındaki kristalleşme koşullarının karşılaştırılması. Buhar difüzyonu ve kristalizasyonun parti yöntemleri yüksek oranda ilişkilidir 10,14,15,16,17,18,19. Bir buhar difüzyon koşulundan başlayarak, benzer bir durum çip üzerinde kristalleşme için optimize edilebilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Doğrudan kuvars cihazlarından toplanan yerinde veri kümelerinin özeti. Binlerce Laue kırınım paterni birkaç kristalizasyon cihazından toplanabilir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 1: Sahte bir veri toplama. Hedeflenen kristaller, kırmızı bir daire ile işaretlenmiş olarak X-ışını ışınına yerleştirilir. Bu filmde hedeflenen kristallerin sırası, seyahat eden satıcı sorununa bir çözüm getirmiyor. Lazer ve X-ışını maruziyetleri her durakta programlanmış bir gecikme ile ateşlenir. Kırınım görüntüleri toplanır. Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Film 2: Kırınım görüntüleri. Tek bir kristalizasyon cihazından yüzlerce kırınım görüntüsü toplanabilir. Tam ve yüksek oranda yedekli bir veri kümesi oluşturmak için birkaç cihaz yeterlidir (Tablo 2). Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: Örnek
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlk yıllarda oda sıcaklığında yapılan protein kristalografisi, X-ışını radyasyon hasarıyla mücadelede muazzam zorluklar yaşadı. Böylece, senkrotron X-ışını kaynakları kolayca kullanılabilir hale geldiğinden daha sağlam kriyokristalografi yöntemi ile değiştirildi20. X-ışını serbest elektron lazerlerinin ortaya çıkmasıyla, oda sıcaklığındaki protein kristalografisi, son yıllarda fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklıktaprotein yapısal dinamiklerini gözlemleme arzusuyla yönlendirilen birçok yeni gelişme ile yeniden canlandı 2,21. Kristal üzerine kristal cihazlara dayanan inSituX platformunun geliştirilmesi, aynı hırsla, yani oda sıcaklığında dinamik kristalografi çalışmaları için rutin ve sağlam veri toplama yöntemleri oluşturmak için motive edilmiştir. Bu otomatik seri X-ışını kırınım yöntemi, dondurmaya uygun olmayan protein kristalleri için statik yapı tayini için de geçerlidir14. Bu protokolde, bu platformu kullanarak oda sıcaklığında veri toplama sağlamak için gereken kritik adımlarla birlikte önemli teknik hususları sunuyoruz. Bu yöntem özellikle mekanik kullanıma, X-ışını radyasyon hasarına veya havaya maruz kalmaya duyarlı kırılgan protein kristalleri için uygundur.
Platform prototipi, Argonne Ulusal Laboratuvarı'nın Gelişmiş Foton Kaynağı'ndaki (APS) iki protein kristalografi ışın hattında kapsamlı bir şekilde test edilmiştir. Bu protokole göre çip üzerinde kristalizasyonun kurulması oldukça basit olsa da, veri toplama adımı birkaç özel yapım donanım ve yazılım bileşenini içerir. Sonuç olarak, projeye özgü veri toplama stratejilerinin uygulanması ve uygulanması, kullanıcılar ve ışın hattı bilim adamları arasında yakın işbirliği gerektirebilir. Başka bir deyişle, bu teknoloji mevcut haliyle APS gibi senkrotronlara yeterli erişimi olan kullanıcılarla sınırlıdır. Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan genel iş akışı ve temel adımlar, oda sıcaklığında protein kristalografisi ile ilgilenen herhangi bir araştırma grubu için bir referans veya rehber görevi görecektir.
Bu platformun en önemli avantajı, hassas protein kristallerinin bozulmamış koşullarda kırınımlanacağı şekilde montaj veya dondurma gibi kristal manipülasyonuna gerek olmamasıdır. Bir diğer önemli avantaj, monokristalin kuvars substratının kullanımının, protein kırınım görüntülerine çok az arka plan saçılmasına yol açarken, uzun süre (haftalar ila aylar) protein kristalizasyonu için kararlı ortamlar sunmasıdır. Bununla birlikte, bu platform büyük ölçekli kristal üretimi için tasarlandığı için seyrek matrisli kristal eleme için uygun değildir. Bu nedenle, belirli bir protein numunesi için ilk çip üzerinde kristalizasyon denemeleri yapmak için kristalleşme koşullarının önceden bilinmesi gerekir.
Uygulamada, bir şimin nasıl yağlanacağı (adım 1.2) ve bir cihazın nasıl kapatılacağı (adım 2.3) gibi bazı cihaz montaj adımlarının, göründükleri kadar önemsiz olduğu gibi, genellikle kristalleşmenin sonuçlarını doğrudan etkilediğini görüyoruz. Yağlama düzgün yapılmazsa bir cihaz hızla kuruyabilir. Ek olarak, montajın son adımında cihazın aşırı sıkılması kuvars gofretleri deforme edebilirken, az sıkma işlemi cihazdan potansiyel sızıntılara ve / veya kontrolsüz buharlaşmaya neden olabilir. Bir diğer kritik adım da X-ışını çekimlerini planlamaktır. Genellikle işlenmesi zor olan üst üste binen kırınım modellerini önlemek için kümelenmiş veya kalabalık kristallerle dikkatlice ilgilenilmelidir. Bu sorun, mikro odaklı bir X-ışını ışını kullanılarak hafifletilebilir. Potansiyel olarak, kristal morfolojisi büyük ince bir plaka ise, plakaların çoğunun kuvars pencerelere paralel olması için tam bir veri kümesinin elde edilmesi zor olabilir. Ek olarak, tek kristalli kuvars yongaları, yağ ve protein kalıntılarını gideren sabun ve organik çözücüleri içeren bir temizleme prosedüründen sonra geri dönüştürülebilir ve yeniden kullanılabilir. Genellikle, bu hassas yongaların yaklaşık% 80-90'ı bir sonraki deneyler için zarar görmeden temizlenebilir. Mikro odaklı bir ışın hattında küçük kristaller olması durumunda, kristal konumlandırmada daha iyi hassasiyet elde edilmesi gerektiğinde, daha ince motorlar, daha iyi kamera ve optik, daha fazla büyütme vb. gibi çeşitli donanım bileşenleri yükseltilebilir. Ancak, bunların hiçbiri son teknoloji sınırlamalara yakın değildir. Bu nedenle, çok fazla zorluk çekmeden iyileştirme için bol miktarda yer mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ZR, Renz Research, Inc.'e verilen ABD patent 9632042 kristal üzerine kristal çiplerin mucididir.
Acknowledgments
Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından ABD Enerji Bakanlığı için işletilen bir Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan Gelişmiş Foton Kaynağı'nın kullanımı, DE-AC02-06CH11357 sözleşmesi ile desteklenmiştir. BioCARS'ın kullanımı, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R24GM111072 hibe numarası ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. LS-CAT Sektör 21'in kullanımı, Michigan Ekonomik Kalkınma Şirketi ve Michigan Teknoloji Tri-Koridor hibesi 085P1000817 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Chicago'daki Illinois Üniversitesi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01EY024363) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (MCB 2017274) XY'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods. Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).
- Nogales, E., Scheres, S. H. W. Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity. Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).
- Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. Diffraction before destruction. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313 (2014).
- Kisselman, G., et al. X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).
- Liang, M., et al. Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).
- Perry, S. L., et al. In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device. Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).
- Ren, Z., et al. Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature. Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).
- Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).
- Ren, Z., et al. An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature. IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).
- Croes, G. A. A method for solving traveling salesman problems. Operations Research. 6, 791-812 (1958).
- Bandara, S., et al. Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118 (2021).
- Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).
- Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome. Nature. 479, 428-432 (2011).
- Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).
- Zeng, X., et al. Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8. Nature Plants. 1, 14006 (2015).
- Wang, M., et al. Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex. Biochemistry. 50, 581-590 (2011).
- Rodgrs, D. W. Cryocrystallography. Structure. 2, 1135-1140 (1994).
- Zhao, F. -Z., et al. A guide to sample delivery systems for serial crystallography. TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).
