Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico
Summary
Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.
Abstract
L’omeostasi redox mitocondriale è importante per la vitalità e la funzione neuronale. Sebbene i mitocondri contengano diversi sistemi redox, il glutatione tampone redox tiolo-disolfuro altamente abbondante è considerato un attore centrale nelle difese antiossidanti. Pertanto, la misurazione del potenziale redox del glutatione mitocondriale fornisce informazioni utili sullo stato redox mitocondriale e sullo stress ossidativo. La glutaredossina1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) è un indicatore raziometrico basato su proteine fluorescenti verdi (GFP) geneticamente codificate del potenziale redox del glutatione che ha due picchi di eccitazione sensibili allo stato redox a 400 nm e 490 nm con un singolo picco di emissione a 510 nm. Questo articolo descrive come eseguire la microscopia confocale dal vivo di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale. Descrive come valutare il potenziale redox del glutatione mitocondriale allo stato stazionario (ad esempio, per confrontare stati patologici o trattamenti a lungo termine) e come misurare i cambiamenti redox sui trattamenti acuti (usando il farmaco eccitotossico N-metil-D-aspartato (NMDA) come esempio). Inoltre, l’articolo presenta la co-imaging di Grx1-roGFP2 e l’indicatore del potenziale di membrana mitocondriale, tetrametilrodramina, estere etilico (TMRE), per dimostrare come Grx1-roGPF2 può essere multiplexato con indicatori aggiuntivi per analisi multiparametriche. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio a scansione laser confocale, (ii) applicare farmaci per la stimolazione seguiti dalla calibrazione del sensore con diammide e ditiotreitolo e (iii) analizzare i dati con ImageJ / FIJI.
Introduction
Diversi importanti enzimi mitocondriali e molecole di segnalazione sono soggetti alla regolazione redox del tiolo1. Inoltre, i mitocondri sono una delle principali fonti cellulari di specie reattive dell’ossigeno e sono selettivamente vulnerabili al danno ossidativo2. Di conseguenza, il potenziale redox mitocondriale influenza direttamente la bioenergetica, la segnalazione cellulare, la funzione mitocondriale e, infine, la vitalità cellulare3,4. La matrice mitocondriale contiene elevate quantità (1-15 mM) del glutatione tampone redox tiolo-disolfuro (GSH) per mantenere l’omeostasi redox e montare difese antiossidanti5,6. Il GSH può essere attaccato covalentemente alle proteine bersaglio (S-glutationilazione) per controllarne lo stato redox e l’attività ed è utilizzato da una serie di enzimi disintossicanti che riducono le proteine ossidate. Pertanto, il potenziale redox del glutatione mitocondriale è un parametro altamente informativo quando si studia la funzione mitocondriale e la fisiopatologia.
roGFP2 è una variante della GFP che è stata resa redox-sensibile dall’aggiunta di due ciste esposte in superficie che formano una coppia artificiale ditiolo-disolfuro7,8. Ha un singolo picco di emissione a ~ 510 nm e due picchi di eccitazione a ~ 400 nm e 490 nm. È importante sottolineare che le ampiezze relative dei due picchi di eccitazione dipendono dallo stato redox di roGFP2 (Figura 1), rendendo questa proteina un sensore raziometrico. Nel sensore Grx1-roGFP2, la glutaredossina-1 umana (Grx1) è stata fusa al N-terminus di roGFP29,10. L’attacco covalente dell’enzima Grx1 a roGFP2 offre due importanti miglioramenti del sensore: rende la risposta del sensore specifica per la coppia GSH/GSSG glutatione redox (Figura 1) e accelera l’equilibrio tra GSSG e roGFP2 di un fattore di almeno 100.0009. Pertanto, Grx1-roGFP2 consente l’imaging specifico e dinamico del potenziale redox del glutatione cellulare.
L’imaging Grx1-roGFP2 può essere eseguito su una vasta gamma di microscopi, tra cui microscopi a fluorescenza a campo largo, microscopi confocali a disco rotante e microscopi confocali a scansione laser. L’espressione del sensore nei neuroni primari può essere ottenuta con vari metodi che includono la lipofezione11, la coprecipitazione DNA/calcio-fosfato12, il trasferimento genico mediato da virus o l’uso di animali transgenici come fonte cellulare (Figura 2). Per gli esperimenti in questo articolo sono stati utilizzati virus adeno-associati ricombinanti pseudotipizzati (rAAV) contenenti un rapporto 1:1 delle proteine del capside AAV1 e AAV2 13,14. Con questo vettore, l’espressione massima del sensore viene in genere raggiunta 4-5 giorni dopo l’infezione e rimane stabile per almeno due settimane. Abbiamo utilizzato con successo Grx1-roGFP2 nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale di topi e ratti.
In questo articolo, l’espressione mediata da rAAV di Grx1-roGFP2 mirato ai mitocondri nei neuroni primari dell’ippocampo e corticale del ratto viene utilizzata per valutare lo stato redox del glutatione mitocondriale basale e la sua perturbazione acuta. Viene fornito un protocollo per l’imaging confocale dal vivo con istruzioni dettagliate su come (i) ottimizzare le impostazioni del microscopio confocale a scansione laser, (ii) eseguire un esperimento di imaging dal vivo e (iii) analizzare i dati con FIJI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le misurazioni quantitative e dinamiche dello stato redox mitocondriale forniscono importanti informazioni sulla fisiologia mitocondriale e cellulare. Sono disponibili diverse sonde chimiche fluorogeniche che rilevano specie reattive dell’ossigeno, “stress redox” o “stress ossidativo”. Tuttavia, questi ultimi termini non sono ben definiti e spesso mancano di specificità9,17,18. Rispetto ai coloranti chimici, Grx1-roGFP2 offre d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PER 2289: BA 3679/4-2). A.K. è supportato da una borsa di studio ERASMUS+. Ringraziamo Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner e Andrea Schlicksupp per la preparazione dei neuroni primari. Ringraziamo il Dr. Tobias Dick per aver fornito pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Gli esperimenti mostrati nella Figura 4 sono stati eseguiti presso il Nikon Imaging Center, Università di Heidelberg. La figura 2 è stata preparata con BioRender.com.
Materials
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
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