Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Trådløs optogenetisk styring af dygtig motorisk adfærd

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Den nuværende protokol beskriver, hvordan man bruger trådløs optogenetik kombineret med højhastigheds videografi i en enkelt pellet reach-to-grasp opgave til at karakterisere de neurale kredsløb, der er involveret i udførelsen af dygtig motorisk adfærd i frit bevægelige mus.

Abstract

Finmotorik er afgørende i hverdagen og kan kompromitteres i flere nervesystemforstyrrelser. Erhvervelsen og udførelsen af disse opgaver kræver sensorisk-motorisk integration og involverer præcis styring af bilaterale hjernekredsløb. Implementering af unimanuelle adfærdsmæssige paradigmer i dyremodeller vil forbedre forståelsen af hjernestrukturernes bidrag, som striatum, til kompleks motorisk adfærd, da det tillader manipulation og registrering af neural aktivitet af specifikke kerner i kontrolforhold og sygdom under udførelsen af opgaven.

Siden oprettelsen har optogenetik været et dominerende redskab til at forhøre hjernen ved at muliggøre selektiv og målrettet aktivering eller hæmning af neuronale populationer. Kombinationen af optogenetik med adfærdsmæssige assays kaster lys over de underliggende mekanismer for specifikke hjernefunktioner. Trådløse hovedmonterede systemer med miniaturiserede lysdioder (LED'er) muliggør fjernbetjent optogenetisk kontrol i et helt frit bevægeligt dyr. Dette undgår begrænsningerne i et kablet system, der er mindre restriktivt for dyrs adfærd uden at gå på kompromis med lysemissionseffektiviteten. Den nuværende protokol kombinerer en trådløs optogenetik tilgang med højhastigheds videografi i en unimanuel fingerfærdighedsopgave for at dissekere bidraget fra specifikke neuronale populationer til finmotorisk adfærd.

Introduction

Motorisk dygtig adfærd er til stede under de fleste bevægelser udført af os, og det vides at være påvirket i flere hjernesygdomme 1,2,3,4,5,6. Implementering af opgaver, der gør det muligt at studere udviklingen, læringen og udførelsen af dygtige bevægelser, er afgørende for at forstå motorfunktionens neurobiologiske grundlag, især i modeller af hjerneskade, neurodegenerative og neuroudviklingsforstyrrelser 2,7,8,9,10,11,12,13 . At række ud efter og hente genstande sker rutinemæssigt i hverdagens handlinger, og det er en af de første motoriske færdigheder, der er erhvervet under tidlig udvikling og derefter raffineret gennem årene 5,6. Det omfatter en kompleks adfærd, der kræver sensorisk-motoriske processer såsom opfattelsen af objektets funktioner, bevægelsesplanlægning, handlingsvalg, bevægelsesudførelse, kropskoordinering og hastighedsmodulering 7,14,15,16. Således kræver unimanuelle opgaver med høj fingerfærdighed deltagelse af mange hjernestrukturer på begge halvkugler 16,17,18,19,20,21,22. Hos mus er den enkelte pellet reach-to-grasp-opgave karakteriseret i flere faser, der kan styres og analyseres separat 7,13,23. Denne funktion gør det muligt at studere bidraget fra specifikke neuronale subpopulationer på forskellige stadier af erhvervelse og adfærd ydeevne og giver en platform for detaljerede undersøgelser af motorsystemer 13,23,24. Bevægelsen sker om et par sekunder; højhastighedsvideografisk bør således anvendes til kinematisk analyse i forskellige faser af den faglærte motorbane 7,25. Flere parametre kan udtrækkes fra videoerne, herunder kropsholdning, bane, hastighed og type fejl25. Kinematisk analyse kan bruges til at detektere subtile ændringer under trådløs optogenetisk manipulation 7,23.

Brug af miniaturiserede lysdioder (LED'er) til at levere lys via et trådløst hovedmonteret system gør det muligt at have fjernoptogenetisk kontrol, mens dyret udfører opgaven. Den trådløse optogenetiske controller accepterer enkeltpuls- eller kontinuerlige udløserkommandoer fra en stimulator og sender infrarøde (IR) signaler til en modtager, der er tilsluttet den miniaturiserede LED23,26. Den nuværende protokol kombinerer denne trådløse optogenetik-tilgang med højhastighedsvideoografi af en fingerfærdighedsopgave for at dissekere specifikke neuronale populationers rolle under udførelsen af finmotorisk adfærd23. Da det er en unimanuel opgave, giver det mulighed for at vurdere deltagelsen af strukturer i begge halvkugler. Traditionelt styrer hjernen kroppens bevægelse på en meget asymmetrisk måde; Opgaver med høj fingerfærdighed kræver imidlertid omhyggelig koordinering og kontrol fra mange hjernestrukturer, herunder ipsilaterale kerner og differentielt bidrag fra neuronale subpopulationer inden for kerner 10,20,21,22,23. Denne protokol viser, at subkortikale strukturer fra begge halvkugler styrer forbenets bane23. Dette paradigme kan være egnet til at studere andre hjerneområder og modeller af hjernesygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne vedrørende anvendelse af dyr blev udført efter lokale og nationale retningslinjer og godkendt af den tilsvarende Institutional Animal Care and Use Committee (Institute of Cellular Physiology IACUC protocol VLH151-19). Drd1-Cre transgene hanmus27, 35-40 dage efter fosteret med C57BL/6 baggrund blev anvendt i den nuværende protokol. Mus blev holdt under følgende betingelser: temperatur 22±1 °C; fugtighed 55%; lysplan 12/12 timer med slukket lys kl. 19.00 og blev fravænnet på postnatal dag 21. Fravænnede hvalpe blev anbragt i grupper af samme køn på 2-5. Dyrene blev anbragt i statiske huse med mikrobarrieretoppe. Sengetøj bestod af sterile asp spåner. Gnaverpiller og RO-renset vand blev leveret ad libitum, undtagen når det blev noteret.

1. Kirurgiske indgreb

  1. Forbered en LED-kanyle i den ønskede længde i henhold til de dorsoventrale koordinater for den interessante struktur (ideelt set 0,5 mm længere for at tage højde for kraniets tykkelse for det dorsolaterale striatum 3,5 mm) (figur 1).
    1. Skær glasfiberen i en længde, der er længere end den endelige ønskede størrelse, slib fiberspidsen til mållængden med groft sandpapir, og poler til sidst fiberspidsen med fint sandpapir.
      BEMÆRK: LED-kanyle er en optisk glasfiber med en diameter på 250 μm, der er fastgjort til en infrarød modtager (se materialetabel).
  2. Træk glaspipetter (1,14 mm udvendig diameter, 0,53 mm indvendig diameter og 3,5 i længden) til nanoinjektoren med en vandret trækker (se Materialetabel) og opbevar dem til senere. Programmér aftrækeren i en løkke for at få en spidsdiameter på 15-20 μm med en lang gradvis hældningsspids (4-5 mm).
  3. Forbered operationsområdet ved grundigt at desinficere det stereotaksiske apparat, emhætten, mikroinjektoren (se materialetabellen) og de omgivende overflader med 70 % ethanol.
    BEMÆRK: Et stereotaksisk apparat til mus er afgørende for at injicere Adeno Associated Virus (AAV'er) præcist og placere LED-kanylen i det område, der er af interesse.
  4. Brug det passende personlige beskyttelsesudstyr til proceduren, herunder en ren laboratoriefrakke eller engangs kirurgisk kjole, sterile handsker, ansigtsmaske og engangshovedhætte.
  5. Placer det nødvendige udstyr tæt på operationsområdet, såsom sterile kirurgiske værktøjer, bomuldsspidser, opløsninger, mikropipette, pipettespidser, kapillærer, mikrofyld med mineralolie og markør.
  6. Fyld en pipette til mikroinjektioner med mineralolie og læg den i mikroinjektoren. Sørg for, at mikroinjektoren fungerer korrekt ved at skubbe noget mineralolie ud.
    BEMÆRK: Alle instrumenter, der anvendes under operationen, skal være autoklavede og sterile. Aseptisk teknik bør anvendes.
  7. Bedøve dyr med gasformig isofluran 4-5% for at fremkalde anæstesi og 1,2% under hele operationen med 0,5-1 l / min ren ilt. Operationen begynder først, efter at dyret har nået et punkt med dyb anæstesi, vurderet ved fraværet af pote tilbagetrækning efter en lille knivspids.
    1. Overvåg kontinuerligt dyrets vejrtrækningshastighed og temperatur. Oprethold kropstemperaturen ved hjælp af en varmepude, der er indstillet til 34 °C.
  8. Påfør en oftalmisk salve. Fjern hår fra hovedbunden med en trimer og hårfjerningscreme. Tør hovedbunden af med vatpinde med 8% povidon-jod (se materialetabel) og 70% ethanol vekslet tre gange hver.
  9. Placer musen i det stereotaksiske apparat og fastgør hovedet, og sørg for, at kraniet er nivelleret i de mediolaterale og forreste bageste akser.
  10. Lav et snit på 1 cm med en skalpel gennem hovedbunden på niveau med øjnene langs sagittalaksen. Træk huden tilbage for at udsætte kraniet og rengør periosteum med vatpinde.
  11. Rengør kranieoverfladen med saltopløsning og sterile vatpinde. Løs enhver blødning på overfladen ved hjælp af sterile absorberende øjenspyd (se Materialetabel) eller lignende sterilt absorberende materiale.
  12. Påfør en dråbe 2,5% hydrogenperoxid med en vatpind og lad den virke i et par sekunder for at gøre kraniet suturer synlige og få en bedre reference. Efter et par sekunder rengøres grundigt med en ren vatpind.
  13. Med glaspipetten (15 μm endelig spidsdiameter) skal du finde bregma og lambda for at kontrollere, at kraniet er nivelleret i den forreste bageste akse.
    BEMÆRK: Det anbefales at have et stereoskopisk mikroskop eller USB-mikroskop for at se spidsen af glaspipetten. Hvis det er nødvendigt, skal du justere mundholderens højde for at udjævne kraniet.
  14. Flyt kapillæren mod de valgte forreste-bageste (AP) og mediale-laterale (ML) koordinater (dorsolateral striatum AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Mal et referencepunkt i hovedbunden over de valgte koordinater med en steril markør.
  15. I referencepunktet skal du udføre en kraniotomi med en diameter på ~1 mm, der påfører et blidt tryk på kraniet med et sterilt roterende værktøj eller tandbor ved lav til medium hastighed med et lille rundt tandbor (se materialetabel).
  16. Læg kapillæren med 300-400 nL Cre-afhængig adeno-associeret virus (AAV) såsom AAV1-dflox-hChR-2-mCherry for at udtrykke Channelrhodopsin eller en AAV for kun at udtrykke reporterproteinet (f.eks. mCherry) som en kontrol i det område, der er af interesse (se tabel over materialer). Kontroller, at spidsen ikke er tilstoppet, og indfør derefter glaspipetten i hjernen ved de ønskede dorso-ventrale (DV) koordinater (dorsolateral striatum DV -3,35 mm).
    1. Injicer 200 nL ved hjælp af en automatisk injektor med en hastighed på 23 nL/s. Vent i 10 minutter efter afslutningen af injektionen, træk glaspipetten langsomt ud for at undgå spild.
      BEMÆRK: Det er muligt at bruge en 30 G nål til at injicere med den relevante mikroinjektor.
  17. Rengør og tør eventuelle rester med vatpinde.
  18. Fastgør den sterile glas LED-kanyle til den stereotaxiske arm, og kalibrer koordinaterne ved hjælp af bregma som reference. Indsæt kanylen meget langsomt (300 μm/min) for at undgå vævsskade, og anbring den 100 μm over injektionsstedet.
  19. Når LED-kanylen er på plads, tilsæt en dråbe (100 μL) vævsklæbemiddel i kanten af kraniotomien.
  20. Forbered tandcementblandingen (se Materialetabel) efter producentens anvisninger for at fastgøre fiberen til kraniet.
    BEMÆRK: Brug kort sagt et kølet porcelænsfad for at få mere arbejdstid, før cement sætter sig. Tilsæt 2 skefulde harpiks klart pulver til porcelænsfadet, tilsæt 4 dråber hurtig base og 1 dråbe katalysator, bland derefter godt. Forholdet mellem pulver og væske kan justeres, hvis der er behov for en tyndere eller tykkere viskositet.
  21. Brug en steril børste til at påføre tandcementblandingen omkring kanylestikket lidt efter lidt og opbygge lag, indtil kraniet er dækket, og stikket er sikkert fastgjort til kraniet, hvilket efterlader stifterne helt frie. Undgå at få tandcement på musens hud.
  22. Tillad tørring helt.
  23. Luk huden omkring implantatet ved hjælp af vævsklæbemiddel (se Materialetabel).
  24. Anbring musen i et genopretningsbur over en varmepude ved 33 ° C. Overvåg for tilstedeværelsen af et eller flere af følgende tegn på smerte / ubehag: 1) Bøjet op, manglende eller reduktion af motoraktivitet, 2) Manglende pleje afspejlet i en uplejet snavset pels, 3) Overdreven slikning eller ridser, rødme på snitstedet, 4) aggressiv adfærd, 5) anoreksi eller dehydrering, og 6) Manglende rededannelse.
    BEMÆRK: Hold musen individuelt buret inde under alle procedurer for at undgå implantatafskærmning. I tilfælde af løsrivelse af kanylen udføres eutanasi ved at injicere 150 mg/kg natriumpentobarbital efterfulgt af halshugning, efter at dyb anæstesi er nået.
  25. Injicer subkutant (SC) meloxicam 1 mg/kg en gang dagligt i tre dage efter operationen for at give analgesi.
  26. Vent mindst 7 dage for fuldstændig genopretning og 14 dage for opsinudtryk før yderligere procedurer.
    BEMÆRK: Udfør en postoperativ opfølgning hver 12. time i tre dage, og kontroller derefter dyr hver dag indtil dagen for eutanasi i slutningen af forsøget.

2. Reach-to-grasp træning

  1. På dag 7 efter operationen skal du starte protokollen om fødevaremangel28. Vej mus i tre på hinanden følgende dage for at bestemme deres gennemsnitlige ad libitum kropsvægt. Planlæg derefter fødevarebegrænsninger, så dyrene får nok næringsstoffer til at opretholde ca. 90% og ikke mindre end 85% af kropsvægten.
    BEMÆRK: Dette opnås ved at levere 2,5-3 g mad dagligt. Overvåg dyrenes vægt dagligt og score for det generelle velbefindende ved at observere dyrs adfærd og udseende, for eksempel pels og øjnes udseende. Brug kropstilstandsscoringssystemet fra reference29.
  2. I løbet af fortrænings-, trænings- og testperioderne skal hver mus forsynes med 20 pellets (20 mg støvfri chokoladesmagede pellets) dagligt (se materialetabel) (spist under opgaven eller efter) ud over standardfødepillerne.
  3. Tre dage før tilvænning spredes 0,4 g / dyr / dag 20 mg støvfri chokoladesmagede pellets i deres hjemmebure, så mus bliver bekendt med de pellets, der tjener som en belønning under reach-to-grasp-opgaven.
  4. Habituate mus ved at placere dem 10 min i testkammeret en dag før fortræning med pellets spredt på kammergulvet (figur 1A).
  5. Tillad mad dagligt efter træning og test. Hold en lignende tidsplan hver dag.
  6. På den første dag med fortræning skal du placere musene i rækkevidde-til-gribe-kammeret og observere forfra. Placer pellets foran kammeret tæt på åbningen, så de begynder at forbruge pellets. På dette stadium får mus lov til at gribe pellets i enhver form.
  7. På dag to af fortræningen skal du placere pellets længere og længere fra åbningen, indtil de får dem til indrykningen (1 cm fra åbningen), så mus kan forme deres rækkevidde-til-greb-bevægelse (figur 1C).
  8. Træn mus til at løbe bagerst i buret og vende tilbage til buråbningen for at modtage den næste foderpille som en strategi til at individualisere forsøg.
    BEMÆRK: Dette kan opnås ved at vente, indtil musen er bag i buret, før du placerer en pellet i fordybningen for hvert forsøg.
  9. Placer pellets, der skal gribes af enten deres højre eller venstre pote.
    BEMÆRK: Mus begynder at bruge fortrinsvis en pote til at gribe, som vil blive brugt de følgende dage med træning og test.
  10. Træn dyr i 6 dage i daglige sessioner, der varer 20 forsøg, eller indtil der maksimalt er gået 10 minutter. Fra træningens dag 2 skal du sætte mock-modtageren (dimensioner 12 x 18 x 7 mm, 1 g, se Tabel over materialer), så mus bliver vant til vægten, mens de udfører opgaven (figur 1B). Hver dag scorer antallet af hit og ubesvarede forsøg.
  11. Optag adfærd med et almindeligt kamera, og optag 30-60 billeder/s fra forsiden af kammeret. Derudover kan man placere et spejl under træningskammeret i en 45° vinkel for at overvåge dyrenes kropsholdning (figur 1D,E).
  12. For post-hoc kinematisk analyse (figur 2) monteres et højhastighedskamera (se materialetabellen) i en vinkel på 45° for at optage fra siden af buret. Hvis der kræves en 3D-analyse, skal du placere et andet højhastighedskamera til at optage i en 35 ° vinkel fra forsiden af kammeret; begge kameraer skal placeres i højre eller venstre side af buret afhængigt af dyrenes sidedness og skal fange med samme billedhastighed og synkroniseres7 (figur 3D,E).
  13. Indstil højhastighedskameraerne til 100 billeder/s med en opløsning på 376 x 252 pixels eller mere, hvis det er muligt. Placer hvide styrofoamvægge bag siderne og bagsiden af kammeret for at reducere baggrunden og øge kontrasten (figur 1E).
  14. På testdagen skal mock-enheden udskiftes med en infrarød modtager til trådløs optogenetisk stimulering (figur 1B,C).
  15. Når mus begynder at nå, skal du dreje LED-kanylen manuelt med fjernbetjeningen for at få en kontinuerlig stimulering i det tidsrum, hvor adfærden udføres, og i højst 2 s. Programmering af et automatisk stimuleringsparadigme er at foretrække. Stimuleringsenheden udløser en LED på 470 nm (blåt lys) med en intensitet på spidsen på 1,0 mW/mm2.
  16. Saml videoerne til yderligere undersøgelse, herunder scoring og kinematisk analyse.

3. Post-hoc histologisk bekræftelse

  1. Efter afslutningen af et eksperiment skal du bekræfte viral ekspression og LED-kanyleplacering. Anetiser dyret med en cocktail af ketamin 100 mg/kg og xylazin 10 mg/kg. Når musen viser tegn på dyb bedøvelse (trin 1.7), perfuseres med iskold fosfatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 4% PFA.
  2. Fjern implanteret kanyle forsigtigt ved at tage et fast greb om stikket med tang og trække forsigtigt op.
  3. Uddrag og efterfikser hjernen i 24 timer i 4% PFA23.
  4. Udfør 3-10 minutters vask med PBS.
  5. Skær hjernen i 50 μm sektioner ved hjælp af et mikrotome (se Tabel over materialer).
  6. Monter sektionerne i dias med hårdt indstillede monteringsmedier med DAPI for at plette kerner og dække dias.
  7. Efter tørring skal sektionerne under det konfokale mikroskop observeres, og den implanterede kanyleplacering og ekspression af Ch2R smeltet sammen med ethvert fluorescerende protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reach-to-grasp-opgaven er et paradigme, der i vid udstrækning bruges til at studere formgivning, læring, ydeevne og kinematik af fine færdighedsbevægelser under forskellige eksperimentelle manipulationer. Mus lærer at udføre opgaven på et par dage og opnå mere end 55% nøjagtighed ved at nå et plateau efter 5 dages træning (figur 2A,B). I lighed med det, der tidligere er blevet rapporteret, udfører en procentdel af dyrene ikke opgaven korrekt (29,62 %), og disse bør udelukkes fra yderligere analyse30. Disse omfatter en delmængde af ikke-lærende mus (6/54 mus, 11,1%), der fra begyndelsen af træningen savner målet, der sigter for langt fra pelleten eller udfører gribebevægelsen, før de er i den rigtige position over pelleten. I løbet af de første træningsdage udførte en anden gruppe opgaven med høj nøjagtighed, men begyndte at udføre dårligt ved at sigte for langt fra pelleten på dag 3-4 (10/54 mus, 18,51%). Inden for denne gruppe begynder nogle mus at træne ved hjælp af en foretrukken pote, men ændrer deres præference efter et par dage; dette er tidligere blevet diskuteret af Chen et al., 201430.

Reach-to-grasp-bevægelsen er meget stereotyp fra forsøg til forsøg og inden for dyr (figur 2). Anvendelsen af højhastighedsvideoografi gør det muligt at spore bevægelsesbanen, hvilket gør det muligt at analysere kinematik i forskellige faser i kontroltilstanden og under optogenetisk stimulering (figur 1E og figur 2C). Denne tilnærmelse resulterer i en kvantificerbar vurdering af parametre som tilbagelagt afstand, hastighed, acceleration, slutpunkt og bane (figur 2 C-E). Det er muligt at analysere både multi-reach forsøg, hvor musen når flere gange, før pelleten hentes, og enkeltforsøgshændelser, hvor musen henter pelleten i en enkelt rækkeviddebevægelse. Forsøget er færdigt, når dyr skubber pillen væk eller genoptager forsøget ved at gå bagerst i buret. En kvantitativ sammenligning af baner under forskellige eksperimentelle betingelser opnås med hovedkomponentanalyse (PCA) efterfulgt af k-middelklyngedannelse (figur 3J-K)23,25.

Under de fleste træningspas undlader mus undertiden at forstå pelleten (ubesvarede forsøg). Nogle manipulationer ændrer antallet af ubesvarede forsøg og dermed nøjagtigheden af opgaven. Derefter er det vigtigt at analysere forskelle mellem hit og ubesvarede forsøg. I vores hænder skyldes ubesvarede forsøg ændringer i tre forskellige faser af bevægelsen: (1) poten ændrer sin bane, før den krydser kammeråbningen (indledende fejl), (2) poten ændrer sin bane, efter at poten krydser åbningen (endelig fejl), og (3) manglende opsamling af pelleten (gribefejl) (figur 2 I,J)13 . Et generelt kendetegn ved ubesvarede forsøg er, at mus starter gribebevægelsen længere væk fra pelleten (slutpunktet) sammenlignet med hitforsøg (figur 2G). Derudover måles misser forbundet med musestillingen som signifikante forskelle i kropsvinkel mellem hit og ubesvarede forsøg (figur 2H).

Afhængigt af strukturen eller neuronal population målrettet mod optogenetik, kan man forvente differentielle virkninger over adfærd 7,19,23,31,32,33. Den nuværende protokol beskriver virkningen af at aktivere spiny projektionsneuroner (SPN'er) i striatum i kontralaterale eller ipsilaterale halvkugler om den foretrukne pote, som musen anvender under den nående bevægelse (figur 3). Kontralateral aktivering af D1-dopamin, der udtrykker SPN'er, som giver oprindelse til de basale ganglier direkte vej, reducerede gribesucces til 64,9±8,8% sammenlignet med kontrolbetingelser (figur 3B). Kinematisk analyse afslører, at potebanen under optogenetisk stimulering beskrev et oscillerende mønster, vist ved en stigning i den rejste afstand til 218,4±19,2% af kontrollen, hvilket førte til manglende evne til at målrette pelleten og en stigning i den oprindelige fejltype I (figur 3F). PCA-analyse viser, at alle forsøgs baner under kontralateral D1 SPN-aktivering adskilt i en klynge med næsten ingen overlapning med en kontrolklynge, hvilket indikerer en lav lighed (figur 3J-K).

På den anden side fører aktivering af dSPN'er i den ipsilaterale side til en stigning i banespredningen vist ved PCA-analyse (figur 3K) uden at påvirke opnåelsen af succes (120,7±23,6%, n = 4), den samlede tilbagelagte afstand (136,3±35,5%) eller maksimal hastighed i den nående fase (117,3±10,3%) (figur 3C), hvilket indikerer, at ipsilateral D1 SPN-aktivering i nogen grad ændrede den nående bane uden at ændre adfærdsresultatet (figur 3G-I ). Kinematisk analyse indikerer subtile ændringer i bevægelseskontrol ved ipsilateral manipulation. Endelig viser kropsholdningsanalyse et skift i kropsvinkel under kontralateral D1SPN-aktivering (figur 3L). Det fremhæves, at selv denne enkle opgave har mange komponenter, der tillader korrekt bevægelsesudførelse for at nå et mål.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentel opsætning. (A) Skemaer over adfærdskammeret. Et kammer lavet af akrylplade med følgende dimensioner i cm: 18,5 (h) x 8,5 (b) x 20 (d) med et frontvindue 1 (b) x 5 (h) og en lille hylde 8,5 (b) x 4 (d). (B) Fotografi af LED-kanyle (venstre) og trådløs modtager (højre). (C) Set fra siden af en mus med den implanterede LED-kanyle tilsluttet modtageren, mens du udfører opgaven med at nå til greb (den hvide pilespids viser modtageren, stjernen viser tandcementen, der holder kanylen, og den tomme pilespids viser pillen). (D) Skitse af forsøgsopstillingen. To højhastighedskameraer registrerer rækkevidden i to dimensioner, mens en tredje har samlet et panoramabillede af opgaven, herunder musens placering fra spejlet under kammeret. Dyr var frie til at vælge deres foretrukne pote, og stimuleringssider henviser altid til siden af den foretrukne pote. (E) Kameraernes nøjagtige placering og repræsentative billede af hvert kamera under en prøveperiode. Dette tal er tilpasset fra reference23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kinematisk analyse af at nå adfærd. (A) Tidslinje for forsøget fra dag-0 (d0) til dag-25 (d25). (B) Ydeevne under reach-to-grasp-opgaven over tid målt som pelletshentningsnøjagtighed (samlet antal vellykkede greb/samlet antal forsøg x 100). (C) Eksempel på banesporing fra en højhastighedsvideo. (D) Potens individuelle baner under hit- og missede forsøg. (E) Samlet afstand, som poten har tilbagelagt under de ramte og ubesvarede forsøg. (F) Acceleration af poten gennem banen i de ramte og ubesvarede forsøg plottet som afstand vs. hastighed. (G) Sammenfatning af endepunkternes afstand i hits = 3,16 mm, misser 6,08 mm (Mann-Whitney-Wilcoxon testsavnet vs. hit U = 4184, s<0,0001, n = 28 mus). (H) Forskelle i kropsvinkel i de to slags forsøg, misser = 8,4±5,3°, rammer 6,7±4° (Mann-Whitney-Wilcoxon test U = 6437, P = 0,0243, n = 28 mus). (I) Skemaer over de tre typer fejl. (J) Andele af de tre slags fejl, som musene har begået under kontrolforhold. Dette tal er tilpasset fra reference23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Optogenetisk aktivering af kontralaterale og ipsilaterale D1 SPN'er under reach-to-grasp adfærd. (A) Skemaer for stimuleringsparadigmet. (B) Succesrate sammenlignet med ikke-stimuleringsforsøg. C) Ændring i tilbagelagt afstand i forhold til kontrolforholdene. (D), (G) Todimensionelle plots af stier lavet af poten med og uden optogenetisk stimulering. (E) , (H) Samlet afstand, som poten tilbagelagte under bevægelser. (F) , I) Sammenfatning af fordelingerne af de forskellige typer fejl. D1 kontralateral: Indledende fejl eller type I (kontrol = 18,2±11,6 %, stimulering = 79,9±8,2 % Fishers nøjagtige test, s<0,0001). J) Eksempel på PCA-analyse af forløbskurverne i kontrolbetingelser sammenlignet med kontralateral aktivering af D1SPN'er. Det skyggefulde område repræsenterer hoben af hver tilstand, og stjernen er hobcentroiden. K) Sammenfatning af overlapningen mellem klynger af de forskellige forsøgsbetingelser. (L) Ændringer i kropsvinkel. Dette tal er ændret i forhold til reference23. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brugen af optogenetisk manipulation af neuronale populationer i veldefinerede adfærdsmæssige paradigmer fremmer vores viden om de mekanismer, der ligger til grund for motorisk kontrol 7,23. Trådløse metoder er særligt velegnede til opgaver, der kræver forsøg på flere dyr eller fri bevægelighed34,35. Ikke desto mindre, da teknikker og enheder raffineres, bør det være go-to-muligheden for enhver adfærdsmæssig opgave kombineret med optogenetik34,36.

Den nuværende metode har mange fordele, fordi miniaturiserede lysdioder giver en pålidelig lyskilde med høj intensitet, og implantater kan bruges i undersøgelser, der kræver stimulering over flere dage. Ikke desto mindre kan indsættelse af en optisk fiber til opsinstimulering mekanisk beskadige hjernevæv, forårsage infektioner og lejlighedsvis betændelse på kanulaens placering37. Langvarig højfrekvent optogenetisk stimulering har vist sig at producere varme og kan forårsage fototoxitet37. Det er muligt at reducere fototoksicitet ved hjælp af rødforskudte effektor opsiner, der aktiveres med rødt eller endda nær-infrarødt lys, hvilket reducerer dannelsen af varme38.

Da stifterne til at forbinde modtageren forbliver uden for kraniet, kan mus undertiden forårsage forskydning eller løsrivelse af kanylen, hvis tandcement ikke påføres korrekt; dette fører ofte til skade på hjernevæv og reducerer antallet af emner, der skal tages i betragtning til yderligere analyse. Den seneste udvikling har introduceret fiberfri optogenetik, som bruger partikler, der kan udsende synligt lys gennem opkonvertering luminescens som reaktion på nær-infrarødt lys, der trænger dybt ind i hjernevævet36. Fiberløse enheder giver mulighed for at stimulere optogenetisk over længere tidsrammer i frit opførende dyr med umærkelige implantater35. Dette giver mulighed for uhæmmet bevægelse selv i vandlabyrbyrer, at have flere dyr anbragt sammen (for at undgå virkningen af social isolation) og at studere dyr i mere naturalistiske omgivelser35,36.

Selv med alle de fordele, som fiberfri optogenetik tilbyder, står den stadig over for biokompatibilitet og varmegenereringsudfordringer. Effektiviteten af fotonkonvertering begrænser det også. Endelig er der behov for yderligere forbedringer for at have en høj emissionseffektivitet34,36.

Kombinationen af dette paradigme med højhastighedsvideoografi muliggør kinematisk analyse under forskellige eksperimentelle forhold. Dette giver følsom detektion af selv subtile effekter over forskellige komponenter i adfærd og motorstyring. Efterhånden som flere analytiske værktøjer udvikler sig, er det muligt at have online kinematisk analyse og en dybdegående karakterisering af motorisk adfærd i forskellige sammenhænge. En grundig kvantificering af mus, der når bevægelseskinematik, er for nylig blevet offentliggjort af Becker et al.25.

Muligheden for selektivt at manipulere neuronale populationer i frit bevægelige dyr med minimalt invasive teknikker gør det muligt for en at dissekere bidraget fra specifikke neuronale typer i præcise adfærdsmæssige opgaver23. Reach-to-grasp-opgaven er et oversætteligt paradigme for motorisk adfærd13,19. Det er kendt, at bevarede hjernestrukturer deltager i de forskellige faser af erhvervelse, læring og udførelse af opgaven 7,12,23. At afsløre de neurale kredsløb, der ligger til grund for denne adfærd, vil øge forståelsen af motorisk kontrol. Flere undersøgelser fremhæver vigtigheden af bi-halvkugleformet kontrol over unimanuelle opgaver, især når der er behov for høj fingerfærdighed 20,21,22. Den kinematiske analyse kombineret med optogenetiske manipulationer gør det muligt at undersøge de forskellige mekanismer i denne komplekse adfærd. Det kan hjælpe med at analysere bidraget fra sensorisk-motorisk feedback under normale forhold og sygdomsmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen afsløringer.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af UNAM-PAPIIT-projektet IA203520. Vi takker IFC's dyreanlæg for deres hjælp med vedligeholdelse af musekolonier og beregningsenheden til IT-support, især til Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

Tags

Neurovidenskab udgave 177
<em>In vivo</em> Trådløs optogenetisk styring af dygtig motorisk adfærd
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O.,… More

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter