Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В городе Виво Беспроводной оптогенетический контроль квалифицированного двигательного поведения

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Настоящий протокол описывает, как использовать беспроводную оптогенетику в сочетании с высокоскоростной видеографией в одной задаче захвата гранул для характеристики нейронных цепей, участвующих в выполнении квалифицированного двигательного поведения у свободно движущихся мышей.

Abstract

Мелкая моторика необходима в повседневной жизни и может быть скомпрометирована при нескольких расстройствах нервной системы. Приобретение и выполнение этих задач требует сенсорно-моторной интеграции и включает в себя точное управление двусторонними мозговыми цепями. Реализация одноручных поведенческих парадигм в животных моделях улучшит понимание вклада структур мозга, таких как полосатое тело, в сложное двигательное поведение, поскольку это позволяет манипулировать и регистрировать нейронную активность конкретных ядер в контрольных условиях и заболеваниях во время выполнения задачи.

С момента своего создания оптогенетика была доминирующим инструментом для опроса мозга, позволяя селективную и целенаправленную активацию или ингибирование нейронных популяций. Сочетание оптогенетики с поведенческими анализами проливает свет на основные механизмы конкретных функций мозга. Беспроводные головные системы с миниатюрными светодиодами (СВЕТОДИОДАМИ) позволяют осуществлять дистанционное оптогенетическое управление у полностью свободно движущегося животного. Это позволяет избежать ограничений проводной системы, которая является менее ограничительной для поведения животных без ущерба для эффективности светового излучения. Текущий протокол сочетает в себе подход беспроводной оптогенетики с высокоскоростной видеографией в универсальной задаче ловкости для анализа вклада конкретных нейронных популяций в мелкомоторное поведение.

Introduction

Двигательное поведение присутствует во время большинства движений, выполняемых нами, и, как известно, оно затрагивается при нескольких расстройствах головного мозга 1,2,3,4,5,6. Выполнение задач, позволяющих изучать развитие, обучение и выполнение квалифицированных движений, имеет решающее значение для понимания нейробиологических основ двигательной функции, особенно в моделях черепно-мозговой травмы, нейродегенеративных расстройств и нарушений нервно-психического развития 2,7,8,9,10,11,12,13 . Дотягивание и извлечение предметов осуществляется регулярно в повседневных действиях, и это один из первых двигательных навыков, приобретенных во время раннего развития, а затем усовершенствованных в течение 5,6 лет. Он включает в себя сложное поведение, которое требует сенсорно-моторных процессов, таких как восприятие особенностей объекта, планирование движения, выбор действий, выполнение движения, координация тела и модуляция скорости 7,14,15,16. Таким образом, онирукие задания на высокую ловкость требуют участия многих структур мозга обоих полушарий 16,17,18,19,20,21,22. У мышей задача до захвата одной гранулы характеризуется для нескольких фаз, которые можно контролировать и анализировать отдельно 7,13,23. Данная особенность позволяет изучать вклад специфических нейрональных субпопуляций на разных этапах приобретения и выполнения поведения и предоставляет платформу для детального изучениядвигательных систем 13,23,24. Движение происходит за пару секунд; таким образом, высокоскоростная видеография должна использоваться для кинематического анализа на отдельных этапах траектории квалифицированного двигателя 7,25. Из видео можно извлечь несколько параметров, включая положение тела, траекторию, скорость и тип ошибок25. Кинематический анализ может быть использован для обнаружения тонких изменений во время беспроводных оптогенетических манипуляций 7,23.

Использование миниатюрных светодиодов (СВЕТОДИОДОВ) для доставки света через беспроводную систему, установленную на голове, позволяет иметь дистанционное оптогенетическое управление, пока животное выполняет задачу. Беспроводной оптогенетический контроллер принимает одноимпульсные или непрерывные триггерные команды от стимулятора и отправляет инфракрасные (ИК) сигналы на приемник, подключенный к миниатюрному светодиоду23,26. Текущий протокол сочетает в себе этот беспроводной оптогенетический подход с высокоскоростной видеографией задачи ловкости для препарирования роли конкретных нейронных популяций во время выполнения мелкомоторного поведения23. Поскольку это однорукая задача, она позволяет оценить участие структур в обоих полушариях. Традиционно мозг контролирует движение тела очень асимметричным образом; однако задачи с высокой ловкостью требуют тщательной координации и контроля со стороны многих структур мозга, включая ипсилатеральные ядра и дифференциальный вклад нейронных субпопуляций вядрах 10,20,21,22,23. Этот протокол показывает, что подкорковые структуры из обоих полушарий контролируют траекторию передней конечности23. Эта парадигма может быть подходящей для изучения других областей мозга и моделей заболеваний мозга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры, связанные с использованием животных, были проведены в соответствии с местными и национальными руководящими принципами и одобрены соответствующим Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (протокол Института клеточной физиологии IACUC VLH151-19). В текущем протоколе использовались трансгенные самцы мышей Drd1-Cre27, 35-40 дней после родов с фоном C57BL/6. Мышей содержали при следующих условиях: температура 22±1 °C; влажность 55%; световой график 12/12 ч с выключенным светом в 7 часов вечера и были отлучены от груди на 21-й день послеродового дня. Отъемные щенки размещались в однополых группах по 2-5 особей. Животные размещались в статическом жилище с микробарьерными верхушками. Постельное белье состояло из стерильной осиновой стружки. Гранулы грызунов и водой, очищенной обратной связью, были предоставлены ad libitum, за исключением отмеченных случаев.

1. Хирургические процедуры

  1. Подготовьте светодиодную канюлю на нужной длине в соответствии с дорсовентральными координатами интересующей структуры (в идеале на 0,5 мм длиннее для учета толщины черепа, для дорсолатерального полосатого тела 3,5 мм) (рисунок 1).
    1. Разрежьте стекловолокно на длину, превышающую окончательный желаемый размер, измельчите наконечник волокна до целевой длины грубой наждачной бумагой и, наконец, отполируйте наконечник волокна мелкой наждачной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодная канюля представляет собой стекловолокно диаметром 250 мкм, прикрепленное к инфракрасному приемнику (см. Таблицу материалов).
  2. Вытащите стеклянные пипетки (наружный диаметр 1,14 мм, внутренний диаметр 0,53 мм и длина 3,5 мм) для наноинжектора с горизонтальным съемником (см. Таблицу материалов) и храните их на потом. Запрограммируйте съемник в одну петлю, чтобы получить диаметр наконечника 15-20 мкм с длинным постепенным конусом наклона (4-5 мм).
  3. Подготовьте область операции, тщательно дезинфицируя стереотаксический аппарат, капюшон, микроинжектор (см. Таблицу материалов) и окружающие поверхности 70% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиный стереотаксический аппарат необходим для точного введения аденоассоциированного вируса (AAV) и размещения светодиодной канюли в интересующей области.
  4. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты для процедуры, включая чистый лабораторный халат или одноразовый хирургический халат, стерильные перчатки, маску для лица и одноразовый головной колпачок.
  5. Разместите необходимое оборудование рядом с областью операции, такое как стерильные хирургические инструменты, хлопковые наконечники, растворы, микропипетки, наконечники пипеток, капилляры, микронаполнение минеральным маслом и маркер.
  6. Наполните пипетку для микроинъекций минеральным маслом и поместите ее в микроинжектор. Убедитесь, что микроинжектор работает правильно, выбросив немного минерального масла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты, используемые во время операции, должны быть автоклавными и стерильными. Следует использовать асептическую технику.
  7. Анестезируйте животных газообразным изофлураном 4-5%, чтобы вызвать анестезию и 1,2% на протяжении всей операции с 0,5-1 л / мин чистого кислорода. Операция начинается только после того, как животное достигло точки глубокой анестезии, оцениваемой по отсутствию изъятия лапы после легкого ущемления.
    1. Постоянно следите за частотой дыхания и температурой животного. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки, установленной при 34 °C.
  8. Нанесите офтальмологическую мазь. Удалите волосы с кожи головы с помощью тримера и крема для удаления волос. Протрите кожу головы ватными тампонами, содержащими 8% повидона-йода (см. Таблицу материалов) и 70% этанола, чередуемых по три раза каждый.
  9. Поместите мышь в стереотаксический аппарат и закрепите голову, убедившись, что череп выровнен в медиолатеральной и передне-задней осях.
  10. Сделайте разрез 1 см скальпелем через кожу головы на уровне глаз вдоль сагиттальной оси. Втяните кожу, чтобы обнажить череп и очистите надкостницу ватными тампонами.
  11. Очистите поверхность черепа физиологическим раствором и стерильными ватными тампонами. Устраните любое кровотечение на поверхности с помощью стерильных абсорбирующих глазных копий (см. Таблицу материалов) или аналогичного стерильного абсорбирующего материала.
  12. Нанесите каплю 2,5% перекиси водорода ватным тампоном и дайте ей действовать в течение нескольких секунд, чтобы швы черепа были видны и имели лучшую ссылку. Через несколько секунд тщательно очистите его чистым ватным тампоном.
  13. С помощью стеклянной пипетки (конечный диаметр наконечника 15 мкм) найдите брегму и лямбду, чтобы убедиться, что череп выровнен в передне-задней оси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется иметь стереоскопический микроскоп или USB-микроскоп, чтобы увидеть кончик стеклянной пипетки. В случае необходимости отрегулируйте высоту держателя рта, чтобы выровнять череп.
  14. Переместите капилляр в сторону выбранных передне-задних (AP) и медиально-латеральных (ML) координат (дорсолатеральное полосатое тело AP 1,2 мм, ML 2,28 мм). Нарисуйте точку отсчета в коже головы над выбранными координатами стерильным маркером.
  15. В контрольной точке выполните краниотомию диаметром ~ 1 мм, оказывая мягкое давление на череп стерильным вращающимся инструментом или зубной бормашиной на низкой и средней скорости с помощью небольшого круглого зубного бормашины (см. Таблицу материалов).
  16. Загрузите в капилляр 300-400 нл cre-зависимого аденоассоциированного вируса (AAV), такого как AAV1-dflox-hChR-2-mCherry, для экспрессии ченнендродопсина или AAV для экспрессии только репортерного белка (например, mCherry) в качестве контроля в интересующей области (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что наконечник не забит, затем вводят стеклянную пипетку в мозг по заданным дорсо-вентральным (DV) координатам (дорсолатеральное полосатое тело DV -3,35 мм).
    1. Впрыск 200 нЛ с помощью автоматического инжектора со скоростью 23 нл/с. Подождите 10 минут после завершения инъекции, медленно вынимайте стеклянную пипетку, чтобы избежать разлива.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать иглу 30 г для инъекции с помощью соответствующего микроинжектора.
  17. Очистите и высушите все остатки ватными тампонами.
  18. Прикрепите стерильную стеклянную светодиодную канюлю к стереотаксическому кронштейну и откалибруйте координаты, используя брегму в качестве эталона. Вставьте канюлю очень медленно (300 мкм/мин), чтобы избежать повреждения тканей, и поместите ее на 100 мкм выше места инъекции.
  19. Как только светодиодная канюля будет на месте, добавьте каплю (100 мкл) тканевого клея на краю трепанации черепа.
  20. Приготовьте зубную цементную смесь (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя по фиксации волокна на черепе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, используйте охлажденную фарфоровую посуду, чтобы иметь больше рабочего времени перед цементными наборами. Добавить в фарфоровую посуду 2 мерные ложки прозрачного порошка смолы, добавить 4 капли быстрого основания и 1 каплю катализатора, затем хорошо перемешать. Соотношение порошок/жидкость можно регулировать, если требуется более тонкая или более толстая вязкость.
  21. Используя стерильную щетку, нанесите зубную цементную смесь вокруг соединителя канюли понемногу, наращивая слои до тех пор, пока череп не будет покрыт, а соединитель надежно прикреплен к черепу, оставив штифты полностью свободными. Избегайте попадания зубного цемента на кожу мыши.
  22. Дайте полностью высохнуть.
  23. Закройте кожу вокруг имплантата с помощью тканевого клея (см. Таблицу материалов).
  24. Поместите мышь в восстановительную клетку над грелкой при 33°С. Следите за наличием одного или нескольких из следующих признаков боли/дискомфорта: 1) Сгорбленность, отсутствие или снижение двигательной активности, 2) Неспособность ухаживать отражается в неухоженной грязной шерсти, 3) Чрезмерное облизывание или расчесывание, покраснение в месте разреза, 4) агрессивное поведение, 5) анорексия или обезвоживание и 6) отсутствие гнездообразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышь индивидуально в клетке во время всех процедур, чтобы избежать отсоединения имплантата. В случае отслоения канюли проводят эвтаназию путем инъекции 150 мг/кг пентобарбитала натрия с последующим обезглавливанием после достижения глубокой анестезии.
  25. Вводят подкожно (SC) мелоксикам 1 мг/кг один раз в день в течение трех дней после операции для обеспечения анальгезии.
  26. Подождите не менее 7 дней для полного выздоровления и 14 дней для экспрессии опсина перед дальнейшими процедурами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте послеоперационное наблюдение каждые 12 часов в течение трех дней, затем проверяйте животных каждый день до дня эвтаназии в конце эксперимента.

2. Тренировка «Охват до понимания»

  1. На 7 день после операции начните протокол лишения пищи28. Взвешивайте мышей в течение трех дней подряд, чтобы определить их среднюю массу тела ad libitum. Затем запланируйте ограничения в еде таким образом, чтобы животные получали достаточно питательных веществ для поддержания примерно 90% и не менее 85% массы тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это достигается путем обеспечения 2,5-3 г пищи ежедневно. Ежедневно контролируйте вес животных и оценивайте общее самочувствие, наблюдая за поведением и внешним видом животных, например, за внешним видом шерсти и глаз. Используйте систему оценки состояния тела из ссылки29.
  2. Во время предтренинга, обучения и тестирования обеспечьте каждую мышь 20 гранулами (20 мг беспыльных гранул со вкусом шоколада) в день (см. Таблицу материалов) (съеденных во время выполнения задания или после) помимо стандартных пищевых гранул.
  3. За три дня до привыкания разбросайте 0,4 г / животное / день 20 мг беспыльных гранул со вкусом шоколада в своих домашних клетках, чтобы мыши познакомились с гранулами, которые служат наградой во время задачи «до захвата».
  4. Приучите мышей, поместив их за 10 минут в испытательную камеру за день до предварительной тренировки с гранулами, разбросанными по полу камеры (рисунок 1А).
  5. Разрешайте принимать пищу ежедневно после тренировки и тестирования. Придерживайтесь аналогичного графика каждый день.
  6. В первый день предварительной тренировки поместите мышей в камеру с досягаемостью и наблюдайте спереди. Поместите гранулы перед камерой близко к отверстию, чтобы они начали потреблять гранулы. На этом этапе мышам разрешается захватывать гранулы в любом виде.
  7. На второй день предварительной тренировки поместите гранулы все дальше и дальше от отверстия, пока они не доставят их в углубление (1 см от отверстия), чтобы мыши могли формировать свое движение до захвата (рисунок 1C).
  8. Обучите мышей бежать в заднюю часть клетки и возвращаться в отверстие клетки, чтобы получить следующую пищевую гранулу в качестве стратегии индивидуализации испытаний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этого можно достичь, подождав, пока мышь окажется в задней части клетки, прежде чем помещать гранулу в углубление для каждого испытания.
  9. Поместите гранулы, чтобы они были схвачены либо правой, либо левой лапой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши начинают использовать преимущественно одну лапу для захвата, которая будет использоваться в последующие дни обучения и тестирования.
  10. Тренируйте животных в течение 6 дней в ежедневных сеансах продолжительностью 20 испытаний или до 10 минут. Со 2-го дня тренировки ставят макет приемника (размеры 12 х 18 х 7 мм, 1 г, см. Таблицу материалов), чтобы мыши привыкли к весу при выполнении задания (рисунок 1В). Каждый день начисляйте количество попаданий и пропущенных испытаний.
  11. Записывайте поведение с помощью обычной камеры и захватывайте 30-60 кадров/с передней части камеры. Кроме того, можно поместить зеркало под тренировочную камеру под углом 45° для контроля осанки животных (рисунок 1D, E).
  12. Для пост-специального кинематического анализа (рисунок 2) установите высокоскоростную камеру (см. Таблицу материалов) под углом 45° для записи со стороны клетки. Если требуется 3D-анализ, поместите вторую высокоскоростную камеру для записи под углом 35° от передней части камеры; обе камеры должны быть размещены в правой или левой части клетки в зависимости от односторонности животных и должны захватывать с одинаковой частотой кадров и быть синхронизированы7 (рисунок 3D, E).
  13. Установите скоростные камеры на 100 кадров/с с разрешением 376 x 252 пикселей или более, если это возможно. Поместите белые стенки из пенополистирола по бокам и задней части камеры, чтобы уменьшить фон и увеличить контрастность (рисунок 1E).
  14. В день тестирования замените макет блока инфракрасным приемником для беспроводной оптогенетической стимуляции (рисунок 1B, C).
  15. Когда мыши начнут достигать, поверните светодиодную канюлю вручную с помощью пульта дистанционного управления, чтобы иметь непрерывную стимуляцию на время выполнения поведения и не дольше 2 с. Программирование парадигмы автоматической стимуляции является предпочтительным. Стимулирующее устройство запускает светодиод 470 нм (синий свет) с интенсивностью на кончике 1,0 мВт/мм2.
  16. Соберите видео для дальнейшего изучения, включая подсчет баллов и кинематический анализ.

3. Пост-hoc гистологическое подтверждение

  1. По завершении эксперимента подтвердите вирусную экспрессию и размещение светодиодной канюли. Обезболить животное коктейлем из кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг. Как только у мыши появятся признаки глубокой анестезии (шаг 1,7), перфьюируйте ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), за которым следует 4% PFA.
  2. Аккуратно удалите имплантированную канюлю, крепко захватив соединитель щипцами и осторожно подтянув вверх.
  3. Экстрагировать и постфиксировать мозг в течение 24 ч в 4% PFA23.
  4. Выполняйте 3-10 мин стирки с PBS.
  5. Разрезайте мозг на участки по 50 мкм с помощью микротома (см. Таблицу материалов).
  6. Монтируйте секции в слайды с жестко установленным монтажным носителем с DAPI для окрашивания ядер и покрытия слайдов.
  7. После высыхания понаблюдайте за срезами под конфокальным микроскопом и проверьте местоположение имплантированной канюли и экспрессию Ch2R, слитого с любым флуоресцентным белком.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Задача «достичь понимания» — это парадигма, широко используемая для изучения формирования, обучения, производительности и кинематики движения тонких навыков при различных экспериментальных манипуляциях. Мыши учатся выполнять задание за пару дней и достигают более 55% точности, достигая плато после 5 дней обучения (рисунок 2A,B). Подобно тому, что сообщалось ранее, процент животных не выполняет задачу должным образом (29,62%), и они должны быть исключены из дальнейшего анализа30. К ним относится подмножество неучавшихся мышей (6/54 мышей, 11,1%), которые с начала обучения пропускают цель, прицеливаясь слишком далеко от гранулы, или выполняют хватательное движение, прежде чем они окажутся в правильном положении над гранулой. В течение первых тренировочных дней другая группа выполнила задание с высокой точностью, но начала плохо работать, прицеливаясь слишком далеко от гранулы к 3-4 дню (10/54 мыши, 18,51%). В этой группе некоторые мыши начинают тренироваться, используя предпочтительную лапу, но через несколько дней меняют свои предпочтения; это обсуждалось ранее Chen et al., 201430.

Движение «охват к захвату» очень стереотипно от испытания к испытанию и у животных (рисунок 2). Использование высокоскоростной видеографии позволяет отслеживать траекторию движений, что позволяет анализировать кинематику на разных фазах в контрольном состоянии и во время оптогенетической стимуляции (рис. 1Е и рисунок 2С). Это приближение приводит к количественной оценке таких параметров, как пройденное расстояние, скорость, ускорение, конечная точка и траектория (рисунок 2 C-E). Можно проанализировать как многоразовые испытания, где мышь достигает несколько раз, прежде чем извлечь гранулу, так и события одного испытания, когда мышь извлекает гранулу одним достигающим движением. Испытание завершается, когда животные отталкивают гранулу или возобновляют испытание, переходя в заднюю часть клетки. Количественное сравнение траекторий в различных экспериментальных условиях достигается с помощью анализа главных компонент (PCA) с последующим кластеризацией k-средних (рисунок 3J-K)23,25.

Во время большинства тренировок мыши иногда не могут схватить гранулу (пропущенные испытания). Некоторые манипуляции изменяют количество пропущенных испытаний и, следовательно, точность задания. Затем важно проанализировать различия между пораженными и пропущенными испытаниями. В наших руках пропущенные испытания являются результатом изменений в трех различных фазах движения: (1) лапа изменяет свою траекторию до того, как она пересекает отверстие камеры (начальная ошибка), (2) лапа изменяет свою траекторию после того, как лапа пересекает отверстие (окончательная ошибка), и (3) неспособность собрать гранулу (ошибка захвата) (рисунок 2 I,J)13 . Общей характеристикой пропущенных испытаний является то, что мыши начинают хватательное движение дальше от гранулы (конечная точка) по сравнению с испытаниями попадания (рисунок 2G). Кроме того, промахи, связанные с осанкой мыши, измеряются как значительные различия в угле тела между ударом и пропущенными испытаниями (рисунок 2H).

В зависимости от структуры или популяции нейронов, на которую нацелена оптогенетика, можно ожидать дифференциальных эффектов по отношению к поведению 7,19,23,31,32,33. Текущий протокол описывает влияние активации колючих проекционных нейронов (SPN) в полосатом теле в контралатеральном или ипсилатеральном полушариях на предпочтительную лапу, используемую мышью во время достигающего движения (рисунок 3). Контралатеральная активация D1 дофаминовых экспрессирующих СПН, которые дают начало прямому пути базальных ганглиев, снизила успех захвата до 64,9±8,8% по сравнению с контрольными условиями (рисунок 3B). Кинематический анализ показывает, что во время оптогенетической стимуляции траектория лапы описывала колебательную картину, показанную увеличением пройденного расстояния до 218,4±19,2% контроля, что привело к неспособности нацеливаться на гранулу и увеличению начальной погрешности типа I (рисунок 3F). Анализ PCA показывает, что траектории всех испытаний во время контралатеральной активации D1 SPNs разделены в кластере, почти не перекрывающемся с контрольным кластером, что указывает на низкое сходство (рисунок 3J-K).

С другой стороны, активация dSPN в ипсилатеральной стороне приводит к увеличению дисперсии траектории, показанной анализом PCA (рисунок 3K), не влияя на достижение успеха (120,7±23,6%, n = 4), общее пройденное расстояние (136,3±35,5%), или максимальную скорость во время фазы достижения (117,3±10,3%) (рисунок 3C), что указывает на то, что активация ipsilateral D1 SPNs в некоторой степени изменила траекторию достижения без изменения поведенческого результата (рисунок 3G-I). ). Кинематический анализ указывает на тонкие изменения в управлении движением с помощью ипсилатеральных манипуляций. Наконец, анализ осанки тела показывает сдвиг угла наклона тела во время контралатеральной активации D1SPNs (рисунок 3L). Подчеркивается, что даже эта простая задача имеет много компонентов, которые позволяют правильно выполнять движение для достижения цели.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная установка. (А) Схемы поведенческой камеры. Камера, изготовленная из акрилового листа, имеющая следующие размеры в см: 18,5 (в) x 8,5 (ш) х 20 (г) с передним окном 1 (ш) х 5 (в) и небольшой полкой 8,5 (ш) х 4 (г). (B) Фотография светодиодной канюли (слева) и беспроводного приемника (справа). (C) Вид сбоку мыши с имплантированной светодиодной канюлей, соединенной с приемником во время выполнения задачи захвата (белый наконечник стрелы показывает приемник, звездочка показывает зубной цемент, удерживающий канюлю, а пустой наконечник стрелы показывает гранулу). (D) Эскиз экспериментальной установки. Две высокоскоростные камеры фиксируют радиус действия в двух измерениях, в то время как третья собирала панорамный вид задачи, включая местоположение мыши из зеркала под камерой. Животные были свободны в выборе предпочтительной лапы, а стимулирующие стороны всегда ссылались на сторону предпочтительной лапы. E) точное положение камер и репрезентативное изображение каждой камеры во время судебного разбирательства. Эта цифра была адаптирована из ссылки23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Кинематический анализ достигающего поведения. (A) Хронология эксперимента с дня-0 (d0) по день-25 (d25). (B) Производительность во время выполнения задачи «охват до захвата» с течением времени, измеряемая как точность извлечения гранул (общее число успешных захватов/общее число испытаний x 100). (C) Пример отслеживания траектории по высокоскоростному видео. (D) Индивидуальные траектории лапы во время удара и пропущенных испытаний. (E) Общее расстояние, пройденное лапой во время удара и пропущенных испытаний. (F) Ускорение лапы по траектории при попадании и пропущенных испытаниях, построенных как расстояние против. скорость. (G) Сводка расстояний конечных точек в попаданиях = 3,16 мм, промахах 6,08 мм (тест Манна-Уитни-Уилкоксонапропущен против попадания U = 4184, p<0,0001, n = 28 мышей). (H) Различия в угле тела в двух видах испытаний, промахи = 8,4±5,3°, попадания 6,7±4° (тест Манна-Уитни-Уилкоксона U = 6437, P = 0,0243, n = 28 мышей). I) Схемы трех типов ошибок. (J) Пропорции трех видов ошибок, допущенных мышами в контрольных условиях. Эта цифра была адаптирована из ссылки23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оптогенетическая активация контралатеральных и ипсилатеральных D1 SPN во время поведения reach-to-grasp. (A) Схемы парадигмы стимуляции. (B) Показатель успеха по сравнению с испытаниями без стимуляции. (C) Изменение пройденного расстояния по сравнению с контрольными условиями. (D), (G) Двумерные графики траекторий, сделанных лапой с оптогенетической стимуляцией и без нее. (Е) , (H) Общее расстояние, пройденное лапой во время достигающих движений. (Ф) , (I) Краткое изложение распределений различных видов ошибок. D1 контралатеральный: начальная ошибка или тип I (контроль = 18,2±11,6 %, стимуляция = 79,9±8,2 % точный тест Фишера, p<0,0001). (J) Пример анализа PCA траекторий в контрольных условиях в сравнении с контралатеральной активацией D1SPN. Затененная область представляет скопление каждого условия, а звезда является центроидом скопления. K) Резюме перекрытия между кластерами различных экспериментальных условий. (L) Изменения угла наклона кузова. Этот рисунок был изменен по сравнению со ссылкой23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование оптогенетических манипуляций с нейронными популяциями в четко определенных поведенческих парадигмах расширяет наши знания о механизмах, лежащих в основе двигательного контроля 7,23. Беспроводные методы особенно подходят для задач, требующих испытаний на нескольких животных или свободного передвижения34,35. Тем не менее, по мере совершенствования методов и устройств, это должно быть подходящим вариантом для любой поведенческой задачи в сочетании с оптогенетикой34,36.

Современный метод имеет много преимуществ, поскольку миниатюрные светодиоды обеспечивают надежный источник света с высокой интенсивностью, а имплантаты можно использовать в исследованиях, требующих стимуляции в течение нескольких дней. Тем не менее, введение оптического волокна для стимуляции опсина может механически повредить ткани мозга, вызвать инфекции и иногда воспаление в месте расположения канюли37. Было продемонстрировано, что длительная высокочастотная оптогенетическая стимуляция производит тепло и может вызвать фототоксичность37. Можно уменьшить фототоксичность, используя эффекторные опсины с красным смещением, которые активируются красным или даже ближним инфракрасным светом, что уменьшает выделение тепла38.

Кроме того, поскольку штифты для соединения приемника остаются вне черепа, иногда мыши могут вызвать смещение или отслоение канюли, если зубной цемент применяется неправильно; это часто приводит к повреждению мозговой ткани и уменьшает количество субъектов, которые должны быть приняты во внимание для дальнейшего анализа. Последние разработки ввели безволокнистую оптогенетику, которая использует частицы, которые могут излучать видимый свет через люминесценцию с восходящим преобразованием в ответ на ближний инфракрасный свет, проникающий глубоко вткань мозга 36. Безволокнистые устройства дают возможность оптогенетически стимулировать в течение более длительных временных рамок у свободно ведущих себя животных с незаметными имплантатами35. Это позволяет осуществлять неограниченное движение даже в водных лабиринтах, размещать несколько животных вместе (чтобы избежать влияния социальной изоляции) и изучать животных в более натуралистических условиях35,36.

Несмотря на все преимущества, которые предлагает безволокнистая оптогенетика, она по-прежнему сталкивается с проблемами биосовместимости и тепловыделения. Эффективность преобразования фотонов также ограничивает его. Наконец, требуется дальнейшее совершенствование для обеспечения высокой эффективности выбросов34,36.

Сочетание этой парадигмы с высокоскоростной видеографией позволяет проводить кинематический анализ в различных экспериментальных условиях. Это обеспечивает чувствительное обнаружение даже тонких эффектов над различными компонентами поведения и двигательного контроля. По мере развития все большего количества аналитических инструментов можно проводить онлайн-кинематический анализ и углубленную характеристику двигательного поведения в различных контекстах. Тщательная количественная оценка кинематики движения мыши была недавно опубликована Becker et al.25.

Возможность избирательного манипулирования популяциями нейронов у свободно движущихся животных с помощью минимально инвазивных методов позволяет препарировать вклад конкретных типов нейронов в точные поведенческие задачи23. Задача охвата является переводимой парадигмой для моторного поведения 13,19. Известно, что сохраненные структуры мозга участвуют в различных фазах приобретения, обучения и выполнения задания 7,12,23. Выявление нейронных цепей, лежащих в основе этого поведения, повысит понимание моторного контроля. Несколько исследований подчеркивают важность контроля в двух полушариях над одноруковыми задачами, особенно когда требуется высокая ловкость 20,21,22. Кинематический анализ в сочетании с оптогенетическими манипуляциями позволяет исследовать различные механизмы этого сложного поведения. Это может помочь проанализировать вклад сенсорно-моторной обратной связи в нормальных условиях и моделях заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии раскрытия информации.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана проектом УНАМ-ПАПИИТ IA203520. Мы благодарим центр для животных IFC за помощь в обслуживании колоний мышей и вычислительный блок для ИТ-поддержки, особенно Франсиско Перес-Эухенио.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

Tags

Неврология выпуск 177
<em>В городе Виво</em> Беспроводной оптогенетический контроль квалифицированного двигательного поведения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O.,… More

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter