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Neuroscience

Vivo में वायरलेस Optogenetic कुशल मोटर व्यवहार के नियंत्रण

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि स्वतंत्र रूप से चलने वाले चूहों में कुशल मोटर व्यवहार के प्रदर्शन में शामिल तंत्रिका सर्किट को चिह्नित करने के लिए एक ही गोली पहुंच-से-समझ कार्य में उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ संयुक्त वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग कैसे किया जाए।

Abstract

ठीक मोटर कौशल रोजमर्रा की जिंदगी में आवश्यक हैं और कई तंत्रिका तंत्र विकारों में समझौता किया जा सकता है। इन कार्यों के अधिग्रहण और प्रदर्शन के लिए संवेदी-मोटर एकीकरण की आवश्यकता होती है और इसमें द्विपक्षीय मस्तिष्क सर्किट का सटीक नियंत्रण शामिल होता है। पशु मॉडल में unimanual व्यवहार प्रतिमानों को लागू करने से मस्तिष्क संरचनाओं के योगदान की समझ में सुधार होगा, जैसे कि स्ट्रिएटम, जटिल मोटर व्यवहार के लिए क्योंकि यह कार्य के प्रदर्शन के दौरान नियंत्रण स्थितियों और बीमारी में विशिष्ट नाभिक की तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर और रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।

इसके निर्माण के बाद से, ऑप्टोजेनेटिक्स न्यूरोनल आबादी के चयनात्मक और लक्षित सक्रियण या निषेध को सक्षम करके मस्तिष्क से पूछताछ करने के लिए एक प्रमुख उपकरण रहा है। व्यवहार assays के साथ optogenetics का संयोजन विशिष्ट मस्तिष्क कार्यों के अंतर्निहित तंत्र पर प्रकाश डालता है। लघुकृत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ वायरलेस हेड-माउंटेड सिस्टम पूरी तरह से मुक्त-चलती जानवर में दूरस्थ ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण की अनुमति देते हैं। यह प्रकाश उत्सर्जन दक्षता से समझौता किए बिना जानवरों के व्यवहार के लिए कम प्रतिबंधात्मक होने के कारण वायर्ड सिस्टम की सीमाओं से बचता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक यूनिमैनुअल निपुणता कार्य में उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ एक वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स दृष्टिकोण को जोड़ता है ताकि ठीक मोटर व्यवहार के लिए विशिष्ट न्यूरोनल आबादी के योगदान को विच्छेदित किया जा सके।

Introduction

मोटर कुशल व्यवहार हमारे द्वारा किए गए अधिकांश आंदोलनों के दौरान मौजूद होता है, और यह कई मस्तिष्क विकारों 1,2,3,4,5,6 में प्रभावित होने के लिए जाना जाता है। कुशल आंदोलनों के विकास, सीखने और प्रदर्शन का अध्ययन करने की अनुमति देने वाले कार्यों को लागू करना मोटर फ़ंक्शन के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से मस्तिष्क की चोट, न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के मॉडल में 2,7,8,9,10,11,12,13 . वस्तुओं तक पहुंचना और पुनर्प्राप्त करना रोजमर्रा की जिंदगी के कार्यों में नियमित रूप से किया जाता है, और यह शुरुआती विकास के दौरान हासिल किए गए पहले मोटर कौशल में से एक है और फिर 5,6 वर्षों के माध्यम से परिष्कृत किया जाता है। इसमें एक जटिल व्यवहार शामिल है जिसमें संवेदी-मोटर प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है जैसे कि वस्तु की विशेषताओं की धारणा, आंदोलन योजना, कार्रवाई चयन, आंदोलन निष्पादन, शरीर समन्वय, और गति मॉडुलन 7,14,15,16। इस प्रकार, unimanual उच्च निपुणता कार्यों के लिए दोनों गोलार्धों की कई मस्तिष्क संरचनाओं की भागीदारी की आवश्यकता होती है 16,17,18,19,20,21,22। चूहों में, एकल गोली पहुंच-से-समझ कार्य को कई चरणों के लिए विशेषता है जिसेअलग-अलग 7,13,23 नियंत्रित और विश्लेषण किया जा सकता है। यह सुविधा अधिग्रहण और व्यवहार प्रदर्शन के विभिन्न चरणों में विशिष्ट न्यूरोनल उप-आबादी के योगदान का अध्ययन करने की अनुमति देती है और मोटर सिस्टम13,23,24 के विस्तृत अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करती है। आंदोलन कुछ सेकंड में होता है; इस प्रकार, उच्च गति की वीडियोग्राफी का उपयोग कुशल मोटर प्रक्षेपवक्र 7,25 के विभिन्न चरणों में कीनेमेटिक विश्लेषण के लिए किया जाना चाहिए। वीडियो से कई पैरामीटर निकाले जा सकते हैं, जिसमें शरीर की मुद्रा, प्रक्षेपवक्र, वेग और त्रुटियों के प्रकार25 शामिल हैं। कीनेमेटिक विश्लेषण का उपयोग वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर 7,23 के दौरान सूक्ष्मपरिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

एक वायरलेस हेड-माउंटेड सिस्टम के माध्यम से प्रकाश वितरित करने के लिए लघुकृत प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एल ई डी) का उपयोग करना दूरस्थ ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण करना संभव बनाता है जबकि जानवर कार्य करता है। वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रक एक उत्तेजक से एकल-नाड़ी या निरंतर ट्रिगर कमांड स्वीकार करता है और लघुकृत एलईडी23,26 से जुड़े रिसीवर को अवरक्त (आईआर) संकेत भेजता है। वर्तमान प्रोटोकॉल इस वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स दृष्टिकोण को एक निपुणता कार्य की उच्च गति की वीडियोग्राफी के साथ जोड़ता है ताकि ठीक मोटर व्यवहार के प्रदर्शन के दौरान विशिष्ट न्यूरोनल आबादी की भूमिका को विच्छेदित कियाजा सके। चूंकि यह एक यूनिमैनुअल कार्य है, इसलिए यह दोनों गोलार्धों में संरचनाओं की भागीदारी का आकलन करने की अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, मस्तिष्क अत्यधिक असममित तरीके से शरीर के आंदोलन को नियंत्रित करता है; हालांकि, उच्च निपुणता कार्यों के लिए कई मस्तिष्क संरचनाओं से सावधानीपूर्वक समन्वय और नियंत्रण की आवश्यकता होती है, जिसमें इप्सिलेटरल नाभिक और नाभिक 10,20,21,22,23 के भीतर न्यूरोनल उप-आबादी का विभेदक योगदान शामिल है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि दोनों गोलार्धों से सबकॉर्टिकल संरचनाएं फोरलिम्ब23 के प्रक्षेपवक्र को नियंत्रित करती हैं। यह प्रतिमान अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों और मस्तिष्क रोग के मॉडल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

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Protocol

पशु उपयोग से जुड़ी प्रक्रियाओं को स्थानीय और राष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आयोजित किया गया था और संबंधित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (सेलुलर फिजियोलॉजी आईएसीयूसी प्रोटोकॉल वीएलएच 151-19 संस्थान) द्वारा अनुमोदित किया गया था। Drd1-Cre ट्रांसजेनिक पुरुष चूहों27, C57BL / 6 पृष्ठभूमि के साथ 35-40 दिनों के प्रसवोत्तर वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया था। चूहों को निम्नलिखित स्थितियों के तहत रखा गया था: तापमान 22±1 डिग्री सेल्सियस; आर्द्रता 55%; प्रकाश अनुसूची 12/12 घंटे 7 बजे रोशनी बंद के साथ और प्रसवोत्तर दिन 21 में वीन किया गया था। वीन पिल्लों को 2-5 के समान-लिंग समूहों में रखा गया था। जानवरों को माइक्रो-बैरियर टॉप के साथ स्थैतिक आवास में रखा गया था। बिस्तर बाँझ एस्पेन शेविंग के शामिल थे. कृंतक छर्रों और आरओ-शुद्ध पानी को विज्ञापन लिबिटम प्रदान किया गया था, सिवाय इसके कि जब नोट किया गया हो।

1. सर्जिकल प्रक्रियाओं

  1. ब्याज की संरचना के डोर्सोवेंट्रल निर्देशांक के अनुसार वांछित लंबाई पर एक एलईडी कैनुला तैयार करें (आदर्श रूप से खोपड़ी की मोटाई के लिए खाते में 0.5 मिमी लंबा, डोरसोलेटरल स्ट्रिएटम 3.5 मिमी के लिए) (चित्रा 1)।
    1. ग्लास फाइबर को अंतिम वांछित आकार से अधिक लंबाई तक काटें, फाइबर टिप को किसी न किसी सैंडपेपर के साथ लक्ष्य की लंबाई में पीसें, और अंत में, ठीक सैंडपेपर के साथ फाइबर टिप को पॉलिश करें।
      नोट: एलईडी कैनुला 250 μm व्यास का एक ग्लास ऑप्टिकल फाइबर है जो एक अवरक्त रिसीवर से जुड़ा हुआ है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक क्षैतिज खींचने के साथ नैनो-इंजेक्टर के लिए ग्लास पिपेट्स (1.14 मिमी बाहरी व्यास, 0.53 मिमी आंतरिक व्यास, और लंबाई में 3.5) खींचें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें बाद में स्टोर करें। एक लंबे क्रमिक ढलान टेपर (4-5 मिमी) के साथ एक 15-20 μm टिप व्यास प्राप्त करने के लिए एक लूप में खींचने वाले को प्रोग्राम करें।
  3. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण, हुड, माइक्रो-इंजेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) और 70% इथेनॉल के साथ आसपास की सतहों को पूरी तरह से कीटाणुरहित करके सर्जरी क्षेत्र तैयार करें।
    नोट: एक माउस स्टीरियोटैक्सिक उपकरण एडेनो एसोसिएटेड वायरस (एएवी) को ठीक से इंजेक्ट करने और ब्याज के क्षेत्र में एलईडी कैनुला रखने के लिए आवश्यक है।
  4. प्रक्रिया के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें, जिसमें एक साफ लैब कोट या डिस्पोजेबल सर्जिकल गाउन, बाँझ दस्ताने, फेस मास्क और डिस्पोजेबल हेड कैप शामिल हैं।
  5. सर्जरी क्षेत्र के करीब आवश्यक उपकरण रखें, जैसे कि बाँझ सर्जिकल उपकरण, कपास युक्तियाँ, समाधान, माइक्रोपिपेट, पिपेट युक्तियाँ, केशिकाएं, खनिज तेल के साथ माइक्रो-फिल, और मार्कर।
  6. खनिज तेल के साथ microinjections के लिए एक पिपेट भरें और इसे माइक्रो इंजेक्टर में रखें। सुनिश्चित करें कि माइक्रो-इंजेक्टर कुछ खनिज तेल को बाहर निकालकर सही ढंग से काम कर रहा है।
    नोट: सर्जरी के दौरान उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को ऑटोक्लेव्ड और बाँझ होना चाहिए। एसेप्टिक तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए।
  7. गैसीय आइसोफ्लुरेन के साथ जानवरों को एनेस्थेटिक 4-5% एनेस्थेटिक करें और 0.5-1 एल / मिनट शुद्ध ऑक्सीजन के साथ सर्जरी के दौरान 1.2% को प्रेरित करने के लिए। सर्जरी केवल तब शुरू होती है जब जानवर गहरे संज्ञाहरण के एक बिंदु तक पहुंच जाता है, जिसका आकलन थोड़ी चुटकी के बाद पंजा वापसी की अनुपस्थिति से किया जाता है।
    1. जानवर की सांस लेने की दर और तापमान की लगातार निगरानी करें। 34 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हीटिंग पैड द्वारा शरीर के तापमान को बनाए रखें।
  8. नेत्र मरहम लगाएं। एक ट्रिमर और बालों को हटाने क्रीम के साथ खोपड़ी से बालों को हटा दें। 8% पोविडोन-आयोडीन वाले कपास के झाड़ू के साथ खोपड़ी को पोंछें ( सामग्री की तालिका देखें) और 70% इथेनॉल प्रत्येक को तीन बार वैकल्पिक किया गया।
  9. माउस को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में रखें और सिर को सुरक्षित करें, यह सुनिश्चित करें कि खोपड़ी को मेडिओलेटरल और पूर्वकाल-पीछे के अक्षों में समतल किया गया है।
  10. sagittal अक्ष के साथ आंखों के स्तर पर खोपड़ी के माध्यम से एक scalpel के साथ एक 1 सेमी चीरा बनाओ। खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस लें और कपास के झाड़ू के साथ पेरिओस्टेम को साफ करें।
  11. खारा समाधान और बाँझ कपास swabs के साथ क्रैनियम सतह को साफ करें। बाँझ अवशोषक आंखों के भाले का उपयोग करके सतह पर किसी भी रक्तस्राव को हल करें ( सामग्री की तालिका देखें) या इसी तरह की बाँझ अवशोषक सामग्री।
  12. एक कपास झाड़ू के साथ 2.5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एक बूंद लागू करें और इसे खोपड़ी टांके को दृश्यमान बनाने और बेहतर संदर्भ देने के लिए कुछ सेकंड के लिए कार्य करने दें। कुछ सेकंड के बाद, एक साफ कपास झाड़ू के साथ अच्छी तरह से साफ करें।
  13. ग्लास पिपेट (15 μm अंतिम टिप व्यास) के साथ, यह जांचने के लिए ब्रेग्मा और लैम्ब्डा का पता लगाएं कि खोपड़ी पूर्वकाल-पीछे की धुरी में समतल है।
    नोट: ग्लास पिपेट की नोक को देखने के लिए एक स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप या यूएसबी माइक्रोस्कोप रखने की सिफारिश की जाती है। यदि इसकी आवश्यकता होती है, तो खोपड़ी को समतल करने के लिए मुंह धारक की ऊंचाई को समायोजित करें।
  14. केशिका को चयनित पूर्वकाल-पश्चवर्ती (एपी) और औसत दर्जे का-पार्श्व (एमएल) निर्देशांक (डोरसोलेटरल स्ट्रिएटम एपी 1.2 मिमी, एमएल 2.28 मिमी) की ओर ले जाएं। एक बाँझ मार्कर के साथ चयनित निर्देशांक के ऊपर खोपड़ी में एक संदर्भ बिंदु पेंट करें।
  15. संदर्भ बिंदु में, एक ~ 1 मिमी व्यास क्रैनियोटॉमी एक बाँझ रोटरी उपकरण के साथ खोपड़ी के लिए कोमल दबाव लागू करते हुए प्रदर्शन करें या एक छोटे से गोल दंत ड्रिल बिट के साथ कम से मध्यम गति पर दंत ड्रिल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  16. Cre-dependent adeno-associated virus (AAV) जैसे AAV1-dflox-hChR-2-mCherry को व्यक्त करने के लिए 300-400 nL के साथ केशिका को लोड करें Channelrhodopsin या AAV को व्यक्त करने के लिए केवल रिपोर्टर प्रोटीन (जैसे, mCherry) को ब्याज के क्षेत्र में नियंत्रण के रूप में व्यक्त करने के लिए ( सामग्री की तालिका देखें)। जांचें कि टिप भरा हुआ नहीं है, फिर वांछित डोरसो-वेंट्रल (डीवी) निर्देशांक (डोरसोलेटरल स्ट्रिएटम डीवी -3.35 मिमी) पर मस्तिष्क में ग्लास पिपेट का परिचय दें।
    1. 23 nL/s की दर से एक स्वचालित इंजेक्टर का उपयोग करके 200 nL इंजेक्ट करें। इंजेक्शन खत्म करने के बाद 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, स्पिलेज से बचने के लिए ग्लास पिपेट को धीरे-धीरे वापस ले लें।
      नोट: उपयुक्त माइक्रो-इंजेक्टर के साथ इंजेक्ट करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करना संभव है।
  17. कपास swabs के साथ किसी भी अवशेष को साफ और सूखा.
  18. स्टीरियोटैक्सिक बांह के लिए बाँझ ग्लास एलईडी प्रवेशनी संलग्न करें और एक संदर्भ के रूप में bregma का उपयोग कर निर्देशांक कैलिब्रेट। ऊतक क्षति से बचने के लिए बहुत धीरे-धीरे (300 μm / मिनट) कैनुला डालें और इसे इंजेक्शन साइट के ऊपर 100 μm रखें।
  19. एक बार एलईडी कैनुला जगह में है, क्रैनियोटॉमी के किनारे पर चिपकने वाले ऊतक की एक बूंद (100 μL) जोड़ें।
  20. खोपड़ी के लिए फाइबर को ठीक करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए दंत सीमेंट मिश्रण तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: संक्षेप में, सीमेंट सेट से पहले अधिक काम करने का समय रखने के लिए एक ठंडा चीनी मिट्टी के बरतन पकवान का उपयोग करें। चीनी मिट्टी के बरतन पकवान के लिए राल स्पष्ट पाउडर के 2 स्कूप जोड़ें, त्वरित आधार की 4 बूँदें और उत्प्रेरक की 1 बूंद जोड़ें, तो अच्छी तरह से मिश्रण। पाउडर / तरल अनुपात को समायोजित किया जा सकता है यदि एक पतली या मोटी चिपचिपाहट की आवश्यकता होती है।
  21. एक बाँझ ब्रश का उपयोग करते हुए, कैनुला कनेक्टर के चारों ओर दंत सीमेंट मिश्रण को थोड़ा-थोड़ा करके लागू करें, जब तक कि खोपड़ी को कवर नहीं किया जाता है और कनेक्टर सुरक्षित रूप से खोपड़ी से जुड़ा होता है, जिससे पिन पूरी तरह से मुक्त हो जाते हैं। माउस की त्वचा पर डेंटल सीमेंट होने से बचें।
  22. पूरी तरह से सूखने दें।
  23. ऊतक चिपकने वाला का उपयोग कर प्रत्यारोपण के आसपास की त्वचा को बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  24. माउस को 33 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग पैड पर एक रिकवरी पिंजरे में रखें दर्द / असुविधा के निम्नलिखित संकेतों में से एक या अधिक की उपस्थिति के लिए मॉनिटर करें: 1) कूबड़, मोटर गतिविधि की कमी या कमी, 2) एक अनकेप्ट गंदे कोट में परिलक्षित होने वाले दूल्हे को तैयार करने में विफलता, 3) अत्यधिक चाटना या खरोंच, चीरा साइट में लालिमा, 4) आक्रामक व्यवहार, 5) एनोरेक्सिया या निर्जलीकरण, और 6) घोंसले के गठन की कमी।
    नोट: प्रत्यारोपण detaching से बचने के लिए सभी प्रक्रियाओं के दौरान माउस को व्यक्तिगत रूप से पिंजरे में रखें। कैनुला की टुकड़ी के मामले में, 150 मिलीग्राम / किलोग्राम सोडियम पेंटोबार्बिटल इंजेक्ट करके इच्छामृत्यु करें, जिसके बाद गहरी संज्ञाहरण तक पहुंचने के बाद विच्छेदन होता है।
  25. एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए सर्जरी के बाद तीन दिनों के लिए दैनिक रूप से एक बार चमड़े के नीचे (एससी) मेलोक्सिकैम 1 मिलीग्राम / किलोग्राम इंजेक्ट करें।
  26. आगे की प्रक्रियाओं से पहले पूर्ण वसूली के लिए कम से कम 7 दिन और ऑप्सिन अभिव्यक्ति के लिए 14 दिन प्रतीक्षा करें।
    नोट: तीन दिनों के लिए हर 12 घंटे में एक पश्चात अनुवर्ती प्रदर्शन करें, फिर प्रयोग के अंत में इच्छामृत्यु के दिन तक हर दिन जानवरों की जांच करें।

2. पहुँच-से-समझ प्रशिक्षण

  1. सर्जरी के बाद 7 वें दिन, भोजन की कमी प्रोटोकॉल28 शुरू करें। उनके औसत विज्ञापन libitum शरीर के वजन को निर्धारित करने के लिए लगातार तीन दिनों के लिए चूहों का वजन. फिर, खाद्य प्रतिबंधों को शेड्यूल करें ताकि जानवरों को लगभग 90% बनाए रखने के लिए पर्याप्त पोषक तत्व प्राप्त हों और शरीर के वजन का 85% से कम न हो।
    नोट: यह दैनिक भोजन के 2.5-3 ग्राम प्रदान करके प्राप्त किया जाता है। जानवरों के वजन की दैनिक निगरानी करें और जानवरों के व्यवहार और उपस्थिति को देखने के लिए समग्र कल्याण के लिए स्कोर करें, उदाहरण के लिए, कोट और आंखों की उपस्थिति। संदर्भ29 से शरीर की स्थिति स्कोरिंग सिस्टम का उपयोग करें।
  2. पूर्व-प्रशिक्षण, प्रशिक्षण और परीक्षण अवधि के दौरान, प्रत्येक माउस को मानक खाद्य छर्रों के अलावा 20 छर्रों (20 मिलीग्राम डस्टलेस चॉकलेट-स्वाद वाले छर्रों) के साथ दैनिक ( सामग्री की तालिका देखें) (कार्य के दौरान या बाद में खाया जाता है) प्रदान करें।
  3. habituation से तीन दिन पहले, अपने घर के पिंजरों में 0.4 ग्राम / पशु / दिन 20 मिलीग्राम धूल रहित चॉकलेट-स्वाद वाले छर्रों को तितर-बितर करते हैं, इसलिए चूहे उन छर्रों से परिचित हो जाते हैं जो पहुंच-से-समझ कार्य के दौरान इनाम के रूप में काम करते हैं।
  4. चेंबर फ्लोर पर बिखरे छर्रों के साथ पूर्व-प्रशिक्षण से एक दिन पहले परीक्षण कक्ष में 10 मिनट रखकर चूहों को अभ्यस्त करें (चित्रा 1 ए)।
  5. प्रशिक्षण और परीक्षण के बाद दैनिक भोजन की अनुमति दें। हर दिन एक समान कार्यक्रम रखें।
  6. प्री-ट्रेनिंग के पहले दिन, चूहों को पहुंच-से-समझ कक्ष में रखें और सामने से निरीक्षण करें। छर्रों को उद्घाटन के करीब कक्ष के सामने रखें ताकि वे छर्रों का सेवन करना शुरू कर दें। इस स्तर पर, चूहों को किसी भी रूप में छर्रों को पकड़ने की अनुमति है।
  7. पूर्व-प्रशिक्षण के दूसरे दिन, छर्रों को उद्घाटन से आगे और आगे रखें जब तक कि उन्हें इंडेंटेशन (उद्घाटन से 1 सेमी) तक नहीं पहुंचाया जा सके ताकि चूहे अपनी पहुंच-से-समझ आंदोलन (चित्रा 1 सी) को आकार दे सकें।
  8. चूहों को पिंजरे के पीछे चलाने के लिए प्रशिक्षित करें और परीक्षणों को व्यक्तिगत बनाने के लिए एक रणनीति के रूप में अगले खाद्य गोली प्राप्त करने के लिए पिंजरे के उद्घाटन पर लौटें।
    नोट: यह तब तक प्रतीक्षा करके प्राप्त किया जा सकता है जब तक कि माउस प्रत्येक परीक्षण के लिए इंडेंटेशन में एक गोली रखने से पहले पिंजरे के पीछे न हो।
  9. छर्रों को उनके दाएं या बाएं पंजे द्वारा समझा जा सकता है।
    नोट: चूहों को समझने के लिए अधिमानतः एक पंजा का उपयोग करना शुरू कर देते हैं, जिसका उपयोग प्रशिक्षण और परीक्षण के निम्नलिखित दिनों में किया जाएगा।
  10. जानवरों को दैनिक सत्रों में 6 दिनों के लिए प्रशिक्षित करें जो 20 परीक्षणों तक चलते हैं या अधिकतम 10 मिनट तक समाप्त हो जाते हैं। प्रशिक्षण के दिन 2 से, मॉक रिसीवर डालें (आयाम 12 x 18 x 7 मिमी, 1 ग्राम, सामग्री की तालिका देखें), इसलिए चूहों को कार्य करते समय वजन की आदत हो जाती है (चित्रा 1 बी)। प्रत्येक दिन हिट और मिस्ड परीक्षणों की संख्या को स्कोर करें।
  11. एक नियमित कैमरे के साथ रिकॉर्ड व्यवहार और कक्ष के सामने से 30-60 फ्रेम / इसके अतिरिक्त, कोई भी जानवरों की मुद्रा (चित्रा 1 डी, ई) की निगरानी के लिए 45 डिग्री के कोण पर प्रशिक्षण कक्ष के नीचे एक दर्पण रख सकता है।
  12. पोस्ट-हॉक कीनेमेटिक विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए, पिंजरे के किनारे से रिकॉर्ड करने के लिए 45 ° के कोण पर एक उच्च गति कैमरा (सामग्री की तालिका देखें) माउंट करें। यदि एक 3 डी विश्लेषण की आवश्यकता है, तो कक्ष के सामने से 35 ° कोण पर रिकॉर्ड करने के लिए एक दूसरा उच्च गति कैमरा रखें; दोनों कैमरों को जानवरों की तरफदारी के आधार पर पिंजरे के दाईं या बाईं ओर रखा जाना चाहिए और एक ही फ्रेम दर पर कब्जा करना चाहिए और सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए7 (चित्रा 3 डी, ई)।
  13. यदि संभव हो तो 376 x 252 पिक्सेल या उससे अधिक के रिज़ॉल्यूशन के साथ उच्च गति वाले कैमरों को 100 फ्रेम / सेकंड पर सेट करें। पृष्ठभूमि को कम करने और इसके विपरीत (चित्रा 1 ई) बढ़ाने के लिए पक्षों और कक्ष के पीछे सफेद स्टायरोफोम दीवारों को रखें।
  14. परीक्षण के दिन, वायरलेस ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना (चित्रा 1 बी, सी) के लिए एक अवरक्त रिसीवर के साथ मॉक यूनिट को बदलें।
  15. जब चूहों तक पहुँचना शुरू हो जाता है, तो व्यवहार के समय के लिए एक निरंतर उत्तेजना रखने के लिए दूरस्थ नियंत्रक के साथ मैन्युअल रूप से एलईडी कैनुला को चालू करें और 2 एस से अधिक नहीं। प्रोग्रामिंग एक स्वचालित उत्तेजना प्रतिमान बेहतर है. उत्तेजना डिवाइस 1.0 mW / mm 2 की नोक पर तीव्रता के साथ 470 एनएम (नीली रोशनी) के एलईडी को ट्रिगर करताहै।
  16. स्कोरिंग और कीनेमेटिक विश्लेषण सहित आगे की परीक्षा के लिए वीडियो एकत्र करें।

3. पोस्ट-हॉक हिस्टोलॉजिकल पुष्टि

  1. एक प्रयोग के पूरा होने पर, वायरल अभिव्यक्ति और एलईडी कैनुला प्लेसमेंट की पुष्टि करें। केटामाइन 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 10 मिलीग्राम / किग्रा के कॉकटेल के साथ जानवर को एनेस्थेटिक करें। एक बार माउस गहरी संज्ञाहरण (चरण 1.7) के संकेत प्रस्तुत करता है, बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ 4% पीएफए के बाद।
  2. संदंश के साथ कनेक्टर को दृढ़ता से पकड़कर और धीरे से खींचकर प्रत्यारोपित कैनुला को ध्यान से हटा दें।
  3. निकालें और पोस्ट 4% पीएफए23 में 24 ज के लिए मस्तिष्क को ठीक करें।
  4. पीबीएस के साथ 3-10 मिनट धोने का प्रदर्शन करें।
  5. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके 50 μm वर्गों में मस्तिष्क को काटें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. नाभिक को दागने और स्लाइड्स को कवर करने के लिए DAPI के साथ हार्ड-सेट बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड्स में अनुभागों को माउंट करें.
  7. सूखने के बाद, confocal माइक्रोस्कोप के तहत वर्गों का निरीक्षण करें और प्रत्यारोपित कैनुला स्थान और किसी भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े Ch2R की अभिव्यक्ति को सत्यापित करें।

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Representative Results

रीच-टू-ग्रास कार्य एक प्रतिमान है जिसका उपयोग व्यापक रूप से विभिन्न प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के तहत ठीक कौशल आंदोलन के आकार, सीखने, प्रदर्शन और कीनेमेटिक्स का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। चूहे कुछ दिनों में कार्य को निष्पादित करना सीखते हैं और प्रशिक्षण के 5 दिनों के बाद एक पठार तक पहुंचने वाली 55% से अधिक सटीकता प्राप्त करते हैं (चित्रा 2 ए, बी)। जैसा कि पहले बताया गया है, जानवरों का एक प्रतिशत उचित रूप से कार्य नहीं करता है (29.62%), और उन्हें आगे के विश्लेषण30 से बाहर रखा जाना चाहिए। इनमें गैर-शिक्षार्थी चूहों (6/54 चूहों, 11.1%) का एक सबसेट शामिल है जो प्रशिक्षण की शुरुआत से ही गोली से बहुत दूर लक्ष्य को याद करता है या गोली पर सही स्थिति में होने से पहले पकड़ आंदोलन करता है। पहले प्रशिक्षण के दिनों के दौरान, एक अन्य समूह ने उच्च सटीकता के साथ कार्य किया, लेकिन दिन 3-4 (10/54 चूहों, 18.51%) द्वारा गोली से बहुत दूर लक्ष्य करके खराब प्रदर्शन करना शुरू कर दिया। इस समूह के भीतर, कुछ चूहे एक पसंदीदा पंजे का उपयोग करके प्रशिक्षण शुरू करते हैं लेकिन कुछ दिनों के बाद अपनी पसंद बदल देते हैं; यह पहले चेन एट अल द्वारा चर्चा की गई है, 201430.

पहुंच-से-समझ आंदोलन परीक्षण से परीक्षण तक और जानवरों के भीतर अत्यधिक रूढ़िवादी है (चित्रा 2)। उच्च गति की वीडियोग्राफी का उपयोग आंदोलनों के प्रक्षेपवक्र को ट्रैक करने की अनुमति देता है जिससे नियंत्रण की स्थिति में विभिन्न चरणों में और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के दौरान कीनेमेटिक्स का विश्लेषण करना संभव हो जाता है (चित्रा 1 ई और चित्रा 2 सी)। इस सन्निकटन के परिणामस्वरूप यात्रा की गई दूरी, वेग, त्वरण, अंत-बिंदु और प्रक्षेपवक्र (चित्रा 2 सी-ई) जैसे मापदंडों का मात्रात्मक मूल्यांकन होता है। दोनों बहु-पहुंच परीक्षणों का विश्लेषण करना संभव है, जहां माउस गोली को पुनः प्राप्त करने से पहले कई बार पहुंचता है, और एकल-परीक्षण की घटनाएं, जहां माउस एक एकल पहुंच आंदोलन में गोली को पुनः प्राप्त करता है। परीक्षण तब समाप्त हो जाता है जब जानवर छर्रे को दूर धकेलते हैं या पिंजरे के पीछे जाकर परीक्षण को फिर से शुरू करते हैं। विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों के तहत प्रक्षेपवक्रों की एक मात्रात्मक तुलना प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के साथ प्राप्त की जाती है, जिसके बाद के-मतलब क्लस्टरिंग (चित्रा 3जे-के)23,25 होता है।

अधिकांश प्रशिक्षण सत्रों के दौरान, चूहे कभी-कभी गोली (छूटे हुए परीक्षण) को समझने में विफल रहते हैं। कुछ जोड़तोड़ छूटे हुए परीक्षणों की संख्या को बदलते हैं और इसलिए कार्य की सटीकता। फिर, हिट और मिस्ड परीक्षणों के बीच अंतर का विश्लेषण करना आवश्यक है। हमारे हाथों में, चूक परीक्षण आंदोलन के तीन अलग-अलग चरणों में परिवर्तन के परिणामस्वरूप होते हैं: (1) पंजा चैंबर खोलने (प्रारंभिक त्रुटि) को पार करने से पहले अपने प्रक्षेपवक्र को संशोधित करता है, (2) पंजा उद्घाटन (अंतिम त्रुटि) को पार करने के बाद पंजा अपने प्रक्षेपवक्र को संशोधित करता है, और, (3) गोली को इकट्ठा करने में विफलता (समझ त्रुटि) (चित्रा 2 I, J)13 . छूटे हुए परीक्षणों की एक सामान्य विशेषता यह है कि चूहे हिट परीक्षणों (चित्रा 2 जी) की तुलना में गोली (अंत-बिंदु) से आगे बढ़ने वाले आंदोलन को शुरू करते हैं। इसके अतिरिक्त, माउस मुद्रा से जुड़े मिस को हिट और मिस्ड परीक्षणों (चित्रा 2 एच) के बीच शरीर के कोण में महत्वपूर्ण अंतर के रूप में मापा जाता है।

ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ लक्षित संरचना या न्यूरोनल आबादी के आधार पर, कोई भी व्यवहार 7,19,23,31,32,33 पर अंतर प्रभाव की उम्मीद कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में स्ट्रिएटम में स्पिनी प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (एसपीएन) को सक्रिय करने के प्रभाव का वर्णन किया गया है contralateral या ipsilateral गोलार्धों में पहुंचने वाले आंदोलन के दौरान माउस द्वारा उपयोग किए जाने वाले पसंदीदा पंजे के बारे में (चित्रा 3)। D1 डोपामाइन के contralateral सक्रियण SPNs व्यक्त, जो बेसल गैन्ग्लिया प्रत्यक्ष मार्ग को मूल देते हैं, नियंत्रण स्थितियों (चित्रा 3 बी) की तुलना में 64.9±8.8% तक सफलता को कम कर दिया। कीनेमेटिक विश्लेषण से पता चलता है कि ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के दौरान, पंजा प्रक्षेपवक्र ने एक थरथरानवाला पैटर्न का वर्णन किया, जो 218.4±19.2% नियंत्रण के लिए यात्रा की गई दूरी में वृद्धि से दिखाया गया है, जिससे गोली को लक्षित करने की अक्षमता और प्रारंभिक त्रुटि प्रकार I (चित्रा 3 एफ) में वृद्धि हुई है। पीसीए विश्लेषण से पता चलता है कि contralateral D1 SPNs सक्रियण के दौरान सभी परीक्षणों के प्रक्षेपवक्र एक नियंत्रण क्लस्टर के साथ लगभग कोई ओवरलैप के साथ एक क्लस्टर में अलग हो गए, जो कम समानता (चित्रा 3J-K) का संकेत देता है।

दूसरी ओर, ipsilateral पक्ष में dSPNs के सक्रियण से पीसीए विश्लेषण (चित्रा 3K) द्वारा दिखाए गए प्रक्षेपवक्र फैलाव में वृद्धि होती है, जो सफलता (120.7±23.6%, n = 4) तक पहुंचने को प्रभावित किए बिना, यात्रा की गई कुल दूरी (136.3±35.5%), या पहुंचने वाले चरण (117.3±10.3%) के दौरान अधिकतम वेग (चित्रा 3C) को दर्शाता है, यह दर्शाता है कि ipsilateral D1 SPNs सक्रियण कुछ हद तक पहुंचने वाले प्रक्षेपवक्र में संशोधित किया गया है। ). कीनेमेटिक विश्लेषण ipsilateral हेरफेर द्वारा आंदोलन नियंत्रण में सूक्ष्म परिवर्तन ों को इंगित करता है। अंत में, शरीर की मुद्रा विश्लेषण contralateral D1SPNs सक्रियण (चित्रा 3L) के दौरान शरीर के कोण में एक बदलाव से पता चलता है। यह हाइलाइट किया गया है कि यहां तक कि इस सरल कार्य में कई घटक हैं जो एक लक्ष्य प्राप्त करने के लिए उचित आंदोलन निष्पादन की अनुमति देते हैं।

Figure 1
चित्र1: प्रयोगात्मक सेटअप. (A) व्यवहार कक्ष की योजनाबद्धताएँ. एक्रेलिक शीट के साथ बनाया गया एक कक्ष जिसमें सेमी में निम्नलिखित आयाम होते हैं: 18.5 (h) x 8.5 (w) x 20 (d) एक सामने की खिड़की 1 (w) x 5 (h) और एक छोटी शेल्फ 8.5 (w) x 4 (d) के साथ। (बी) एलईडी कैनुला (बाएं) और वायरलेस रिसीवर (दाएं) की तस्वीर। (सी) रीच-टू-स्पर्स कार्य करते समय रिसीवर से जुड़े प्रत्यारोपित एलईडी कैनुला के साथ माउस का साइड व्यू (सफेद एरोहेड रिसीवर को दिखाता है, तारांकन कैनुला को पकड़ने वाले दंत सीमेंट को दिखाता है, और खाली एरोहेड गोली दिखाता है)। (d) प्रयोगात्मक सेटअप का स्केच। दो उच्च गति वाले कैमरे दो आयामों में पहुंच को रिकॉर्ड करते हैं, जबकि तीसरे ने कार्य का एक मनोरम दृश्य एकत्र किया, जिसमें कक्ष के नीचे दर्पण से माउस का स्थान भी शामिल था। जानवर अपने पसंदीदा पंजे को चुनने के लिए स्वतंत्र थे, और उत्तेजना पक्ष हमेशा पसंदीदा पंजे के पक्ष को संदर्भित करते हैं। (ई) एक परीक्षण के दौरान प्रत्येक कैमरे के कैमरों और प्रतिनिधि छवि की सटीक स्थिति। इस आंकड़े को संदर्भ23 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: व्यवहार तक पहुंचने का कीनेमेटिक विश्लेषण। (ए) दिन-0 (डी 0) से दिन -25 (डी 25) तक प्रयोग की समयरेखा। (बी) समय के साथ पहुंच-से-समझ कार्य के दौरान प्रदर्शन को पैलेट पुनर्प्राप्ति सटीकता के रूप में मापा जाता है (सफल समझ की कुल संख्या / परीक्षणों की कुल संख्या x 100)। (सी) एक उच्च गति वीडियो से प्रक्षेपवक्र ट्रैकिंग का उदाहरण। (डी) हिट और छूटे हुए परीक्षणों के दौरान पंजे के व्यक्तिगत प्रक्षेपवक्र। (ई) हिट और मिस्ड परीक्षणों के दौरान पंजे द्वारा तय की गई कुल दूरी। (च) हिट में प्रक्षेपवक्र के माध्यम से पंजे का त्वरण और छूटे हुए परीक्षणों को दूरी बनाम के रूप में प्लॉट किया गया है। वेग। (जी) हिट में अंत-बिंदु दूरी का सारांश = 3.16 मिमी, 6.08 मिमी याद करता है (मान-व्हिटनी-विलकॉक्सन परीक्षणमिस्ड बनाम हिट यू = 4184, पी<0.0001, एन = 28 चूहे)। (एच) दो प्रकार के परीक्षणों में शरीर के कोण में अंतर, मिस = 8.4±5.3 डिग्री, 6.7±4° हिट करता है (मान-व्हिटनी-विलकॉक्सन परीक्षण यू = 6437, पी = 0.0243, एन = 28 चूहे)। (I) तीन प्रकार की त्रुटियों की योजनाएं। (जे) नियंत्रण स्थितियों में चूहों द्वारा की गई तीन प्रकार की त्रुटियों का अनुपात। इस आंकड़े को संदर्भ23 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पहुँच-से-समझ व्यवहार के दौरान contralateral और ipsilateral D1 SPNs के ऑप्टोजेनेटिक सक्रियण. (A) उत्तेजना प्रतिमान की योजनाबद्धता। (बी) गैर-उत्तेजना परीक्षणों की तुलना में सफलता दर। (c) नियंत्रण स्थितियों की तुलना में यात्रा की गई दूरी में परिवर्तन। (डी), (जी) ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के साथ और बिना पंजे द्वारा बनाए गए पथों के दो आयामी भूखंड। (ई) , (एच) आंदोलनों तक पहुंचने के दौरान पंजे द्वारा तय की गई कुल दूरी। (F) , (I) विभिन्न प्रकार की त्रुटियों के वितरण का सारांश। D1 contralateral: प्रारंभिक त्रुटि या प्रकार I (नियंत्रण = 18.2±11.6%, उत्तेजना = 79.9±8.2% फिशर का सटीक परीक्षण, p<0.0001)। (जे) D1SPNs के contralateral सक्रियण की तुलना में नियंत्रण स्थितियों में trajectories के पीसीए विश्लेषण का उदाहरण। छायांकित क्षेत्र प्रत्येक स्थिति के क्लस्टर का प्रतिनिधित्व करता है, और स्टार क्लस्टर केंद्रक है। (के) विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के समूहों के बीच ओवरलैप का सारांश। (एल) शरीर के कोण में परिवर्तन। इस आंकड़े को संदर्भ23 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार प्रतिमानों में न्यूरोनल आबादी के ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर का उपयोग मोटर नियंत्रण 7,23 के अंतर्निहित तंत्रके बारे में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ा रहा है। वायरलेस तरीके विशेष रूप से उन कार्यों के लिए उपयुक्त हैं जिनके लिए कई जानवरों या मुफ्त आंदोलन34,35 पर परीक्षण की आवश्यकता होती है। फिर भी, जैसा कि तकनीकों और उपकरणों को परिष्कृत किया जाता है, यह ऑप्टोजेनेटिक्स34,36 के साथ संयुक्त किसी भी व्यवहार कार्य के लिए जाने वाला विकल्प होना चाहिए।

वर्तमान विधि के कई फायदे हैं क्योंकि लघुकृत एलईडी उच्च तीव्रता के साथ एक विश्वसनीय प्रकाश स्रोत प्रदान करते हैं, और प्रत्यारोपण का उपयोग कई दिनों में उत्तेजना की आवश्यकता वाले अध्ययनों में किया जा सकता है। फिर भी, ऑप्सिन उत्तेजना के लिए एक ऑप्टिक फाइबर का सम्मिलन यांत्रिक रूप से मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचा सकता है, कैनुला37 के स्थान पर संक्रमण और कभी-कभी सूजन का कारण बन सकता है। लंबे समय तक चलने वाली उच्च आवृत्ति ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना को गर्मी का उत्पादन करने के लिए प्रदर्शित किया गया है और फोटोटॉक्सिटी37 का कारण बन सकता है। लाल-स्थानांतरित प्रभावक ऑप्सिन का उपयोग करके फोटोटॉक्सिसिटी को कम करना संभव है जो लाल या यहां तक कि निकट-अवरक्त प्रकाश के साथ सक्रिय होते हैं, जो गर्मी38 की पीढ़ी को कम करता है।

इसके अलावा, चूंकि रिसीवर को जोड़ने के लिए पिन खोपड़ी के बाहर रहते हैं, कभी-कभी चूहे विस्थापन या कैनुला की टुकड़ी का कारण बन सकते हैं यदि दंत सीमेंट को सही ढंग से लागू नहीं किया जाता है; यह अक्सर मस्तिष्क के ऊतकों की क्षति की ओर जाता है और आगे के विश्लेषण के लिए ध्यान में रखे जाने वाले विषयों की संख्या को कम कर देता है। हाल के विकास ने फाइबरलेस ऑप्टोजेनेटिक्स पेश किया है, जो उन कणों का उपयोग करता है जो मस्तिष्क के ऊतकों में गहराई से प्रवेश करने वाले निकट-अवरक्त प्रकाश के जवाब में अप-रूपांतरण ल्यूमिनेसेंस के माध्यम से दृश्यमान प्रकाश उत्सर्जित कर सकतेहैं। फाइबररहित उपकरण ों को अनपेक्षित प्रत्यारोपण35 के साथ स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों में लंबे समय तक फ्रेम में ऑप्टोजेनेटिक रूप से उत्तेजित करने का अवसर मिलता है। यह पानी की भूलभुलैया में भी अनियंत्रित गति के लिए अनुमति देता है, कई जानवरों को एक साथ रखा जाता है (सामाजिक अलगाव के प्रभाव से बचने के लिए), और अधिक प्राकृतिक सेटिंग्स35,36 में जानवरों का अध्ययन करने के लिए।

यहां तक कि सभी फायदों के साथ जो फाइबररहित ऑप्टोजेनेटिक्स प्रदान करता है, यह अभी भी बायोकॉम्पैटिबिलिटी और गर्मी पीढ़ी की चुनौतियों का सामना करता है। फोटॉन रूपांतरण की दक्षता भी इसे सीमित करती है। अंत में, उच्च उत्सर्जन दक्षता34,36 के लिए और सुधार की आवश्यकता है।

उच्च गति वीडियोग्राफी के साथ इस प्रतिमान का संयोजन विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में कीनेमेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यह व्यवहार और मोटर नियंत्रण के अलग-अलग घटकों पर भी सूक्ष्म प्रभावों का संवेदनशील पता लगाने की पेशकश करता है। जैसे-जैसे अधिक विश्लेषणात्मक उपकरण विकसित होते हैं, ऑनलाइन कीनेमेटिक विश्लेषण और विभिन्न संदर्भों में मोटर व्यवहार का गहराई से लक्षण वर्णन करना संभव है। माउस के आंदोलन कीनेमेटीक्स तक पहुंचने की एक पूरी तरह से परिमाणीकरण हाल ही में बेकर एट अल.25 द्वारा प्रकाशित किया गया है।

न्यूनतम इनवेसिव तकनीकों के साथ स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में न्यूरोनल आबादी में चुनिंदा हेरफेर करने की संभावना एक को सटीक व्यवहार कार्यों में विशिष्ट न्यूरोनल प्रकारों के योगदान को विच्छेदित करने की अनुमति देतीहै। रीच-टू-स्पर्स कार्य मोटर व्यवहार13,19 के लिए एक ट्रांसलेटेबल प्रतिमान है। यह ज्ञात है कि संरक्षित मस्तिष्क संरचनाएं अधिग्रहण, सीखने और कार्य 7,12,23 के प्रदर्शन के विभिन्न चरणों में भाग लेती हैं। तंत्रिका सर्किट का खुलासा करना जो इस व्यवहार को रेखांकित करता है, मोटर नियंत्रण की समझ में वृद्धि करेगा। कई अध्ययन यूनिमैनुअल कार्यों पर द्वि-अर्धगोलाकार नियंत्रण के महत्व को उजागर करते हैं, खासकर जब उच्च निपुणता की आवश्यकता होती है20,21,22। ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़ के साथ संयुक्त कीनेमेटिक विश्लेषण इस जटिल व्यवहार के विभिन्न तंत्रों की जांच के लिए अनुमति देता है। यह सामान्य परिस्थितियों और रोग मॉडल में संवेदी-मोटर प्रतिक्रिया के योगदान का विश्लेषण करने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासा नहीं किया है।

Acknowledgments

इस काम को UNAM-PAPIIT परियोजना IA203520 द्वारा समर्थित किया गया था। हम माउस उपनिवेशों के रखरखाव और आईटी समर्थन के लिए कम्प्यूटेशनल इकाई के साथ उनकी मदद के लिए आईएफसी पशु सुविधा को धन्यवाद देते हैं, विशेष रूप से फ्रांसिस्को पेरेज़-यूजीनियो के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

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References

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Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

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