Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Il presente protocollo descrive come utilizzare l'optogenetica wireless combinata con la videografia ad alta velocità in un singolo compito di reach-to-grasp del pellet per caratterizzare i circuiti neurali coinvolti nell'esecuzione del comportamento motorio qualificato nei topi che si muovono liberamente.

Abstract

Le capacità motorie sono essenziali nella vita di tutti i giorni e possono essere compromesse in diversi disturbi del sistema nervoso. L'acquisizione e l'esecuzione di questi compiti richiedono l'integrazione senso-motoria e comportano un controllo preciso dei circuiti cerebrali bilaterali. L'implementazione di paradigmi comportamentali unimanuali in modelli animali migliorerà la comprensione del contributo delle strutture cerebrali, come lo striato, al comportamento motorio complesso in quanto consente la manipolazione e la registrazione dell'attività neurale di nuclei specifici in condizioni di controllo e malattia durante l'esecuzione del compito.

Fin dalla sua creazione, l'optogenetica è stata uno strumento dominante per interrogare il cervello consentendo l'attivazione o l'inibizione selettiva e mirata delle popolazioni neuronali. La combinazione di optogenetica con saggi comportamentali fa luce sui meccanismi alla base di specifiche funzioni cerebrali. I sistemi wireless montati sulla testa con diodi a emissione di luce miniaturizzati (LED) consentono il controllo optogenetico remoto in un animale completamente libero. Ciò evita che le limitazioni di un sistema cablato siano meno restrittive per il comportamento degli animali senza compromettere l'efficienza dell'emissione luminosa. L'attuale protocollo combina un approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità in un compito di destrezza unimanuale per sezionare il contributo di specifiche popolazioni neuronali al comportamento motorio fine.

Introduction

Il comportamento motorio qualificato è presente durante la maggior parte dei movimenti eseguiti da noi ed è noto per essere influenzato in diversi disturbi cerebrali 1,2,3,4,5,6. L'implementazione di compiti che consentano di studiare lo sviluppo, l'apprendimento e le prestazioni di movimenti qualificati è fondamentale per comprendere le basi neurobiologiche della funzione motoria, specialmente nei modelli di lesioni cerebrali, disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico 2,7,8,9,10,11,12,13 . Raggiungere e recuperare oggetti viene fatto di routine nelle azioni della vita di tutti i giorni, ed è una delle prime abilità motorie acquisite durante lo sviluppo precoce e poi perfezionate negli anni 5,6. Comprende un comportamento complesso che richiede processi senso-motori come la percezione delle caratteristiche dell'oggetto, la pianificazione del movimento, la selezione dell'azione, l'esecuzione del movimento, la coordinazione del corpo e la modulazione della velocità 7,14,15,16. Pertanto, i compiti unimanuali ad alta destrezza richiedono la partecipazione di molte strutture cerebrali di entrambi gli emisferi 16,17,18,19,20,21,22. Nei topi, il singolo compito di reach-to-grasp del pellet è caratterizzato per diverse fasi che possono essere controllate e analizzate separatamente 7,13,23. Questa caratteristica permette di studiare il contributo di specifiche sottopopolazioni neuronali a diversi stadi di acquisizione e prestazioni comportamentali e fornisce una piattaforma per studi dettagliati dei sistemi motori 13,23,24. Il movimento avviene in un paio di secondi; pertanto, la videografia ad alta velocità dovrebbe essere utilizzata per l'analisi cinematica in fasi distinte della traiettoria motoria qualificata 7,25. Diversi parametri possono essere estratti dai video, tra cui la postura del corpo, la traiettoria, la velocità e il tipo di errori25. L'analisi cinematica può essere utilizzata per rilevare sottili cambiamenti durante la manipolazione optogenetica wireless 7,23.

L'utilizzo di diodi miniaturizzati a emissione di luce (LED) per fornire luce tramite un sistema wireless montato sulla testa consente di avere un controllo optogenetico remoto mentre l'animale esegue il compito. Il controller optogenetico wireless accetta comandi di trigger a impulso singolo o continuo da uno stimolatore e invia segnali a infrarossi (IR) a un ricevitore collegato al LED miniaturizzato23,26. L'attuale protocollo combina questo approccio optogenetico wireless con la videografia ad alta velocità di un compito di destrezza per sezionare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali durante l'esecuzione del comportamento motorio fine23. Poiché si tratta di un compito unimanuale, consente di valutare la partecipazione delle strutture in entrambi gli emisferi. Tradizionalmente, il cervello controlla il movimento del corpo in modo altamente asimmetrico; tuttavia, i compiti ad alta destrezza richiedono un'attenta coordinazione e controllo da parte di molte strutture cerebrali, compresi i nuclei ipsilaterali e il contributo differenziale delle sottopopolazioni neuronali all'interno dei nuclei 10,20,21,22,23. Questo protocollo mostra che le strutture sottocorticali di entrambi gli emisferi controllano la traiettoria dell'artoanteriore 23. Questo paradigma può essere adatto per studiare altre regioni del cervello e modelli di malattie cerebrali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le procedure che coinvolgono l'uso degli animali sono state condotte seguendo le linee guida locali e nazionali e approvate dal corrispondente Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (Istituto di fisiologia cellulare protocollo IACUC VLH151-19). Nel protocollo corrente sono stati utilizzati topi maschi transgenici Drd1-Cre27, 35-40 giorni postnatali con background C57BL/6. I topi sono stati tenuti nelle seguenti condizioni: temperatura 22±1 °C; umidità 55%; orario luci 12/12 h con luci spente alle 19:00 e sono stati svezzati al giorno postnatale 21. I cuccioli svezzati erano ospitati in gruppi dello stesso sesso di 2-5. Gli animali sono stati alloggiati in alloggi statici con piani di micro-barriera. La biancheria da letto consisteva in trucioli di pioppo sterile. I pellet di roditori e l'acqua purificata da RO sono stati forniti ad libitum, tranne quando indicato.

1. Procedure chirurgiche

  1. Preparare una cannula LED alla lunghezza desiderata secondo le coordinate dorsoventrali della struttura di interesse (idealmente 0,5 mm in più per tenere conto dello spessore del cranio, per lo striato dorsolaterale 3,5 mm) (Figura 1).
    1. Tagliare la fibra di vetro a una lunghezza superiore alla dimensione finale desiderata, macinare la punta della fibra alla lunghezza target con carta vetrata ruvida e, infine, lucidare la punta della fibra con carta vetrata fine.
      NOTA: La cannula LED è una fibra ottica di vetro di 250 μm di diametro collegata ad un ricevitore a infrarossi (vedi Tabella dei Materiali).
  2. Tirare le pipette di vetro (diametro esterno di 1,14 mm, diametro interno di 0,53 mm e lunghezza di 3,5 mm) per il nanoiniettore con un estrattore orizzontale (vedere Tabella dei materiali) e conservarle per dopo. Programmare l'estrattore in un unico anello per ottenere un diametro della punta di 15-20 μm con un lungo cono di pendenza graduale (4-5 mm).
  3. Preparare l'area chirurgica disinfettando accuratamente l'apparato stereotassico, il cappuccio, il microiniettore (vedi Tabella dei materiali) e le superfici circostanti con etanolo al 70%.
    NOTA: Un apparato stereotassico del mouse è essenziale per iniettare con precisione Adeno Associated Virus (AAV) e posizionare la cannula LED nella regione di interesse.
  4. Indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati per la procedura, tra cui un cappotto da laboratorio pulito o un camice chirurgico monouso, guanti sterili, maschera facciale e copricapo monouso.
  5. Posizionare l'attrezzatura necessaria vicino all'area chirurgica, come strumenti chirurgici sterili, punte di cotone, soluzioni, micropipette, punte di pipette, capillari, micro-riempimento con olio minerale e pennarello.
  6. Riempire una pipetta per microiniezioni con olio minerale e posizionarla nel microiniettore. Assicurarsi che il microiniettore funzioni correttamente espellendo un po 'di olio minerale.
    NOTA: Tutti gli strumenti utilizzati durante l'intervento devono essere autoclavati e sterili. Dovrebbe essere usata la tecnica asettica.
  7. Anestetizzare gli animali con isoflurano gassoso 4-5% per indurre anestesia e 1,2% durante l'intervento chirurgico con 0,5-1 L/min di ossigeno puro. L'intervento inizia solo dopo che l'animale ha raggiunto un punto di anestesia profonda, valutato dall'assenza di ritiro della zampa dopo un leggero pizzico.
    1. Monitorare continuamente la frequenza respiratoria e la temperatura dell'animale. Mantenere la temperatura corporea con una piastra riscaldante impostata a 34 °C.
  8. Applicare un unguento oftalmico. Rimuovere i peli dal cuoio capelluto con un trimero e una crema per la depilazione. Pulire il cuoio capelluto con tamponi di cotone con l'8% di povidone-iodio (vedi Tabella dei materiali) e il 70% di etanolo alternati tre volte ciascuno.
  9. Posizionare il mouse nell'apparato stereotassico e fissare la testa, assicurandosi che il cranio sia livellato negli assi mediolaterale e anteriore-posteriore.
  10. Fai un'incisione di 1 cm con un bisturi attraverso il cuoio capelluto a livello degli occhi lungo l'asse sagittale. Ritrarre la pelle per esporre il cranio e pulire il periostio con tamponi di cotone.
  11. Pulire la superficie del cranio con soluzione salina e tamponi di cotone sterili. Risolvere eventuali emorragie in superficie utilizzando lance oculari assorbenti sterili (vedere Tabella dei materiali) o materiale assorbente sterile simile.
  12. Applicare una goccia di perossido di idrogeno al 2,5% con un batuffolo di cotone e lasciarlo agire per alcuni secondi per rendere visibili le suture del cranio e avere un riferimento migliore. Dopo alcuni secondi, pulire accuratamente con un batuffolo di cotone pulito.
  13. Con la pipetta di vetro (diametro finale della punta di 15 μm), individuare bregma e lambda per verificare che il cranio sia livellato nell'asse anteriore-posteriore.
    NOTA: Si consiglia di avere un microscopio stereoscopico o un microscopio USB per vedere la punta della pipetta di vetro. Nel caso in cui sia necessario, regolare l'altezza del supporto della bocca per livellare il cranio.
  14. Spostare il capillare verso le coordinate anteriore-posteriore (AP) e mediale-laterale (ML) selezionate (striato dorsolaterale AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Dipingete un punto di riferimento nel cuoio capelluto sopra le coordinate selezionate con un marcatore sterile.
  15. Nel punto di riferimento, eseguire una craniotomia di circa 1 mm di diametro applicando una leggera pressione al cranio con un utensile rotante sterile o un trapano dentale a velocità medio-bassa con una piccola punta da trapano dentale rotonda (vedere Tabella dei materiali).
  16. Caricare il capillare con 300-400 nL di virus adeno-associato credipendente (AAV) come AAV1-dflox-hChR-2-mCherry per esprimere Channelrhodopsin o un AAV per esprimere solo la proteina reporter (ad esempio, mCherry) come controllo nella regione di interesse (vedere Tabella dei materiali). Verificare che la punta non sia intasata, quindi introdurre la pipetta di vetro nel cervello alle coordinate dorso-ventrali (DV) desiderate (striato dorsolaterale DV -3,35 mm).
    1. Iniettare 200 nL utilizzando un iniettore automatico ad una velocità di 23 nL/s. Attendere 10 minuti dopo aver terminato l'iniezione, prelevare lentamente la pipetta di vetro per evitare fuoriuscite.
      NOTA: È possibile utilizzare un ago da 30 G per iniettare con l'apposito microiniettore.
  17. Pulire e asciugare eventuali residui con tamponi di cotone.
  18. Collegare la cannula LED in vetro sterile al braccio stereotassico e calibrare le coordinate utilizzando bregma come riferimento. Inserire la cannula molto lentamente (300 μm/min) per evitare danni ai tessuti e posizionarla a 100 μm sopra il sito di iniezione.
  19. Una volta che la cannula LED è in posizione, aggiungere una goccia (100 μL) di adesivo tissutale sul bordo della craniotomia.
  20. Preparare la miscela di cemento dentale (vedere Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore per fissare la fibra al cranio.
    NOTA: Brevemente, utilizzare un piatto di porcellana refrigerato per avere più tempo di lavoro prima dei set di cemento. Aggiungere 2 misurini di polvere trasparente di resina al piatto di porcellana, aggiungere 4 gocce di base rapida e 1 goccia di catalizzatore, quindi mescolare bene. Il rapporto polvere/liquido può essere regolato se è necessaria una viscosità più sottile o più spessa.
  21. Usando un pennello sterile, applicare la miscela di cemento dentale attorno al connettore della cannula a poco a poco, costruendo strati fino a quando il cranio è coperto e il connettore è fissato saldamente al cranio, lasciando i perni completamente liberi. Evitare di ottenere cemento dentale sulla pelle del mouse.
  22. Lasciare asciugare completamente.
  23. Chiudere la pelle intorno all'impianto utilizzando adesivo tissutale (vedere Tabella dei materiali).
  24. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero sopra una piastra riscaldante a 33 ° C. Monitorare la presenza di uno o più dei seguenti segni di dolore / disagio: 1) Curvo, mancanza o riduzione dell'attività motoria, 2) Mancata toelettatura riflessa in un cappotto sporco non tenuto, 3) Eccessiva leccatura o graffio, arrossamento nel sito di incisione, 4) comportamento aggressivo, 5) anoressia o disidratazione e 6) Mancanza di formazione del nido.
    NOTA: Tenere il mouse ingabbiato singolarmente durante tutte le procedure per evitare il distacco dell'impianto. In caso di distacco della cannula, eseguire l'eutanasia iniettando 150 mg/kg di pentobarbital di sodio seguito da decapitazione dopo il raggiungimento dell'anestesia profonda.
  25. Iniettare per via sottocutanea (SC) meloxicam 1 mg/kg una volta al giorno per tre giorni dopo l'intervento chirurgico per fornire analgesia.
  26. Attendere almeno 7 giorni per il recupero completo e 14 giorni per l'espressione di opsin prima di ulteriori procedure.
    NOTA: Eseguire un follow-up postoperatorio ogni 12 ore per tre giorni, quindi controllare gli animali ogni giorno fino al giorno dell'eutanasia alla fine dell'esperimento.

2. Formazione reach-to-grasp

  1. Il giorno 7 post-operatorio, iniziare il protocollo di deprivazione alimentare28. Pesare i topi per tre giorni consecutivi per determinare il loro peso corporeo medio ad libitum. Quindi, programmare le restrizioni alimentari in modo che gli animali ricevano abbastanza nutrienti per mantenere circa il 90% e non meno dell'85% del peso corporeo.
    NOTA: Questo si ottiene fornendo 2,5-3 g di cibo al giorno. Monitora quotidianamente il peso degli animali e segna il benessere generale osservando il comportamento e l'aspetto degli animali, ad esempio l'aspetto del mantello e degli occhi. Utilizzare il sistema di punteggio delle condizioni corporee del riferimento29.
  2. Durante i periodi di pre-allenamento, formazione e test, fornire a ciascun topo 20 pellet (20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere) al giorno (vedi Tabella dei materiali) (mangiati durante l'attività o dopo) oltre ai pellet alimentari standard.
  3. Tre giorni prima dell'assuefazione, spargere 0,4 g / animale / giorno 20 mg di pellet al gusto di cioccolato senza polvere nelle loro gabbie domestiche, in modo che i topi facciano conoscenza con i pellet che servono come ricompensa durante il compito di raggiungere la presa.
  4. Abituare i topi mettendoli 10 minuti nella camera di prova un giorno prima del pre-allenamento con pellet sparsi sul pavimento della camera (Figura 1A).
  5. Lasciare il cibo ogni giorno dopo l'allenamento e il test. Mantieni un programma simile ogni giorno.
  6. Il primo giorno di pre-addestramento, posiziona i topi nella camera di presa e osserva dalla parte anteriore. Posizionare i pellet davanti alla camera vicino all'apertura in modo che inizino a consumare i pellet. In questa fase, i topi sono autorizzati ad afferrare i pellet in qualsiasi forma.
  7. Il secondo giorno di pre-allenamento, posizionare i pellet sempre più lontano dall'apertura fino a portarli alla rientranza (1 cm dall'apertura) in modo che i topi possano modellare il loro movimento di presa (Figura 1C).
  8. Addestra i topi a correre verso la parte posteriore della gabbia e tornare all'apertura della gabbia per ricevere il prossimo pellet di cibo come strategia per individualizzare le prove.
    NOTA: questo può essere ottenuto aspettando che il mouse si trovi nella parte posteriore della gabbia prima di posizionare un pellet nella rientranza per ogni prova.
  9. Posiziona i pellet per essere afferrati dalla zampa destra o sinistra.
    NOTA: I topi iniziano a usare preferenzialmente una zampa da afferrare, che verrà utilizzata nei giorni successivi di allenamento e test.
  10. Addestrare gli animali per 6 giorni in sessioni giornaliere della durata di 20 prove o fino a un massimo di 10 minuti. Dal giorno 2 di allenamento, metti il ricevitore simulato (dimensioni 12 x 18 x 7 mm, 1 g, vedi Tabella dei materiali), in modo che i topi si abituino al peso durante l'esecuzione del compito (Figura 1B). Ogni giorno segna il numero di prove hit e missed.
  11. Registra il comportamento con una normale fotocamera e cattura 30-60 fotogrammi / s dalla parte anteriore della camera. Inoltre, è possibile posizionare uno specchio sotto la camera di addestramento con un angolo di 45 ° per monitorare la postura degli animali (Figura 1D, E).
  12. Per l'analisi cinematica post-hoc (Figura 2), montare una telecamera ad alta velocità (vedi Tabella dei materiali) con un angolo di 45° per registrare dal lato della gabbia. Se è necessaria un'analisi 3D, posizionare una seconda telecamera ad alta velocità per registrare con un angolo di 35 ° dalla parte anteriore della camera; entrambe le telecamere devono essere posizionate sul lato destro o sinistro della gabbia a seconda della sidedness degli animali e devono catturare allo stesso frame rate ed essere sincronizzate7 (Figura 3D, E).
  13. Impostare le telecamere ad alta velocità su 100 fotogrammi/s con una risoluzione di 376 x 252 pixel o più, se possibile. Posizionare le pareti di polistirolo bianco dietro i lati e il retro della camera per ridurre lo sfondo e aumentare il contrasto (Figura 1E).
  14. Il giorno del test, sostituire l'unità fittizia con un ricevitore a infrarossi per la stimolazione optogenetica wireless (Figura 1B, C).
  15. Quando i topi iniziano a raggiungere, ruotare manualmente la cannula LED con il telecomando per avere una stimolazione continua per il tempo in cui viene eseguito il comportamento e per non più di 2 s. È preferibile programmare un paradigma di stimolazione automatica. Il dispositivo di stimolazione attiva un LED di 470 nm (luce blu) con intensità sulla punta di 1,0 mW/mm2.
  16. Raccogli i video per un ulteriore esame, incluso il punteggio e l'analisi cinematica.

3. Conferma istologica post-hoc

  1. Al termine di un esperimento, confermare l'espressione virale e il posizionamento della cannula LED. Anestetizzare l'animale con un cocktail di ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Una volta che il topo presenta segni di anestesia profonda (fase 1.7), perfondere con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) seguita da PFA al 4%.
  2. Rimuovere accuratamente la cannula impiantata afferrando saldamente il connettore con una pinza e tirando delicatamente verso l'alto.
  3. Estrarre e post-fissare il cervello per 24 ore in 4% PFA23.
  4. Eseguire lavaggi di 3-10 minuti con PBS.
  5. Tagliare il cervello in sezioni da 50 μm usando un microtomo (vedi Tabella dei materiali).
  6. Montare le sezioni in guide con supporti di montaggio rigidi con DAPI per macchiare nuclei e coprire diapositive.
  7. Dopo l'essiccazione, osservare le sezioni al microscopio confocale e verificare la posizione della cannula impiantata e l'espressione di Ch2R fusa con qualsiasi proteina fluorescente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il compito reach-to-grasp è un paradigma ampiamente utilizzato per studiare la modellazione, l'apprendimento, le prestazioni e la cinematica del movimento delle abilità fini sotto diverse manipolazioni sperimentali. I topi imparano a eseguire l'attività in un paio di giorni e raggiungono una precisione superiore al 55% raggiungendo un plateau dopo 5 giorni di allenamento (Figura 2A, B). Analogamente a quanto riportato in precedenza, una percentuale di animali non svolge il compito in modo appropriato (29,62%), e questi dovrebbero essere esclusi da ulteriori analisi30. Questi includono un sottogruppo di topi non apprendenti (6/54 topi, 11,1%) che dall'inizio dell'allenamento mancano il bersaglio puntando troppo lontano dal pellet o eseguono il movimento di presa prima di essere nella posizione corretta sopra il pellet. Durante i primi giorni di allenamento, un altro gruppo ha eseguito il compito con elevata precisione, ma ha iniziato a funzionare male puntando troppo lontano dal pellet entro il giorno 3-4 (10/54 topi, 18,51%). All'interno di questo gruppo, alcuni topi iniziano ad allenarsi usando una zampa preferita ma cambiano la loro preferenza dopo alcuni giorni; questo è stato precedentemente discusso da Chen et al., 201430.

Il movimento reach-to-grasp è altamente stereotipato da una prova all'altra e all'interno degli animali (Figura 2). L'uso della videografia ad alta velocità consente di tracciare la traiettoria dei movimenti rendendo possibile l'analisi cinematica in diverse fasi della condizione di controllo e durante la stimolazione optogenetica (Figura 1E e Figura 2C). Questa approssimazione si traduce in una valutazione quantificabile di parametri come la distanza percorsa, la velocità, l'accelerazione, l'endpoint e la traiettoria (Figura 2 C-E). È possibile analizzare sia le prove multi-reach, in cui il mouse raggiunge più volte prima di recuperare il pellet, sia gli eventi a prova singola, in cui il mouse recupera il pellet in un singolo movimento di raggiungimento. La prova è terminata quando gli animali spingono via il pellet o riavviano la prova andando sul retro della gabbia. Un confronto quantitativo delle traiettorie in diverse condizioni sperimentali è ottenuto con l'analisi delle componenti principali (PCA) seguita dal clustering k-means (Figura 3J-K)23,25.

Durante la maggior parte delle sessioni di allenamento, i topi a volte non riescono a cogliere il pellet (prove mancate). Alcune manipolazioni cambiano il numero di prove perse e quindi l'accuratezza del compito. Quindi, è essenziale analizzare le differenze tra prove colpite e mancate. Nelle nostre mani, le prove mancate derivano da cambiamenti in tre fasi distinte del movimento: (1) la zampa modifica la sua traiettoria prima di attraversare l'apertura della camera (errore iniziale), (2) la zampa modifica la sua traiettoria dopo che la zampa attraversa l'apertura (errore finale) e, (3) mancata raccolta del pellet (errore di presa) (Figura 2 I,J)13 . Una caratteristica generale delle prove mancate è che i topi iniziano il movimento di presa più lontano dal pellet (end-point) rispetto alle prove di hit (Figura 2G). Inoltre, i mancati incidenti associati alla postura del topo sono misurati come differenze significative nell'angolo del corpo tra le prove colpite e mancate (Figura 2H).

A seconda della struttura o della popolazione neuronale mirata con l'optogenetica, ci si può aspettare effetti differenziali sul comportamento 7,19,23,31,32,33. L'attuale protocollo descrive l'impatto dell'attivazione dei neuroni di proiezione spinosa (SPN) nello striato negli emisferi controlaterale o ipsilaterale sulla zampa preferita utilizzata dal topo durante il movimento di raggiungimento (Figura 3). L'attivazione controlaterale degli SPN che esprimono dopamina D1, che danno origine alla via diretta dei gangli della base, ha ridotto il successo di presa al 64,9±8,8% rispetto alle condizioni di controllo (Figura 3B). L'analisi cinematica rivela che durante la stimolazione optogenetica, la traiettoria della zampa ha descritto un modello oscillatorio, mostrato da un aumento della distanza percorsa al 218,4±19,2% del controllo, portando all'incapacità di colpire il pellet e ad un aumento dell'errore iniziale di tipo I (Figura 3F). L'analisi PCA mostra che tutte le traiettorie degli studi durante l'attivazione degli SPN D1 controlaterali si sono separate in un cluster con quasi nessuna sovrapposizione con un cluster di controllo, indicando una bassa somiglianza (Figura 3J-K).

D'altra parte, l'attivazione dei dSPN nel lato ipsilaterale porta ad un aumento della dispersione della traiettoria mostrata dall'analisi PCA (Figura 3K) senza influire sul raggiungimento del successo (120,7±23,6%, n = 4), della distanza totale percorsa (136,3±35,5%) o della velocità massima durante la fase di raggiungimento (117,3±10,3%) (Figura 3C), indicando che l'attivazione ipsilaterale degli SPN D1 ha modificato in qualche misura la traiettoria di raggiungimento senza modificare l'esito comportamentale (Figura 3G-I ). L'analisi cinematica indica sottili cambiamenti nel controllo del movimento mediante manipolazione ipsilaterale. Infine, l'analisi della postura del corpo mostra uno spostamento dell'angolo del corpo durante l'attivazione controlaterale dei D1SPN (Figura 3L). Si evidenzia che anche questo semplice compito ha molte componenti che consentono una corretta esecuzione del movimento per raggiungere un obiettivo.

Figure 1
Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Schemi della camera comportamentale. Una camera realizzata con foglio acrilico avente le seguenti dimensioni in cm: 18,5 (h) x 8,5 (l) x 20 (p) con una finestra frontale 1 (l) x 5 (a) e un piccolo ripiano 8,5 (l) x 4 (p). (B) Fotografia della cannula LED (a sinistra) e del ricevitore wireless (a destra). (C) Vista laterale di un mouse con la cannula LED impiantata collegata al ricevitore durante l'esecuzione dell'attività reach-to-grasp (la punta di freccia bianca mostra il ricevitore, l'asterisco mostra il cemento dentale che tiene la cannula e la punta di freccia vuota mostra il pellet). (D) Schizzo dell'allestimento sperimentale. Due telecamere ad alta velocità registrano la portata in due dimensioni, mentre una terza ha raccolto una vista panoramica del compito, compresa la posizione del mouse dallo specchio sotto la camera. Gli animali erano liberi di scegliere la loro zampa preferita e i lati di stimolazione si riferiscono sempre al lato della zampa preferita. (E) La posizione esatta delle telecamere e l'immagine rappresentativa di ciascuna telecamera durante una prova. Questa cifra è stata adattata dal riferimento23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi cinematica del comportamento di raggiungimento. (A) Cronologia dell'esperimento dal giorno-0 (d0) al giorno-25 (d25). (B) Prestazioni durante l'attività reach-to-grasp nel tempo misurate come precisione di recupero del pellet (numero totale di prese riuscite/numero totale di prove x 100). (C) Esempio di tracciamento della traiettoria da un video ad alta velocità. (D) Traiettorie individuali della zampa durante le prove colpite e mancate. (E) Distanza totale percorsa dalla zampa durante le prove colpite e mancate. (F) Accelerazione della zampa attraverso la traiettoria nelle prove colpite e mancate tracciate come distanza vs. velocità. (G) Riepilogo della distanza degli end-point in hit = 3,16 mm, manca 6,08 mm (test mann-Whitney-Wilcoxonmancato vs. hit U = 4184, p<0,0001, n = 28 topi). (H) Differenze nell'angolo del corpo nei due tipi di prove, mancati = 8,4±5,3°, colpi 6,7±4° (test Mann-Whitney-Wilcoxon U = 6437, P = 0,0243, n = 28 topi). (I) Schemi dei tre tipi di errori. (J) Proporzioni dei tre tipi di errori commessi dai topi in condizioni di controllo. Questa cifra è stata adattata dal riferimento23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Attivazione optogenetica di SPN D1 controlaterali e ipsilaterali durante il comportamento reach-to-grasp. (A) Schemi del paradigma di stimolazione. (B) Tasso di successo rispetto agli studi di non stimolazione. (C) Variazione della distanza percorsa rispetto alle condizioni di controllo. (D), (G) Grafici bidimensionali di percorsi fatti dalla zampa con e senza stimolazione optogenetica. E) , (H) Distanza totale percorsa dalla zampa durante i movimenti di raggiungimento. F) , (I) Sintesi delle distribuzioni dei diversi tipi di errori. D1 controlaterale: errore iniziale o tipo I (controllo = 18,2±11,6 %, stimolazione = 79,9±8,2 % test esatto di Fisher, p<0,0001). (J) Esempio di analisi PCA delle traiettorie in condizioni di controllo rispetto all'attivazione controlaterale di D1SPN. L'area ombreggiata rappresenta l'ammasso di ogni condizione e la stella è il centroide dell'ammasso. (K) Sintesi della sovrapposizione tra cluster delle diverse condizioni sperimentali. (L) Cambiamenti nell'angolo del corpo. Questa cifra è stata modificata dal riferimento23. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L'uso della manipolazione optogenetica delle popolazioni neuronali in paradigmi comportamentali ben definiti sta facendo progredire le nostre conoscenze sui meccanismi alla base del controllo motorio 7,23. I metodi wireless sono particolarmente adatti per compiti che richiedono test su più animali o la libera circolazione34,35. Tuttavia, poiché le tecniche e i dispositivi sono perfezionati, dovrebbe essere l'opzione di riferimento per qualsiasi attività comportamentale combinata con l'optogenetica34,36.

Il metodo attuale presenta molti vantaggi perché i LED miniaturizzati forniscono una fonte di luce affidabile ad alta intensità e gli impianti possono essere utilizzati in studi che richiedono una stimolazione per diversi giorni. Tuttavia, l'inserimento di una fibra ottica per la stimolazione dell'opsina può danneggiare meccanicamente il tessuto cerebrale, causare infezioni e occasionalmente infiammazione nella posizione della canula37. È stato dimostrato che la stimolazione optogenetica ad alta frequenza di lunga durata produce calore e potrebbe causare fototossilità37. È possibile ridurre la fototossicità utilizzando opsine effettori spostate verso il rosso che vengono attivate con luce rossa o anche nel vicino infrarosso, il che riduce la generazione di calore38.

Inoltre, poiché i perni per collegare il ricevitore rimangono all'esterno del cranio, a volte i topi possono causare spostamento o distacco della cannula se il cemento dentale non viene applicato correttamente; questo spesso porta a danni al tessuto cerebrale e diminuisce il numero di soggetti da prendere in considerazione per ulteriori analisi. Recenti sviluppi hanno introdotto l'optogenetica senza fibre, che utilizza particelle che possono emettere luce visibile attraverso la luminescenza di up-conversion in risposta alla luce del vicino infrarosso che penetra in profondità nel tessuto cerebrale36. I dispositivi senza fibre offrono l'opportunità di stimolare optogeneticamente su intervalli di tempo più lunghi in animali che si comportano liberamente con impianti impercettibili35. Ciò consente un movimento sfrenato anche nei labirinti d'acqua, di avere più animali alloggiati insieme (per evitare l'impatto dell'isolamento sociale) e di studiare gli animali in contesti più naturalistici35,36.

Anche con tutti i vantaggi offerti dall'optogenetica senza fibre, deve ancora affrontare sfide di biocompatibilità e generazione di calore. Anche l'efficienza della conversione dei fotoni lo limita. Infine, è necessario un ulteriore miglioramento per un'elevata efficienza delle emissioni34,36.

La combinazione di questo paradigma con la videografia ad alta velocità consente l'analisi cinematica in diverse condizioni sperimentali. Ciò offre un rilevamento sensibile di effetti anche sottili su componenti distinti del comportamento e del controllo motorio. Man mano che si sviluppano più strumenti analitici, è possibile avere un'analisi cinematica online e una caratterizzazione approfondita del comportamento motorio in diversi contesti. Una quantificazione approfondita della cinematica del movimento di raggiungimento del topo è stata recentemente pubblicata da Becker et al.25.

La possibilità di manipolare selettivamente popolazioni neuronali in animali che si muovono liberamente con tecniche minimamente invasive consente di sezionare il contributo di specifici tipi neuronali in precisi compiti comportamentali23. Il compito reach-to-grasp è un paradigma traducibile per il comportamento motorio13,19. È noto che le strutture cerebrali conservate partecipano alle diverse fasi di acquisizione, apprendimento e esecuzione del compito 7,12,23. Rivelare i circuiti neurali che sono alla base di questo comportamento aumenterà la comprensione del controllo motorio. Diversi studi evidenziano l'importanza del controllo bi-emisferico sui compiti unimanuali, specialmente quando è necessaria un'elevata destrezza 20,21,22. L'analisi cinematica combinata con le manipolazioni optogenetiche consente di indagare i diversi meccanismi di questo comportamento complesso. Potrebbe aiutare ad analizzare il contributo del feedback senso-motorio in condizioni normali e modelli di malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non dichiarano alcuna divulgazione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto UNAM-PAPIIT IA203520. Ringraziamo la struttura per animali IFC per il loro aiuto nella manutenzione delle colonie di topi e l'unità computazionale per il supporto IT, in particolare a Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738 (2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720 (2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41 (2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742 (2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651 (2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238 (2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834 (2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961 (2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

Tags

Neuroscienze Numero 177
<em>In vivo</em> Controllo optogenetico wireless del comportamento motorio qualificato
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O.,… More

Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter