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Neuroscience

In vivo Contrôle optogénétique sans fil du comportement moteur qualifié

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63082
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Le présent protocole décrit comment utiliser l’optogénétique sans fil combinée à la vidéographie à grande vitesse dans une seule tâche de portée à la saisie de pastilles pour caractériser les circuits neuronaux impliqués dans la performance du comportement moteur qualifié chez les souris en mouvement libre.

Abstract

La motricité fine est essentielle dans la vie quotidienne et peut être compromise dans plusieurs troubles du système nerveux. L’acquisition et l’exécution de ces tâches nécessitent une intégration sensori-motrice et impliquent un contrôle précis des circuits cérébraux bilatéraux. La mise en œuvre de paradigmes comportementaux unimanuels dans des modèles animaux améliorera la compréhension de la contribution des structures cérébrales, comme le striatum, au comportement moteur complexe, car elle permet la manipulation et l’enregistrement de l’activité neuronale de noyaux spécifiques dans des conditions de contrôle et de maladie pendant l’exécution de la tâche.

Depuis sa création, l’optogénétique a été un outil dominant pour interroger le cerveau en permettant une activation ou une inhibition sélective et ciblée des populations neuronales. La combinaison de l’optogénétique avec des tests comportementaux met en lumière les mécanismes sous-jacents de fonctions cérébrales spécifiques. Les systèmes sans fil montés sur la tête avec diodes électroluminescentes miniaturisées (LED) permettent un contrôle optogénétique à distance chez un animal entièrement en mouvement libre. Cela évite qu’un système câblé ne soit moins restrictif pour le comportement des animaux sans compromettre l’efficacité de l’émission de lumière. Le protocole actuel combine une approche optogénétique sans fil avec une vidéographie à grande vitesse dans une tâche de dextérité unimanuelle pour disséquer la contribution de populations neuronales spécifiques au comportement moteur fin.

Introduction

Le comportement habileté motrice est présent lors de la plupart des mouvements effectués par nous, et il est connu pour être affecté dans plusieurs troubles cérébraux 1,2,3,4,5,6. La mise en œuvre de tâches permettant d’étudier le développement, l’apprentissage et l’exécution de mouvements qualifiés est cruciale pour comprendre les fondements neurobiologiques de la fonction motrice, en particulier dans les modèles de lésions cérébrales, de troubles neurodégénératifs et neurodéveloppementaux 2,7,8,9,10,11,12,13 . Atteindre et récupérer des objets se fait régulièrement dans les actions de la vie quotidienne, et c’est l’une des premières habiletés motrices acquises au début du développement, puis affinées au cours des années 5,6. Il comprend un comportement complexe qui nécessite des processus sensori-moteurs tels que la perception des caractéristiques de l’objet, la planification du mouvement, la sélection de l’action, l’exécution du mouvement, la coordination du corps et la modulation de la vitesse 7,14,15,16. Ainsi, les tâches de haute dextérité unimanuelle nécessitent la participation de nombreuses structures cérébrales des deux hémisphères 16,17,18,19,20,21,22. Chez la souris, la tâche d’atteinte à la saisie d’une seule pastille est caractérisée par plusieurs phases qui peuvent être contrôlées et analysées séparément 7,13,23. Cette fonctionnalité permet d’étudier la contribution de sous-populations neuronales spécifiques à différents stades d’acquisition et de performance comportementale et fournit une plate-forme pour des études détaillées des systèmes moteurs 13,23,24. Le mouvement se produit en quelques secondes; ainsi, la vidéographie à grande vitesse devrait être utilisée pour l’analyse cinématique à des étapes distinctes de la trajectoire motrice qualifiée 7,25. Plusieurs paramètres peuvent être extraits des vidéos, notamment la posture du corps, la trajectoire, la vitesse et le type d’erreurs25. L’analyse cinématique peut être utilisée pour détecter des changements subtils lors de la manipulation optogénétique sans fil 7,23.

L’utilisation de diodes électroluminescentes (LED) miniaturisées pour fournir de la lumière via un système sans fil monté sur la tête permet d’avoir un contrôle optogénétique à distance pendant que l’animal effectue la tâche. Le contrôleur optogénétique sans fil accepte les commandes à impulsion unique ou à déclenchement continu d’un stimulateur et envoie des signaux infrarouges (IR) à un récepteur connecté à la LED miniaturisée23,26. Le protocole actuel combine cette approche optogénétique sans fil avec la vidéographie à grande vitesse d’une tâche de dextérité pour disséquer le rôle de populations neuronales spécifiques lors de la performance du comportement moteur fin23. Comme il s’agit d’une tâche unimanale, elle permet d’évaluer la participation des structures dans les deux hémisphères. Traditionnellement, le cerveau contrôle le mouvement du corps d’une manière très asymétrique; cependant, les tâches de haute dextérité nécessitent une coordination et un contrôle minutieux de nombreuses structures cérébrales, y compris les noyaux ipsilatérals et la contribution différentielle des sous-populations neuronales dans les noyaux 10,20,21,22,23. Ce protocole montre que les structures sous-corticales des deux hémisphères contrôlent la trajectoire du membre antérieur23. Ce paradigme peut convenir à l’étude d’autres régions du cerveau et de modèles de maladies cérébrales.

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Protocol

Les procédures impliquant l’utilisation d’animaux ont été menées conformément aux directives locales et nationales et approuvées par le comité institutionnel correspondant pour les soins et l’utilisation des animaux (protocole VLH151-19 de l’Institut de physiologie cellulaire IACUC). Des souris mâles transgéniques Drd1-Cre27, 35-40 jours postnatales avec C57BL/6 de fond ont été utilisées dans le protocole actuel. Les souris ont été gardées dans les conditions suivantes: température 22±1 ° C; humidité 55%; horaire de lumière 12/12 h avec lumières éteintes à 19 h et ont été sevrés au jour postnatal 21. Les chiots sevrés étaient logés dans des groupes de même sexe de 2 à 5 personnes. Les animaux étaient logés dans des logements statiques avec des sommets à micro-barrières. La literie était composée de copeaux de tremble stériles. Des granulés de rongeurs et de l’eau purifiée par OI ont été fournis ad libitum, sauf indication contraire.

1. Interventions chirurgicales

  1. Préparer une canule LED à la longueur souhaitée selon les coordonnées dorsoventrales de la structure d’intérêt (idéalement 0,5 mm de plus pour tenir compte de l’épaisseur du crâne, pour le striatum dorsolatéral 3,5 mm) (Figure 1).
    1. Coupez la fibre de verre à une longueur supérieure à la taille finale souhaitée, broyez la pointe de la fibre à la longueur cible avec du papier de verre rugueux et, enfin, polissez la pointe de fibre avec du papier de verre fin.
      REMARQUE: La canule LED est une fibre optique en verre de 250 μm de diamètre fixée à un récepteur infrarouge (voir tableau des matériaux).
  2. Tirez des pipettes en verre (1,14 mm de diamètre extérieur, 0,53 mm de diamètre intérieur et 3,5 de longueur) pour le nano-injecteur avec un extracteur horizontal (voir tableau des matériaux) et stockez-les pour plus tard. Programmez l’extracteur en une boucle pour obtenir un diamètre de pointe de 15-20 μm avec une longue pente progressive (4-5 mm).
  3. Préparez la zone chirurgicale en désinfectant soigneusement l’appareil stéréotaxique, la hotte, le micro-injecteur (voir tableau des matériaux) et les surfaces environnantes avec de l’éthanol à 70%.
    REMARQUE: Un appareil stéréotaxique de souris est essentiel pour injecter Adeno Associated Virus (AAV) avec précision et placer la canule LED dans la région d’intérêt.
  4. Portez l’équipement de protection individuelle approprié pour la procédure, y compris une blouse de laboratoire propre ou une blouse chirurgicale jetable, des gants stériles, un masque facial et un bonnet de tête jetable.
  5. Placez l’équipement nécessaire près de la zone de chirurgie, comme des outils chirurgicaux stériles, des embouts en coton, des solutions, une micropipette, des embouts de pipette, des capillaires, un micro-remplissage avec de l’huile minérale et un marqueur.
  6. Remplissez une pipette pour les microinjections avec de l’huile minérale et placez-la dans le micro-injecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur fonctionne correctement en éjectant de l’huile minérale.
    REMARQUE: Tous les instruments utilisés pendant la chirurgie doivent être autoclavés et stériles. Une technique aseptique doit être utilisée.
  7. Anesthésier les animaux avec de l’isoflurane gazeux 4-5% pour induire l’anesthésie et 1,2% tout au long de la chirurgie avec 0,5-1 L / min d’oxygène pur. La chirurgie ne commence qu’après que l’animal a atteint un point d’anesthésie profonde, évalué par l’absence de retrait de la patte après un léger pincement.
    1. Surveillez en permanence la fréquence respiratoire et la température de l’animal. Maintenir la température corporelle par un coussin chauffant réglé à 34 °C.
  8. Appliquez une pommade ophtalmique. Enlevez les poils du cuir chevelu avec un coupe-cheveux et une crème dépilatoire. Essuyez le cuir chevelu avec des cotons-tiges contenant 8% de povidone-iode (voir tableau des matériaux) et 70% d’éthanol alternés trois fois chacun.
  9. Placez la souris dans l’appareil stéréotaxique et fixez la tête, en veillant à ce que le crâne soit nivelé dans les axes médiolatéral et antérieur-postérieur.
  10. Faites une incision de 1 cm avec un scalpel à travers le cuir chevelu au niveau des yeux le long de l’axe sagittal. Rétractez la peau pour exposer le crâne et nettoyez le périoste avec des cotons-tiges.
  11. Nettoyez la surface du crâne avec une solution saline et des cotons-tiges stériles. Résolvez tout saignement à la surface à l’aide de lances oculaires absorbantes stériles (voir tableau des matériaux) ou d’un matériau absorbant stérile similaire.
  12. Appliquez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 2,5% avec un coton-tige et laissez-le agir pendant quelques secondes pour rendre les sutures du crâne visibles et avoir une meilleure référence. Après quelques secondes, nettoyez soigneusement avec un coton-tige propre.
  13. Avec la pipette en verre (diamètre final de la pointe de 15 μm), localisez bregma et lambda pour vérifier que le crâne est nivelé dans l’axe antérieur-postérieur.
    REMARQUE: Il est recommandé d’avoir un microscope stéréoscopique ou un microscope USB pour voir la pointe de la pipette en verre. Au cas où cela serait nécessaire, ajustez la hauteur du porte-bouche pour niveler le crâne.
  14. Déplacer le capillaire vers les coordonnées antérieures-postérieures (AP) et médiales-latérales (ML) sélectionnées (striatum dorsolatéral AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Peignez un point de référence dans le cuir chevelu au-dessus des coordonnées sélectionnées avec un marqueur stérile.
  15. Au point de référence, effectuez une craniotomie d’environ 1 mm de diamètre en appliquant une légère pression sur le crâne avec un outil rotatif stérile ou une perceuse dentaire à une vitesse faible à moyenne avec un petit foret dentaire rond (voir Tableau des matériaux).
  16. Charger le capillaire avec 300-400 nL de virus adéno-associé (AAV) dépendant de la Cre, tel que AAV1-dflox-hChR-2-mCherry pour exprimer la Channelrhodopsine ou un AAV pour exprimer uniquement la protéine rapporteure (par exemple, mCherry) comme témoin dans la région d’intérêt (voir tableau des matériaux). Vérifiez que la pointe n’est pas bouchée, puis introduisez la pipette en verre dans le cerveau aux coordonnées dorso-ventrales (DV) souhaitées (striatum dorsolatéral DV -3,35 mm).
    1. Injecter 200 nL à l’aide d’un injecteur automatique à une vitesse de 23 nL/s. Attendez 10 minutes après avoir terminé l’injection, retirez lentement la pipette en verre pour éviter tout déversement.
      REMARQUE: Il est possible d’utiliser une aiguille de 30 G pour injecter avec le micro-injecteur approprié.
  17. Nettoyez et séchez tous les résidus avec des cotons-tiges.
  18. Fixez la canule LED en verre stérile au bras stéréotaxique et calibrez les coordonnées en utilisant bregma comme référence. Insérez la canule très lentement (300 μm/min) pour éviter les lésions tissulaires et placez-la à 100 μm au-dessus du site d’injection.
  19. Une fois la canule LED en place, ajoutez une goutte (100 μL) d’adhésif tissulaire au bord de la craniotomie.
  20. Préparez un mélange de ciment dentaire (voir la table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant pour fixer la fibre au crâne.
    REMARQUE: En bref, utilisez un plat en porcelaine réfrigérée pour avoir plus de temps de travail avant les ensembles de ciment. Ajouter 2 cuillères de poudre transparente de résine au plat en porcelaine, ajouter 4 gouttes de base rapide et 1 goutte de catalyseur, puis bien mélanger. Le rapport poudre/liquide peut être ajusté si une viscosité plus mince ou plus épaisse est nécessaire.
  21. À l’aide d’une brosse stérile, appliquez le mélange de ciment dentaire autour du connecteur de la canule petit à petit, en construisant des couches jusqu’à ce que le crâne soit recouvert et que le connecteur soit solidement attaché au crâne, laissant les broches complètement libres. Évitez d’obtenir du ciment dentaire sur la peau de la souris.
  22. Laisser sécher complètement.
  23. Fermez la peau autour de l’implant à l’aide d’un adhésif tissulaire (voir tableau des matériaux).
  24. Placer la souris dans une cage de récupération au-dessus d’un coussin chauffant à 33 ° C. Surveiller la présence d’un ou de plusieurs des signes suivants de douleur / inconfort: 1) Penché, manque ou réduction de l’activité motrice, 2) Défaut de toilettage reflété dans un pelage sale non entretenu, 3) Léchage ou grattage excessif, rougeur dans le site d’incision, 4) comportement agressif, 5) anorexie ou déshydratation, et 6) manque de formation de nid.
    REMARQUE: Gardez la souris individuellement en cage pendant toutes les procédures pour éviter le détachement de l’implant. En cas de détachement de la canule, effectuer l’euthanasie en injectant 150 mg/kg de pentobarbital de sodium suivi d’une décapitation après une anesthésie profonde.
  25. Injecter par voie sous-cutanée (SC) du méloxicam 1 mg/kg une fois par jour pendant trois jours après la chirurgie pour fournir une analgésie.
  26. Attendez au moins 7 jours pour la récupération complète et 14 jours pour l’expression de l’opsine avant d’autres procédures.
    REMARQUE: Effectuez un suivi postopératoire toutes les 12 heures pendant trois jours, puis vérifiez les animaux tous les jours jusqu’au jour de l’euthanasie à la fin de l’expérience.

2. Formation reach-to-grasp

  1. Le jour 7 après la chirurgie, commencez le protocole de privation de nourriture28. Pesez les souris pendant trois jours consécutifs pour déterminer leur poids corporel moyen ad libitum. Ensuite, planifiez des restrictions alimentaires afin que les animaux reçoivent suffisamment de nutriments pour maintenir environ 90% et au moins 85% du poids corporel.
    REMARQUE: Ceci est réalisé en fournissant 2,5-3 g de nourriture par jour. Surveillez quotidiennement le poids des animaux et notez leur bien-être général en observant le comportement et l’apparence des animaux, par exemple l’apparence du pelage et des yeux. Utilisez le système de notation de l’état corporel de la référence29.
  2. Pendant les périodes de pré-formation, d’entraînement et de test, fournissez à chaque souris 20 pastilles (20 mg de granulés sans poussière aromatisés au chocolat) par jour (voir la table des matériaux) (consommées pendant la tâche ou après) en plus des granulés alimentaires standard.
  3. Trois jours avant l’accoutumance, dispersez 0,4 g / animal / jour 20 mg de granulés sans poussière aromatisés au chocolat dans leurs cages domestiques, afin que les souris se familiarisent avec les granulés qui servent de récompense pendant la tâche de portée à saisir.
  4. Habituez les souris en les plaçant 10 minutes dans la chambre d’essai un jour avant le pré-entraînement avec des granulés dispersés sur le sol de la chambre (Figure 1A).
  5. Laissez la nourriture tous les jours après l’entraînement et les tests. Gardez un horaire similaire tous les jours.
  6. Le premier jour de pré-entraînement, placez les souris dans la chambre de portée à saisir et observez de face. Placez les granulés devant la chambre près de l’ouverture afin qu’ils commencent à consommer les granulés. À ce stade, les souris sont autorisées à saisir les granulés sous n’importe quelle forme.
  7. Le deuxième jour du pré-entraînement, placez les granulés de plus en plus loin de l’ouverture jusqu’à ce qu’ils atteignent l’indentation (à 1 cm de l’ouverture) afin que les souris puissent façonner leur mouvement de portée à saisir (Figure 1C).
  8. Entraînez les souris à courir à l’arrière de la cage et retournez à l’ouverture de la cage pour recevoir le prochain granulé de nourriture comme stratégie pour individualiser les essais.
    REMARQUE: Cela peut être réalisé en attendant que la souris soit à l’arrière de la cage avant de placer une pastille dans l’indentation pour chaque essai.
  9. Placez les granulés à saisir par leur patte droite ou gauche.
    REMARQUE: Les souris commencent à utiliser de préférence une patte à saisir, qui sera utilisée les jours suivants d’entraînement et de test.
  10. Entraînez les animaux pendant 6 jours en séances quotidiennes d’une durée de 20 essais ou jusqu’à ce qu’un maximum de 10 minutes s’écoule. À partir du jour 2 de la formation, mettez le récepteur simulé (dimensions 12 x 18 x 7 mm, 1 g, voir Tableau des matériaux), afin que les souris s’habituent au poids pendant l’exécution de la tâche (Figure 1B). Chaque jour, notez le nombre d’essais réussis et manqués.
  11. Enregistrez le comportement avec une caméra ordinaire et capturez 30 à 60 images / s de l’avant de la chambre. De plus, on peut placer un miroir sous la chambre d’entraînement à un angle de 45° pour surveiller la posture des animaux (Figure 1D,E).
  12. Pour l’analyse cinématique post-hoc (Figure 2), montez une caméra haute vitesse (voir Tableau des matériaux) à un angle de 45° pour enregistrer depuis le côté de la cage. Si une analyse 3D est nécessaire, placez une deuxième caméra haute vitesse pour enregistrer à un angle de 35° par rapport à l’avant de la chambre; les deux caméras doivent être placées dans le côté droit ou gauche de la cage en fonction de la face des animaux et doivent capturer à la même fréquence d’images et être synchronisées7 (Figure 3D, E).
  13. Réglez les caméras haute vitesse sur 100 images/s avec une résolution de 376 x 252 pixels ou plus si possible. Placez des parois en polystyrène blanc derrière les côtés et l’arrière de la chambre pour réduire l’arrière-plan et augmenter le contraste (Figure 1E).
  14. Le jour du test, remplacez l’unité simulée par un récepteur infrarouge pour la stimulation optogénétique sans fil (Figure 1B, C).
  15. Lorsque les souris commencent à atteindre, tournez la canule LED manuellement avec la télécommande pour avoir une stimulation continue pendant le temps que le comportement est effectué et pas plus de 2 s. La programmation d’un paradigme de stimulation automatique est préférable. Le dispositif de stimulation déclenche une LED de 470 nm (lumière bleue) avec une intensité à la pointe de 1,0 mW/mm2.
  16. Recueillez les vidéos pour un examen plus approfondi, y compris la notation et l’analyse cinématique.

3. Confirmation histologique post-hoc

  1. À la fin d’une expérience, confirmez l’expression virale et la mise en place de la canule LED. Anesthésier l’animal avec un cocktail de kétamine 100 mg/kg et de xylazine 10 mg/kg. Une fois que la souris présente des signes d’anesthésie profonde (étape 1.7), perfuser avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée suivie de 4% de PFA.
  2. Retirez soigneusement la canule implantée en saisissant fermement le connecteur avec une pince et en tirant doucement vers le haut.
  3. Extraire et post-fixer le cerveau pendant 24 h dans 4% PFA23.
  4. Effectuez des lavages de 3 à 10 minutes avec PBS.
  5. Coupez le cerveau en sections de 50 μm à l’aide d’un microtome (voir Tableau des matériaux).
  6. Montez les sections dans des diapositives avec des supports de montage rigides avec DAPI pour tacher les noyaux et couvrir les diapositives.
  7. Après séchage, observez les sections au microscope confocal et vérifiez l’emplacement de la canule implantée et l’expression de Ch2R fusionnée avec n’importe quelle protéine fluorescente.

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Representative Results

La tâche de portée à saisir est un paradigme largement utilisé pour étudier la mise en forme, l’apprentissage, la performance et la cinématique du mouvement des compétences fines sous différentes manipulations expérimentales. Les souris apprennent à exécuter la tâche en quelques jours et atteignent une précision de plus de 55% atteignant un plateau après 5 jours d’entraînement (Figure 2A, B). À l’instar de ce qui a été signalé précédemment, un pourcentage d’animaux n’accomplissent pas la tâche de manière appropriée (29,62 %), et ceux-ci devraient être exclus de l’analyse plus approfondie30. Il s’agit notamment d’un sous-ensemble de souris non apprenantes (6/54 souris, 11,1%) qui, dès le début de l’entraînement, ratent la cible en visant trop loin de la pastille ou effectuent le mouvement de préhension avant d’être dans la bonne position sur la pastille. Au cours des premiers jours d’entraînement, un autre groupe a effectué la tâche avec une grande précision, mais a commencé à mal performer en visant trop loin de la pastille au jour 3-4 (10/54 souris, 18,51%). Au sein de ce groupe, certaines souris commencent à s’entraîner en utilisant une patte préférée, mais changent de préférence après quelques jours; cela a déjà été discuté par Chen et al., 201430.

Le mouvement de la portée à la saisie est très stéréotypé d’un essai à l’autre et chez les animaux (Figure 2). L’utilisation de la vidéographie à grande vitesse permet de suivre la trajectoire des mouvements permettant d’analyser la cinématique à différentes phases de la condition de contrôle et lors de la stimulation optogénétique (Figure 1E et Figure 2C). Cette approximation donne lieu à une évaluation quantifiable de paramètres tels que la distance parcourue, la vitesse, l’accélération, le point final et la trajectoire (Figure 2 C-E). Il est possible d’analyser à la fois les essais à portée multiple, où la souris atteint plusieurs fois avant de récupérer la pastille, et les événements à essai unique, où la souris récupère la pastille en un seul mouvement de portée. L’essai est terminé lorsque les animaux repoussent la pastille ou le relancent en se rendant à l’arrière de la cage. Une comparaison quantitative des trajectoires dans différentes conditions expérimentales est réalisée avec l’analyse en composantes principales (APC) suivie d’un regroupement des k-moyennes (Figure 3J-K)23,25.

Pendant la plupart des séances d’entraînement, les souris ne parviennent parfois pas à saisir la pastille (essais manqués). Certaines manipulations modifient le nombre d’essais manqués et donc la précision de la tâche. Ensuite, il est essentiel d’analyser les différences entre les essais réussis et manqués. Dans nos mains, les essais manqués résultent de changements dans trois phases distinctes du mouvement: (1) la patte modifie sa trajectoire avant de traverser l’ouverture de la chambre (erreur initiale), (2) la patte modifie sa trajectoire après que la patte a traversé l’ouverture (erreur finale), et (3) l’échec de la collecte de la pastille (erreur de préhension) (Figure 2 I, J)13 . Une caractéristique générale des essais manqués est que les souris commencent le mouvement de préhension plus loin de la pastille (point final) par rapport aux essais frappés (Figure 2G). De plus, les ratés associés à la posture de la souris sont mesurés sous forme de différences significatives d’angle corporel entre les essais frappés et manqués (Figure 2H).

Selon la structure ou la population neuronale ciblée par l’optogénétique, on peut s’attendre à des effets différentiels sur le comportement 7,19,23,31,32,33. Le protocole actuel décrit l’impact de l’activation des neurones à projection épineuse (SPN) dans le striatum dans les hémisphères controlatéral ou ipsilatéral autour de la patte préférée utilisée par la souris pendant le mouvement d’atteinte (Figure 3). L’activation controlatérale des SPN exprimant la dopamine D1, qui donnent naissance à la voie directe des noyaux gris centraux, a réduit le succès de préhension à 64,9±8,8% par rapport aux conditions de contrôle (Figure 3B). L’analyse cinématique révèle que lors de la stimulation optogénétique, la trajectoire de la patte a décrit un schéma oscillatoire, montré par une augmentation de la distance parcourue à 218,4±19,2% du contrôle, conduisant à l’incapacité de cibler la pastille et à une augmentation de l’erreur initiale de type I (Figure 3F). L’analyse PCA montre que les trajectoires de tous les essais au cours de l’activation des PAN D1 controlatérals se sont séparées en un groupe avec presque aucun chevauchement avec un groupe témoin, ce qui indique une faible similitude (Figure 3J-K).

D’autre part, l’activation des dSPN du côté ipsilatéral entraîne une augmentation de la dispersion de trajectoire montrée par l’analyse PCA (Figure 3K) sans affecter le succès (120,7±23,6%, n = 4), la distance totale parcourue (136,3±35,5%), ou la vitesse maximale pendant la phase d’atteinte (117,3±10,3%) (Figure 3C), indiquant que l’activation des SPN ipsilatéral d’origine D1 a modifié dans une certaine mesure la trajectoire d’atteinte sans modifier le résultat comportemental (Figure 3G-I ). L’analyse cinématique indique des changements subtils dans le contrôle des mouvements par manipulation ipsilatérale. Enfin, l’analyse de la posture corporelle montre un changement d’angle corporel lors de l’activation controlatérale des D1SPN (Figure 3L). Il est souligné que même cette tâche simple comporte de nombreux composants qui permettent une exécution correcte du mouvement pour atteindre un objectif.

Figure 1
Figure 1 : Configuration expérimentale. (A) Schémas de la chambre comportementale. Une chambre en feuille acrylique ayant les dimensions suivantes en cm : 18,5 (h) x 8,5 (l) x 20 (d) avec une fenêtre avant de 1 (l) x 5 (h) et une petite étagère de 8,5 (l) x 4 (d). (B) Photographie de la canule LED (à gauche) et du récepteur sans fil (à droite). (C) Vue latérale d’une souris avec la canule LED implantée connectée au récepteur pendant l’exécution de la tâche de portée à la saisie (la pointe de flèche blanche montre le récepteur, l’astérisque montre le ciment dentaire tenant la canule et la pointe de flèche vide montre la pastille). (D) Esquisse de la configuration expérimentale. Deux caméras haute vitesse enregistrent la portée en deux dimensions, tandis qu’une troisième recueille une vue panoramique de la tâche, y compris l’emplacement de la souris depuis le miroir sous la chambre. Les animaux étaient libres de choisir leur patte préférée, et les côtés de stimulation se réfèrent toujours au côté de la patte préférée. (E) La position exacte des caméras et l’image représentative de chaque caméra pendant un essai. Ce chiffre a été adapté de la référence23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse cinématique du comportement d’atteinte. (A) Chronologie de l’expérience du jour 0 (d0) au jour 25 (d25). (B) Performance au cours de la tâche de portée à la saisie au fil du temps mesurée par la précision de récupération des granulés (nombre total de saisies réussies/nombre total d’essais x 100). (C) Exemple de suivi de trajectoire à partir d’une vidéo à grande vitesse. (D) Trajectoires individuelles de la patte pendant les essais frappés et manqués. (E) Distance totale parcourue par la patte pendant les essais frappés et manqués. (F) Accélération de la patte à travers la trajectoire dans les essais frappés et manqués tracés en tant que distance vs. vitesse. (G) Résumé de la distance des points d’extrémité dans les coups = 3,16 mm, manque 6,08 mm (test de Mann-Whitney-Wilcoxonmanqué vs hit U = 4184, p<0,0001, n = 28 souris). (H) Différences d’angle corporel dans les deux types d’essais, ratés = 8,4±5,3°, atteintes 6,7±4° (test de Mann-Whitney-Wilcoxon U = 6437, P = 0,0243, n = 28 souris). (I) Schémas des trois types d’erreurs. (J) Proportions des trois types d’erreurs commises par les souris dans les conditions de contrôle. Ce chiffre a été adapté de la référence23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Activation optogénétique des SPN D1 controlatéral et ipsilatéral pendant le comportement de portée à la compréhension. (A) Schémas du paradigme de stimulation. (B) Taux de réussite par rapport aux essais sans stimulation. (C) Variation de la distance parcourue par rapport aux conditions de contrôle. (D), (G) Tracés bidimensionnels des chemins effectués par la patte avec et sans stimulation optogénétique. (E) , (H) Distance totale parcourue par la patte lors des mouvements d’atteinte. (F) , (I) Résumé des distributions des différents types d’erreurs. D1 controlatéral: Erreur initiale ou type I (contrôle = 18,2±11,6 %, stimulation = 79,9 ±8,2 % Test exact de Fisher, p<0,0001). (J) Exemple d’analyse PCA des trajectoires dans des conditions de contrôle par rapport à l’activation controlatérale des D1SPN. La zone ombrée représente l’amas de chaque condition, et l’étoile est le centroïde de l’amas. (K) Résumé du chevauchement entre les grappes des différentes conditions expérimentales. (L) Changements dans l’angle du corps. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’utilisation de la manipulation optogénétique des populations neuronales dans des paradigmes comportementaux bien définis fait progresser nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents au contrôle moteur 7,23. Les méthodes sans fil sont particulièrement adaptées aux tâches qui nécessitent des tests sur plusieurs animaux ou la libre circulation34,35. Néanmoins, à mesure que les techniques et les dispositifs sont affinés, il devrait être l’option de prédilection pour toute tâche comportementale combinée à l’optogénétique34,36.

La méthode actuelle présente de nombreux avantages car les LED miniaturisées fournissent une source de lumière fiable à haute intensité, et les implants peuvent être utilisés dans des études nécessitant une stimulation sur plusieurs jours. Néanmoins, l’insertion d’une fibre optique pour la stimulation de l’opsine peut endommager mécaniquement le tissu cérébral, provoquer des infections et parfois une inflammation à l’emplacement de la canule37. Il a été démontré que la stimulation optogénétique à haute fréquence de longue durée produit de la chaleur et pourrait provoquer une phototoxité37. Il est possible de réduire la phototoxicité en utilisant des opsines effectrices décalées vers le rouge qui sont activées avec une lumière rouge ou même proche infrarouge, ce qui réduit la génération de chaleur38.

De plus, comme les broches pour connecter le récepteur restent à l’extérieur du crâne, les souris peuvent parfois provoquer un déplacement ou un détachement de la canule si le ciment dentaire n’est pas appliqué correctement; cela entraîne souvent des dommages au tissu cérébral et diminue le nombre de sujets à prendre en compte pour une analyse plus approfondie. Des développements récents ont introduit l’optogénétique sans fibres, qui utilise des particules capables d’émettre de la lumière visible par luminescence de conversion ascendante en réponse à la lumière proche infrarouge pénétrant profondément dans le tissu cérébral36. Les dispositifs sans fibres offrent la possibilité de stimuler optogénétiquement sur de plus longues périodes chez des animaux se comportant librement avec des implants imperceptibles35. Cela permet un mouvement sans retenue même dans les labyrinthes d’eau, d’avoir plusieurs animaux logés ensemble (pour éviter l’impact de l’isolement social) et d’étudier les animaux dans des contextes plus naturalistes35,36.

Même avec tous les avantages qu’offre l’optogénétique sans fibres, elle est toujours confrontée à des défis de biocompatibilité et de génération de chaleur. L’efficacité de la conversion des photons la limite également. Enfin, d’autres améliorations sont nécessaires pour atteindre un rendement élevé en matièred’émissions 34,36.

La combinaison de ce paradigme avec la vidéographie à grande vitesse permet une analyse cinématique dans différentes conditions expérimentales. Cela offre une détection sensible des effets même subtils sur des composants distincts du comportement et du contrôle moteur. Au fur et à mesure que de plus en plus d’outils analytiques se développent, il est possible d’avoir une analyse cinématique en ligne et une caractérisation approfondie du comportement moteur dans différents contextes. Une quantification approfondie de la cinématique du mouvement de la souris a été récemment publiée par Becker et al.25.

La possibilité de manipuler sélectivement des populations neuronales chez des animaux en mouvement libre avec des techniques mini-invasives permet de disséquer la contribution de types neuronaux spécifiques dans des tâches comportementales précises23. La tâche de portée à saisir est un paradigme traduisible pour le comportement moteur13,19. On sait que les structures cérébrales conservées participent aux différentes phases d’acquisition, d’apprentissage et d’exécution de la tâche 7,12,23. Révéler les circuits neuronaux qui sous-tendent ce comportement augmentera la compréhension du contrôle moteur. Plusieurs études soulignent l’importance du contrôle bi-hémisphérique sur les tâches unimanuelles, en particulier lorsqu’une dextérité élevée est nécessaire 20,21,22. L’analyse cinématique combinée à des manipulations optogénétiques permet d’étudier les différents mécanismes de ce comportement complexe. Il pourrait aider à analyser la contribution de la rétroaction sensori-motrice dans des conditions normales et des modèles de maladie.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucune divulgation.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le projet UNAM-PAPIIT IA203520. Nous remercions l’installation animale de l’IFC pour son aide à la maintenance des colonies de souris et l’unité de calcul pour le support informatique, en particulier à Francisco Perez-Eugenio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anaesthesia machine RWD R583S Isoflurane vaporizer
Anesket PiSA Ketamine
Breadboard Thorlabs MB3090/M Solid aluminum optical breadboard
Camera lense Canon 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system BrainVision MiCAM02 Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution PiSA Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber In house
Drill bit #105 Dremel 2 615 010 5AE Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets Bio-Serv F05301
Ethyl Alcohol J.T.  Baker 9000-02 Ethanol
Eyespears Ultracell 40400-8 Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso VetOne V1 502017-250 Isoflurane
Glass capillaries Drumond Scientific 3-000-203-G/X Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide Farmacom Antiseptic
High-speed camera BrainVision MiCAM02-CMOS Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter Teleopto
Insulin syringe
LED cannula Teleopto TelC-c-l-d LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL Eppendorf Z740436
Micro-pipette puller Sutter P-87 Horizontal puller
Microscope LSM780 Zeiss Confocal microscope
Microtome
Mock receiver Teleopto
NanoJect II Drumond Scientific 3-000-204 Micro injector
Oxygen tank Infra na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA Addgene 20297 Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde Sigma P-6148
Phosphate saline buffer Sigma P-4417 Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL ThermoFisher AM12635 0.5-10 uL  volume
Pisabental PiSA Sodium pentobarbital
Plexiglass commercial Acrylic sheet
Povidone iodine Farmacom Antiseptic
Procin PiSA Xylacine
Puralube Perrigo pharma 1228112 Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool Kmoon Mini grinder Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus Stoelting 51730D Digital apparatus
Super-Bond C&B Sun Medical Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line Gensat 036916-UCD Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive 3M Vetbond 1469SB
TPI Vibratome 1000 plus Peico Microtome
Vectashield mounting media with DAPI Vector laboratories H-1200 Mounting media
Wireless receiver Teleopto TELER-1-P

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References

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Neurosciences numéro 177
<em>In vivo</em> Contrôle optogénétique sans fil du comportement moteur qualifié
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Rodriguez-Munoz, D. L., Jaidar, O., Palomero-Rivero, M., Arias-Garcia, M. A., Arbuthnott, G. W., Lopez-Huerta, V. G. In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior. J. Vis. Exp. (177), e63082, doi:10.3791/63082 (2021).

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