Summary
Denne protokol beskriver nasal epitelcelleindsamling, ekspansion og differentiering til organotypiske luftvejsepitelcellemodeller og kvantificering af cilia-beatfrekvens via levende cellebilleddannelse og specialbyggede scripts.
Abstract
Målinger af ciliafunktion (slagfrekvens, mønster) er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom primær ciliær dyskinesi. Den bredere anvendelse af disse teknikker er imidlertid begrænset af den ekstreme modtagelighed af ciliær funktion for ændringer i miljøfaktorer, f.eks. temperatur, fugtighed og pH. I luftvejene hos patienter med cystisk fibrose (CF) forhindrer slimophobning ciliaslag. Cilian-funktion er blevet undersøgt i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) kanalaktivitet. Imidlertid er der fundet betydelig patient-til-patient-variation i cilia-slagfrekvens som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer . Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der er i øjeblikket ingen omfattende protokol, der demonstrerer prøveforberedelse af in vitro luftvejsmodeller, billedoptagelse og analyse af Cilia Beat Frequency (CBF). Standardiserede kulturforhold og billedoptagelse udført i en miljøkontrolleret tilstand ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF mellem individer og som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler. Denne protokol beskriver kvantificeringen af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer: 1) native epitelark, 2) luft-væske-grænseflademodeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) ekstracellulære matrixindlejrede tredimensionelle organoider. De to sidstnævnte replikerer in vivo lungefysiologi, med slå cilia og produktion af slim. Ciliary-funktionen optages ved hjælp af et højhastighedsvideokamera i et miljøstyret kammer. Specialbyggede scripts bruges til analyse af CBF. Oversættelse af CBF-målinger til klinikken er tænkt som et vigtigt klinisk værktøj til at forudsige respons på CFTR-modulerende lægemidler pr. patient.
Introduction
Målinger af Cilia Beat Frequency (CBF) og mønster er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom Primary Ciliary Dyskinesia (PCD)1. I cystisk fibrose (CF) forårsager dysfunktion af CF Transmembrane konduktansregulatoren (CFTR) chloridkanal dehydrering af luftvejsoverfladevæsken og nedsat mucociliær clearance2. Ciliaryfunktion er blevet undersøgt in vitro i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CFTR-kanalaktivitet3. Der er imidlertid betydelig variation mellem patienter i CBF som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer 3. Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der findes i øjeblikket ingen omfattende protokol, der viser prøveforberedelse af in vitro-luftvejsmodeller , billedoptagelse og analyse af CBF.
Næseepitelplader isoleret fra næseslimhindebørstninger anvendes direkte til målinger af ciliær funktion til PCD-diagnose4. Men selvom der ikke er nogen kontrol over størrelsen eller kvaliteten af de opnåede næseepitelark, varierer CBF afhængigt af, om det måles på enkeltceller eller celleark og på epitelark cilierede kanter, der er forstyrret eller uforstyrret5. Som sådan kan sekundære dyskinesier forårsaget af skader på celler under indsamling af næseslimhindebørstninger påvirke CBF. Primær cellekultur af nasale epitelceller og deres differentiering ved Air-Liquid Interface (ALI) eller i tredimensionel kældermembranmatrix i cilierede luftvejsepitelorganoider giver anledning til cilier, der er fri for sekundære dyskinesier 4,6,7,8. Luftvejsepitelceller differentieret ved ALI (fremover kaldet ALI-modeller) er blevet betragtet som et vigtigt sekundært diagnostisk hjælpemiddel, der replikerer ciliary beat-mønstre og hyppighed af ex vivo nasal slimhindebørstning6 og muliggør analyse af ciliær ultrastruktur, taktmønster og slagfrekvens, samtidig med at patientspecifikke defekter bevares9 . Alligevel findes der uoverensstemmelser i de metoder, der bruges til at skabe disse pseudostratificerede, mucociliære differentierede cellemodeller. Forskellige kulturudvidelses- eller differentieringsprotokoller kan inducere forskellige epitelfænotyper (cilierede eller sekretoriske)10 og resultere i signifikante forskelle i CBF11. CBF er blevet kvantificeret i næseepitelbørster 4,6,12,13,14,15,16, luftvejsepitelorganoider 14,17,18 og ALI modeller 3,4,6,13,19,20, 21. Men blandt disse protokoller er der store variationer, og ofte er der mange parametre, der ikke kontrolleres for. For eksempel er CBF i nogle undersøgelser afbildet in situ, mens cellerne i ALI-modellen forbliver på den permeable støtteindsats 3,19,20,21, mens andre skraber cellerne fra den permeable støtteindsats og afbilder dem suspenderet i medier 4,6,13.
Desuden er den bredere anvendelse af teknikker, der måler ciliær funktion, begrænset af ciliaryfunktionens ekstreme modtagelighed for ændringer i miljøfaktorer. Miljøfaktorer som temperatur22, fugtighed 23,24 og pH 25,26 påvirker ciliaryfunktionen og skal reguleres for at kvantificere CBF nøjagtigt. De forskellige fysiologiske parametre, der anvendes på tværs af forskellige laboratorier, og hvordan de påvirker CBF, er blevet gennemgået tidligere27.
Forskellige billeddannelsesteknologier og tilgange til CBF-målinger er rapporteret i litteraturen. Til PCD-diagnostik bruges videomikroskopi til at måle ciliær funktion28,29. For nylig blev en videoanalysealgoritme baseret på differentiel dynamisk mikroskopi brugt til at kvantificere både CBF- og cilia-koordinering i luftvejsepitelcelle ALI-modeller 3,30. Denne metode muliggør karakterisering af ciliary beating i luftvejsepitelceller på en hurtig og fuldautomatisk måde uden behov for at segmentere eller vælge regioner. Forskellige metoder til billeddannelse og kvantificering af CBF kan øge de forskelle, der er rapporteret i CBF i litteraturen (supplerende fil 1).
En protokol fra kultur til kvantificering for at strømline eksisterende metoder, standardisering af kulturforhold og billedoptagelse, udført under strenge miljøkontrollerede forhold, ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF inden for og mellem individer.
Denne protokol giver en komplet beskrivelse af samlingen af epitelceller, ekspansions- og differentieringskulturbetingelser og kvantificering af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer af nasal oprindelse: 1) native epitelark, 2) ALI-modeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) Extracellular Matrix (ECM) -indlejrede tredimensionelle organoider (figur 1 ). Nasale epitelceller opnået fra nasal inferior turbinat børstninger anvendes som repræsentanter for luftvejsepitellet, da de er en effektiv surrogat for bronchiale epitelceller31, mens de overvinder den invasive procedure forbundet med indsamling af bronchiale børstninger. CRC-metoden (Conditional Reprogramming Cell) bruges til at udvide primære luftvejsepitelceller til oprettelse af ALI-modeller og tredimensionelle organoider. Betinget omprogrammering af luftvejsepitelceller til en stamcellelignende tilstand induceres ved samkultur med væksthæmmet fibroblastfødecellesystem og Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer32. Det er vigtigt, at CRC-metoden øger populationsfordoblingen i luftvejsepitelceller, samtidig med at deres vævsspecifikke differentieringspotentiale bevares33,34. I alle luftvejsepitelcellemodeller fanges ciliaryfunktionen i et temperaturstyret kammer ved hjælp af et højhastighedsvideokamera med standardiserede billedoptagelsesindstillinger. Specialbyggede scripts anvendes til kvantificering af CBF.
Figur 1: Skematisk for arbejdsgang. Efter børstning af deltagernes nasale ringere turbinat, anvendes luftvejsepitelceller på en af to måder. Enten isoleres luftvejsepitelark, og cilia-beatfrekvensen afbildes straks, eller luftvejsepitelceller udvides via den betingede omprogrammeringscellemetode. CRC-ekspanderede luftvejsepitelceller differentieres for at etablere luftvejsepitelceller ved en luft-væske-grænseflade eller luftvejsepitelorganoidkulturer. Billeddannelse af ciliary beatfrekvens erhverves ved hjælp af et levende cellebilledmikroskop med et opvarmnings- og fugtighedsmiljøkammer og et videnskabeligt kamera med hurtig billedhastighed (>100Hz). Dataanalyse udføres ved hjælp af specialbyggede scripts. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsesgodkendelse blev modtaget fra Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Der blev indhentet skriftligt samtykke fra alle deltagere (eller deltagernes værge) forud for indsamlingen af biospecimens.
1. Forberedelser til etablering af luftvejsepitelcellemodeller
- Forbered næsecelleopsamlingsmedier ved at kombinere 80% Dulbeccos modificerede Eagle Medium og 20% Føtalt Bovin Serum. Suppler med 1 μL/ml penicillin/streptomycin. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
- Overtræk kolberne eller permeable støtteindsatser med kollagenopløsning efter behov ved at følge trin 1.2.1-1.2.4. Opbevar ikke kollagenbelagte kar på lang sigt.
- Der foretages en 1:100 fortynding af type I-kollagenopløsning (3 mg/ml lager) med fosfatbufferet saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 0,03 mg/ml. Bland godt.
- Cellekulturkolberne (sektion 4) belægges med 160 μL/cm 2 (dvs. 4 ml pr. T25-kolbe) og permeable støtteindsatser (sektion 5) med 455 μL/cm2 (dvs. 150 μL pr. 6,5 mm indsats) af den fremstillede kollagenopløsning.
- Inkuberes ved 37 °C i 2-24 timer.
- Kollagenopløsningen fjernes med pipette eller vakuumaspirator inden såning af celler. Vask ikke beholderen før såning af celler.
- Forbered CRC-medier (Conditional Reprogramming Cell) ved at kombinere komponenterne32 , der er anført i tabel 1. Filtersteriliser ved hjælp af et vakuumfiltersystem til flaske. Opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
- På brugsdagen tilsættes human epidermal vækstfaktor, ROCK-hæmmer og antibiotika som angivet i tabel 1.
| Komponent | Lydstyrke |
| DMEM, høj glukose | 156,7 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | 313,3 ml |
| Hydrocortison | 55,6 μL |
| Insulin | 1,25 ml |
| Kolera toksin | 21 μL |
| Adenin | 1,2 ml |
| HI-FBS | 25 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml |
| Menneskelig epidermal vækstfaktor | 1 μL/ml |
| ROCK hæmmer | 1 μL/ml |
| Svampe | 2 μl/ml |
| Tobramycin | 2 μL/ml |
| Ceftazidimhydrat | 4 μL/ml |
| Gentamicin opløsning | 1 μL/ml |
Tabel 1: Komponenter til 500 ml betinget omprogrammering af cellemedier
2. Indsamling af nasal inferior turbinat børstninger
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kræver et opsamlingsrør (50 ml) med næsecelleopsamlingsmedier, cytologibørster, væv og passende personlige værnemidler. Undgå børstning under en øvre luftvejsinfektion. Der er en lille risiko for blødning, som øges, hvis der er betændelse. Hvis formålet med børstningen er at opnå luftvejsepitelplader til ex vivo CBF-målinger, skal børstning ske mindst 6 uger efter enhver øvre luftvejsinfektion; ideelt set mere end 10 uger efter infektion35.
- Forbered næsecelleopsamlingsmediet (afsnit 1) og hold røret på is.
- Beskriv proceduren for deltageren som ubehagelig. Forklar, at der mærkes en fuld fornemmelse i næseboret under børstningen, svarende til at hoppe i havet / poolen og vand, der skynder sig ind i næsepassagen. Rådgive deltagerne om, at proceduren vil fremkalde produktion af tårer som en refleks.
- Vurder, hvilken positionering der passer til deltageren. Læg deltageren i liggende stilling, hvis der er en undersøgelsessofa til rådighed, da liggende positionering forhindrer bevægelse af deltagerens hoved væk fra børsten under proceduren. Alternativt kan du placere deltageren ved siden af en væg, som de kan trykke hovedet tilbage mod.
- Undersøg næsepassagen. Bemærk septal afvigelse, polypper og andre anatomiske abnormiteter, der kan påvirke børstens passage i næsepassagen og øge blødningsrisikoen.
- Rens næsen for overskydende slim ved at bede deltagerne om at blæse næsen ind i et væv.
- Bed deltageren om at trække vejret gennem munden. Tag en cytologibørste i den dominerende hånd. Mens du hviler det femte ciffer på deltagerens hage for at forankre hånden, skal du indsætte cytologibørsten i deltagerens næsepassage (figur 2). Indsæt børsten ved ~ 45 ° til deltagerens ansigt for at passere gennem næsekød.
- Drej børsten lodret, så den er vinkelret på deltagerens ansigt. Skub børsten forsigtigt, men fast mod næsens sidevæg under det ringere turbinat, indtil det er i midten til den bageste del af det ringere turbinat.
BEMÆRK: Undgå overindsættelse; Hvis der mærkes et pludseligt fald i modstanden, er næsesvælget kommet ind, og børsten skal trækkes tilbage, indtil modstanden igen mærkes af proceduralisten. - Drej børsten 360° op til tre gange. Fjern børsten forsigtigt i omvendt af indsættelsesmanøvren, så cellerne ikke løsnes fra børsten.
- Placer børsten i det forberedte opsamlingsrør med næsecelleopsamlingsmedie. Placer opsamlingsrøret på is.
- Gentag børstningen i det andet næsebor, hvis deltageren er behagelig/der kræves et stort antal celler (f.eks. for at starte cellekultur).
BEMÆRK: Det samme næsebor kan børstes igen, hvis der ikke var synlige blodlegemer på børsten, idet det dog bemærkes, at risikoen for blødning øges lidt med en anden børstning i samme næsebor.
Figur 2: Samling af nasale epitelceller. Illustration af placeringen af cytologibørsten i midten til den bageste del af det ringere turbinat. Denne position nås ved at indsætte børsten gennem nares, dreje børsten til en 90 ° vinkel på ansigtet og lede børsten langs næsepassagen under det ringere turbinat. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Fremstilling af luftvejsepitelplader
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kræver opsamlingsrør (cytologibørste(r) + 1 ml næsecelleopsamlingsmedie) (afsnit 2) og 96-godt fladbundet plade. Hvis der opsamles næseturbinatbørster med henblik på billeddannelse af luftvejsepitelark, skal du kun bruge 1 ml antibiotikafri næsecelleopsamlingsmedier; Ellers vil epitelark være for spredt til billeddannelse.
- Hvirvl forsigtigt opsamlingsrøret, der indeholder cytologibørsten/-børsterne, for at løsne luftvejsepitelarkene fra børsten/børsterne.
- Saml alle medier og celler med en P1000-pipette. Dispenser 5-6 dråber i en brønd af en 96-brønd fladbundet plade. Gentag for cirka syv brønde.
- Overfør pladen til mikroskopet i henhold til trin 7.1.4, og følg resten af afsnit 7 til billedcilia beatfrekvens.
- Billedepitelark (figur 1) og ikke enkelte ikke-vedhæftede celler, da det er blevet påvist, at ciliaryfunktionen adskiller sig mellem epitelark og enkelte ikke-vedhæftede celler5.
4. Luftvejsepitelcelleudvidelse og vedligeholdelse
- Airway epitel betinget omprogrammering celle ekspansion kultur
BEMÆRK: Kollagenopløsningsbelagt beholder (afsnit 1), bestrålede museembryonale fødeceller (NIH-3T3), betingede omprogrammeringscellemedier (CRC) (afsnit 1), cytologibørste (er) i næsecelleopsamlingsmedier (afsnit 2).- Bestrålede kimceller til tilberedte kollagenopløsningsbelagte dyrkningsbeholdere med en såtæthed på 8.000 celler/cm 2 mindst2 timer og højst 72 timer før samdyrkning med luftvejsepitelceller (se36 for fødecellekultur og bestråling).
- Overfør de børstede celler i opsamlingsrøret (cytologibørste (er) + næsecelleopsamlingsmedie) til hvirvelstrømmen på is. Ved lav hastighed rører hvirvelrør 10 s på, 10 s væk (hold på is imellem) for at løsne celler fra børsten (e). Kraftig hvirveldannelse kan nedsætte cellens levedygtighed. Undersøg børsten (e) for at kontrollere, om slimet stadig klæber. Hvis ja, gentag hvirvelstrømmen.
- Overfør rørene på is tilbage til biosikkerhedsskabet. Brug en serologisk pipette til at overføre mediet fra opsamlingsrøret til et nyt rør (rør B) og efterlade cytologibørsterne. Centrifugerør B ved 300 × g i 7 minutter ved 4 °C.
- Fjern rør B fra centrifugen, kassér supernatanten. Hvis slimet er synligt, vaskes pelleten med yderligere 5 ml næsecelleopsamlingsmedie og centrifuge igen.
- Tilsæt 1 ml CRC-medier for at resuspendere cellepelleten i rør B. Brug en 5 ml serologisk pipette til at føre celler gennem en cellesigte placeret oven på et 50 ml rør (rør C) i en cirkulær bevægelse.
- Gentag flere gange for at danne en enkelt cellesuspension. Saml det resterende medie fra bunden af sigten og inkorporer det med mediet. Kassér cellesigten.
- Brug en 5 ml serologisk pipette til at tage 1 ml medier fra rør C og overføre det til et mikrocentrifugerør.
- Tag 10 μL af denne cellesuspension og tilsæt den til mikrocentrifugerøret, der er præ-aliciteret med 10 μL trypanblå. Bland godt, og brug straks en automatiseret celletæller til at registrere celleantal og levedygtighed.
- Luftvejsepitelcellerne udsås i T25-kolben, der er forsået med bestrålede fødeceller.
- Vedligeholdelse og dissociation af luftvejsepitelceller
BEMÆRK: CRC-medier skal opvarmes til 37 °C ved at placere dem i et temperaturkontrolleret laboratorievandbad eller en perlebadsanordning, før det tilsættes cellerne.- Kontroller celler under cellekulturmikroskopet (4× objektiv linse) regelmæssigt for vedhæftning, forurening, morfologi og sammenløb.
- Skift CRC-medier hver anden dag. Når der observeres omprogrammerede celler (figur 1), og der ikke er nogen forurening til stede, reduceres eller trækkes antibiotika tilbage.
- Når celler når 90% sammenløb, skal du bruge en dobbelt trypsinmetode32 til at dissociere cellerne og udføre et celletal som beskrevet i trin 4.1.8 (se supplerende fil 2 for celledissociation og frysning).
5. Såning og differentiering af luftvejsepitelceller og vedligeholdelse af differentierede ALI-modeller
- Såning af luftvejsepitelceller til gennemtrængelige støtteindsatser
- Overfør kollagenopløsningens belagte permeable støtteindsatser (afsnit 1) fra CO2 -inkubatoren til biosikkerhedsskabet. Aspirer kollagenopløsningen og kassér. Der tilsættes 750 μL ekspansionsmedium (antibiotikafrit) til basalrummet i de permeable støtteindsatser.
- Overfør de dissocierede celler eller optøede celler på is til biosikkerhedsskabet. Tilføj det volumen ekspansionsmedium, der er nødvendigt for at så 200.000-250.000 celler i 150 μL til det apikale rum i hver permeabel støtteindsats.
- Pas på ikke at skabe bobler; Bland godt for at sikre, at cellerne er homogene og i suspension. Der tilsættes 150 μL cellesuspension til den apikale side af hver permeabel støtteindsats.
- Resuspender cellerne efter såning af hver tredje permeable støtteindsats for at opretholde en homogen cellesuspension.
- Hver anden dag, indtil der dannes et sammenflydende cellemonolag (normalt ved dag 4 efter såning), kasseres mediet og tilsættes frisk ekspansionsmedium opvarmet til stuetemperatur (RT, 15-25 °C).
- Differentiering af luftvejsepitelceller ved luft-væske-grænsefladen
- Varme ALI-medier (antibiotikafri) til RT (15-25 °C).
- Fjern ekspansionsmediet, og skift til differentieringsmedier (ALI) på både apikale og basale rum.
- Efter 2 dages kultur i nedsænkede ALI-medier, aspirer og kassér medierne.
- Tilføj kun 750 μL ALI-medier til basalrummet for at skabe en luft-væske-grænseflade.
BEMÆRK: Hvis monolaget efter 1 uges kultur ikke er sammenflydende, og der stadig observeres huller, har celler muligvis ikke længere kapacitet til at ekspandere ind i de tomme områder, overvej kassering af luftvejsepitelcellerne.
- Vedligeholdelse af differentieret ALI-model og slimfjernelse
- Skift det apikale og basale medie hver anden dag indtil fuld differentiering (dag 21-25 efter etablering af luft-væske-grænseflade).
- En gang om ugen vaskes slim fra den apikale side ved at følge trin 5.3.3-5.3.4.
- Varm PBS til RT (15-25 °C).
- Der tilsættes 200 μL PBS til det apikale rum. Inkuberes i CO2 -inkubatoren i 10 min. Brug en aspirationsanordning eller pipette til at fjerne PBS.
6. Tredimensionale luftvejsepitelorganoider
- Forberedelser til luftvejsepitelorganoidkultur
- Der anbringes 24 brøndplader i en CO2 -inkubator for at varme op til 37 °C natten over.
- Optø et 10 ml hætteglas med ECM (Table of Materials) på is i henhold til producentens anvisninger. Forbered 500 μL aliquots (engangsbrug) for at minimere antallet af fryse-optøningscyklusser.
BEMÆRK: Brug ECM med proteinkoncentration >10,5 mg / ml for de bedste dyrkningsresultater anbefales. Lavere koncentration vil fremskynde opløsningen af ECM-kuplen og øge forekomsten af apikale-vendte-udadvendte organoider. - Brug Airway Organoid Kit (Tabel over materialer) til at forberede Airway Organoid Seeding Media (AOSM) og Differentieringsmedier (AODM) i henhold til producentens anvisninger.
- Forbered luftvejsorganoid basalmedier i henhold til tabel 2.
| Komponent | Lydstyrke |
| Avanceret DMEM/F-12 | 500 ml |
| HEPES | 5 ml |
| Alanyl-glutamin | 5 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml |
Tabel 2: Komponenter i luftvejsorganoid basalmedie
- Brug antallet af levende luftvejsepitelceller, der er dissocieret i punkt 4.2, til at beregne, hvor mange brønde der kan sås med en såtæthed på 10.000 celler (se tabel 3).
- Beregn det samlede volumen af ECM og AOSM, der er nødvendigt for at oprette 1 x 50 μL 90% ECM-kuppel (45 μL ECM og 5 μL AOSM) pr. Brønd.
BEMÆRK: Den anbefalede såtæthed på 10.000 celler pr. Brønd er for CRC-ekspanderede næseepitelceller ved passage 1. Senere passageceller kan kræve højere såtæthed for at opnå dannelsen af det samme antal organoider.
| Antal brønde | Antal celler | Antal kupler | Vol af Matrigel ECM | Vol af AOSM |
| 1 | 10.000 celler | 1 | 45 μL x 1,1 | 5 μL x 1,1 |
| 2 | 20.000 celler | 2 | 90 μL x 1,1 | 10 μL x 1,1 |
| 5 | 50.000 celler | 5 | 225 μL x 1,1 | 25 μL x 1,1 |
| ......... | ......... Celler | ......... | .........μL x 1,1 | .........μL x 1,1 |
Tabel 3: Beregninger for såning af luftvejsepitelceller i ECM-kupler
- Såning af luftvejsepitelceller i ECM-kupler
BEMÆRK: Hold ECM på is hele tiden og udfør alle trin, der involverer ECM på is, da ECM begynder at størkne ved temperaturer >10 °C.- Resuspenderbare luftvejsepitelcellerne dissocieret i pkt. 4.2 med det beregnede volumen på 90% ECM i henhold til tabel 3.
- Hold pipetten i en vinkel på 90° (lodret) så tæt på bunden af brønden som muligt, og dispenser 50 μL (til første stop for at undgå at skabe bobler) af ECM-cellesuspensionen til midten af brønden. Undgå at røre ved brøndens væg.
- Der inkuberes pladen ved 37 °C i 20 minutter, indtil ECM størkner. Mens ECM størkner, varm AOSM til RT (15-25 ° C) for at forhindre, at den forårsager re-liquification og opløsning af ECM-kuplen ved tilsætning.
- Tilsæt 500 μL opvarmet AOSM til hver brønd ved at dispensere ned ad brøndens væg. Pipettemedier må ikke pipetteres direkte på ECM-kuplen.
- Skift medier hver 2. dag i 4-7 dage. For at aspirere medier skal du vippe pladen i en vinkel på 45° og aspirere fra brøndens nederste kant væk fra ECM-kuplen.
- Efter 4-7 dage initieres organoiddifferentiering ved at tilføje 500 μL AODM (15-25 °C) til hver brønd og skifte medie hver 2. dag i 7 dage.
- Replating luftvejsepitelorganoider på dag 7 af differentiering
BEMÆRK: Replating luftvejsepitelorganoider er nødvendig, fordi kanten af ECM-kuplerne gradvist opløses i løbet af 2-ugers kulturperioden. Airway epitelorganoider ved kanten af kuplen kan gå tabt (løsne sig i medierne) eller have apikal-vendt-udadgående orientering, når de ikke er fuldt indlejret i ECM. Replating-trinnet "rydder også op" ECM-kuplen ved at fjerne celler / snavs, der ikke med succes danner organoider.- Aspirer medierne fra hver brønd. Tilsæt 500 μL koldt luftvejsorganoid basalmedie (fremover kaldet basalmedier) til hver brønd.
- Brug P1000-pipetten, da denne pipettespids har den største åbning og reducerer sandsynligheden for, at organoider sprænger under pipettering. Juster pipetten til 350 μL for at undgå at skabe bobler, og pipetter derefter forsigtigt op og ned for at forstyrre ECM-kuplen i hver brønd. Saml alle ECM/basalmedier i et 15 ml centrifugerør.
- Skyl hver brønd med 500 μL koldt basalt medie. Basalmediet indeholdende resterende ECM og organoider samles i det samme 15 ml centrifugerør som ovenfor.
- Centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Af de tre lag, der er synlige efter centrifugering - (1) supernatant, (2) ECM indeholdende cellulært affald (fluffy) og (3) pelletholdige organoider - kassér supernatanten og ECM-laget og bevar organoidpellet.
- Tilsæt 1 ml koldt basalt medie til organoidpelleten og pipetter forsigtigt op og ned for at adskille eventuel resterende ECM. Tilsæt 6 ml koldt basalmedie til røret og bland forsigtigt.
- Centrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Hvis overskydende ECM stadig er synlig, skal du gentage trin 6.3.5- 6.3.6 for at udføre en anden vask.
- Resuspender organoidpelleten med et passende volumen på 90% ECM (brug AODM i stedet for AOSM) til plade ~ 30 organoider pr. 50 μL af kuplen.
- Kontroller tætheden af organoider under cellekulturmikroskopet (4x objektiv linse) efter plettering af den første kuppel. Hvis det er for tæt, tilføj yderligere 90% ECM for at opnå den ønskede tæthed på ~ 30 organoider.
- Følg trin 6.2.3- 6.2.4 for at størkne ECM og fodre celler hver anden dag med 500 μL opvarmet AODM til hver brønd i yderligere 14 dage, indtil de når modenhed (efter 21 dages differentiering) med lumendannelse omgivet af indadvendt pseudostratificeret epitel indeholdende basalceller, cilierede celler og bægerceller.
BEMÆRK: Luftvejsepitelorganoiderne beskrevet her er terminalt differentierede og kan ikke passeres eller kryopræserveres.
7. Imaging cilia beat frekvens
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kræver et levende cellebilledmikroskop med et varme- og fugtighedsmiljøkammer, et videnskabeligt kamera med hurtig billedhastighed (>100 Hz), et 20x langdistancemål og billedbehandlingssoftware (se Materialetabel for anbefalet udstyr, der anvendes i denne protokol).
- Opsætning af mikroskop
- Sørg for, at mikroskopvarmesystemet er tændt og ækvilibreret til 37 °C. Tænd mikroskopet. Juster gassen til 5% CO 2 via CO2/luftgasblanderen.
- Fyld fugtighedsmodulflasken, som CO2 passerer igennem, med renset vand. Indstil den relative luftfugtighed til 85% via trin-top-controlleren, så vandet opvarmes, og cellerne forsynes med befugtet luft. Ligevægt kammeret i 30 min.
- Anbring mikroskoppladen i mikroskopholderen.
- Luftvejsepitelcellemodellerne overføres fra inkubatoren til mikroskopet på en varmeblok eller termiske perler, der er ækvilibreret til 37 °C for at holde prøven ved en fysiologisk temperatur.
- Placer kulturpladen indeholdende luftvejsepitelcellemodellerne i mikroskoppladen. Luk mikroskopet miljøkammer.
- Prøven balanceres i det forvarmede 37 °C, 5 % CO2 -fyldte mikroskopkammer i 30 min.
BEMÆRK: En kortere ligevægtstid kan være tilstrækkelig. Dette kan bestemmes ved at udføre et eksperiment for at identificere den tid, der kræves til stabilisering af CBF (se figur 3).
Figur 3: Stabilisering af ciliary beatfrekvens i levende cellebilledmikroskop. Prikplotter af gennemsnitlig cilia-slagfrekvens (CBF) i luftvejsepitelceller ved luft-væske-grænsefladen (ALI-modeller) efter overførsel til et levende cellebilledmikroskop med et miljøkammer. Kammeret blev ligevægtet og opretholdt ved 37 °C, 5% CO2 og en relativ luftfugtighed på 85% i 30 minutter, før kammerdøren blev åbnet, og kulturpladen blev anbragt i mikroskopets pladeindsats. Cellemodeller blev afbildet i 60 minutter med angivne intervaller. ALI-modeller blev afledt af to deltagere med CF. Seks synsfeltbilleder (FOV) blev erhvervet pr. ALI-model. Hver prik (blå) repræsenterer den gennemsnitlige CBF i 12-36 FOV-billeder. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM, med middelværdi forbundet med en stiplet linje. Envejsanalyse af varians (ANOVA) blev brugt til at bestemme statistiske forskelle. P < 0,0001, ns: ingen betydning. Klik her for at se en større version af denne figur.
- I ækvilibreringsperioden skal du åbne anskaffelsessoftwaren på computeren. Vælg objektivet på 20x lang arbejdsafstand.
- Ved mikroskopet okularet skal du fokusere på cellemodellen (~ Z = 8000 μm).
- Sørg for, at mikroskopet er indstillet til Kohler-belysning, så transmissionslyskildepærefilamenter ikke er fokuseret på prøveplanet, så du undgår artefakter i billeddannelsen. Følg trin 7.1.10-7.1.13
- Luk feltet iris membranen helt over kondensatoren. Åbn langsomt feltmembranen, og flyt kondensatoren op/ned, indtil der vises en ottekantet form.
- Hvis feltmembranen ikke er justeret (dvs. ottekanten ikke er i midten af synsfeltet (FOV)), skal du justere den til midten ved hjælp af unbrakonøgler.
- Når feltirismembranen er justeret, skal du justere kondensatorfokus for at bringe ottekanten i skarpt fokus.
- Åbn feltirismembranen, indtil den ikke længere kan ses i FOV.
- Brug anskaffelsessoftwaren til at klikke på L100 for at skifte lysstien til porten, hvor kameraet er monteret. Klik på den grønne afspilningsknap (Kør) for at visualisere mikroskopet FOV via softwaren. Kontroller, at cilia er i fokus, og juster om nødvendigt.
- Brug anskaffelsessoftwaren til at oprette mikroskopet med følgende indstillinger: Filtre: tom; Kondensator: tom; Format: ingen binning; Eksponeringstid: 0,003 s; Udlæsningstilstand: rullende lukker; ROI: 512 × 512 pixels.
BEMÆRK: Eksponeringstiden er baseret på den højeste frekvens, der skal måles, da 1/eksponeringstiden skal være mindst dobbelt så høj. F.eks. hvis det maksimale fysiologiske interval for cilia slag = 30 Hz, så 1/eksponeringstid = 60, og eksponeringstiden skal være ≤ 0,016 s. ROI afhænger af specifikationerne for kameraets billedhastighed. Vælg et investeringsafkast, der fanger billedhastigheder >100 Hz.
- Erhvervelse af billeder
- For at hente time-lapse-billeder fra menuen skal du klikke på Hent og derefter klikke på Fast Time Lapse. I pop op-vinduet skal du vælge en gemt placering og filnavn. Anskaf 1000 rammer.
- Klik på Anvend. Klik på den grønne afspilningsknap (Kør) for at få vist cilia i mikroskopet FOV og justere Z-fokus, hvis det kræves. Klik på Kør nu for at fange den hurtige time-lapse.
- Når den hurtige time-lapse er blevet fanget, skal du klikke på den grønne afspilningsknap (Kør) for at visualisere mikroskopet FOV. Brug mikroskop joysticket til at bevæge sig langs X / Y-aksen til en anden FOV.
- Juster Z-fokus for at bringe cilia i fokus. Klik på Kør nu for at fange endnu et hurtigt time-lapse.
- Gentag trin 7.2.3-7.2.4. For ALI-modeller og luftvejsorganoider skal du afbilde 6x FOV i hver af 3x replikatprøver. For luftvejsepitelark skal du afbilde mindst 4x replikere billeder pr. Deltager.
8. Dataanalyse og kvantificering af CBF
- Forberedelser til dataanalyse
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen kræver brugerdefinerede analysescripts (supplerende fil 3), rå billedfiler (erhvervet i afsnit 7.2), en computersoftware og analysesoftware.- Installer computersoftwaren, helst den nyeste version, på analysecomputeren. Sørg for, at standard computersoftware værktøjskasser (elmat, ops, datafun, uitools, datatyper, iofun, iotools, audiovideo) og billed- og signalbehandling værktøjskasser er installeret.
- Kopier mappen 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' og 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' og 'support scripts' til computerens lokale drev.
- På computersoftwaren skal du klikke på fanen Hjem. Klik derefter på Indstil sti (figur 4A-B).
- I pop op-vinduet skal du klikke på Tilføj med undermapper (figur 4C). Under 'MATLAB-søgesti' skal du vælge de mapper, der vises i figur 4D, og derefter klikke på Gem og luk (figur 4E-F).
- Bekræft, at analysescripts er knyttet til computersoftwaren ved at kontrollere, at de vises i panelet til venstre (figur 4G).
- Overfør de rå billedfiler (open microscopy environment (OME) format), der er erhvervet i afsnit 7.2, til computerens lokale drev.
BEMÆRK: Eksempler på rå billedfiler kan tilgås på: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.
Figur 4: Opsætning af computersoftware til dataanalyse. (A) Åbn fanen Hjem . (B) Vælg Indstil sti. (C) Vælg Tilføj med undermapper. (D) Vælg mapper, der indeholder analysescripts. (E) Vælg Gem. (f) Vælg Luk. (G) Analysescripts vises i panelet til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Kvantificering af CBF ved topdetektion af intensitetsspektret for enkelte pixels
- Åbn computersoftwaren. Klik på analysescriptfilen 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' (figur 5A).
- Klik på fanen Editor, og klik derefter på den grønne afspilningsknap (Kør) for at køre scriptet (Figur 5B-C). I promptvinduet skal du vælge de rå billedfiler, der skal analyseres (figur 5D).
- Indtast eksponeringstiden fra trin 7.1.15 i promptvinduet for anskaffelsestid pr. ramme, og klik derefter på OK (figur 5E).
- Vent ~15 min pr. fil, mens scriptet beregner og udsender CBF i filen 'AveSpectrum' (supplerende fil 4), som automatisk gemmes i samme mappe som de rå billedfiler. Visualiser fremskridtene via statuslinjen (figur 5F).
Figur 5: Kørsel af analysescripts ved hjælp af computersoftware . (A) Åbn scriptet til analyse af CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') eller oprettelse af cilia-slagfilm ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Åbn fanen Editor . (C) Vælg den grønne afspilningsknap (Kør) for at køre analysescriptet. (D) Et promptvindue kræver valg af filer til analyse eller filmoprettelse. (E) Mens du kører scriptet 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m', vises en prompt om manuelt at indtaste anskaffelsestiden pr. Ramme (er), hvis fillæsningsscriptet ikke læser metadataene korrekt. (F) Statuslinje, der angiver cilia beat-frekvens, der beregnes. (G) Mens du kører 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'-scriptet, vises en prompt om manuelt at indtaste den type film, der skal udsendes (mp4 eller avi), filmbilledhastigheden (fps), om den immobile komponent fjernes fra filmdataene ('y' eller 'n'), rammetiden (e) og pixelstørrelsen (mikron) af de data, der eksporteres til filmen. Det anbefales at bruge 'y' til immobilfiltrering, da det fjerner slim eller andre blokerende immobile lag i dataene. (H) Statuslinje for angivelse af film, der eksporteres. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Kør scriptet 'GetFirstAmplitude.m' i den mappe, der indeholder 'AveSpectrum'-filerne, ved hjælp af processen i trin 8.2.1-8.2.2. Vent på, at scriptet udsender filen 'FirstAmplitudeStacked.xlsx', som indeholder den frekvens, der har den højeste amplitude og ligger inden for det fysiologiske område af luftvejsepitelcilier, der slår ≥3 og <30 Hz.
- Kopier frekvensværdierne fra filen 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' og plot ved hjælp af en videnskabelig analysesoftware.
BEMÆRK: En forklaring på, hvordan det brugerdefinerede analysescript kvantificerer CBF, findes i supplerende fil 5. Eksempler på analyserede datasæt kan tilgås på: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
- Eksport af en video af cilia slår
- Åbn computersoftwaren. Klik på scriptfilen 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' (figur 5A) for at indlæse scriptet.
- Klik på fanen Editor , og klik derefter på den grønne afspilningsknap (Kør) for at køre scriptet (Figur 5C). I promptvinduet skal du vælge de rå billedfiler, der skal eksporteres til filmfiler (figur 5D).
- Indtast indstillingerne beskrevet i tabel 4 i pop op-vinduet 'Lav film' (figur 5G).
- Vent ~ 8 minutter pr. Fil, mens scriptet opretter filmfilerne og sender dem til placeringen af de rå billedfiler. Visualiser fremskridtene via statuslinjen (figur 5H).
| Indgange til film | Beskrivelse: __________ |
| Filtype | Indtast den filtype, du vil eksportere (mp4 eller avi). |
| Billedhastighed | Indtast den billedhastighed, hvormed filmen skal eksporteres. Hvis du har ~1000 billeder pr. anskaffet tidsserie, anbefales det at indstille billedhastighed ~30 fps. |
| Immobil filtrering | Valgmulighederne er 'y' eller 'n'. Standard er 'y', og tidsfiltreringsscriptet fjerner ved hjælp af Fourier-plads alle immobile komponenter fra filmdata. Typisk vil ethvert lag af celler under cilia eller immobilt slim bidrage med en nulfrekvensforskydningskomponent eller tidsinvariant komponent i signalet, der kan filtreres ud. |
| Anskaffelsestid pr. ramme | Anskaffelsestiden pr. ramme for erhvervede data. Det bruges til at vise et tidsstempel i filmen på få sekunder. |
| Pixel størrelse | Pixelstørrelsen i mikrometer bruges til at vise en skalabjælke i filmen i mikrometer. |
Tabel 4: Inputindstillinger for oprettelse af film
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere effektiviteten af denne protokol til kvantificering af CBF præsenteres resultaterne af CBF målt i luftvejsepitelcelle-ALI-modeller afledt af tre deltagere med CF og tre raske kontroldeltagere. På dag 14 af kulturdifferentiering var der slagcilier til stede (figur 6). Fra dag 14 til 21 af kulturdifferentiering blev der observeret en statistisk signifikant (P < 0,0345) stigning i CBF inden for begge kohorter. På dag 21 af kulturdifferentiering var den gennemsnitlige CBF for raske kontroldeltagere (7,61 ± 0,11 Hz) signifikant højere end for deltagere med CF (6,75 ± 0,17 Hz). For at forstå, i hvilket omfang slimophobning og fjernelse påvirker CBF, blev CBF afbildet i de samme cellemodeller efter fjernelse af slim. I ALI-modeller af både raske individer og personer med CF var der en statistisk signifikant (P < 0,0001) stigning i CBF, når slim blev fjernet (figur 6).
Figur 6: Effekt af slimfjernelse på cilia beat frekvens. Prikplots af gennemsnitlig cilia-slagfrekvens (CBF) i luftvejsepitelceller ved luft-væske-grænsefladen (ALI-modeller), erhvervet præ- og post-slimudvaskning på dag 14 og 21 af kulturdifferentiering. Slimudvaskning blev udført ved at vaske den apikale celleoverflade med 200 μL opvarmet PBS. ALI-modeller blev afledt af raske deltagere (n = 3) og deltagere med CF (n = 3). Data er repræsenteret som middel ± SEM. Hver prik repræsenterer et enkelt synsfeltbillede. Seks synsfeltbilleder blev erhvervet i tre replikerede ALI-modeller. Hver deltager er kodet med en anden farve. Envejsanalyse af varians (ANOVA) blev brugt til at bestemme statistiske forskelle. P < 0,0001, ** P < 0,01, * P < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Resumé af 18 publikationer, der viser mangfoldigheden af kultur- og levende cellebilleddannelsesparametre, der anvendes til at kvantificere cilia-beatfrekvensen i organotypiske modeller af luftvejsepiteliet. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Airway epitelcelle dissociation for differentiering eller kryopræservering Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Brugerdefinerede analysescripts Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Datafiler udsendt af analysescript Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Beskrivelse af CBF-analysealgoritmen Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere faktorer, der kan skjule kvantificeringen af CBF i næseepitelark. Epitelark skal afbildes inden for 3-9 timer efter prøveindsamling, da ciliaryfunktionen er mest stabil i løbet af denne tid37. Mindre røde blodlegemer og snavs er mest optimale til billeddannelse, da disse forstyrrer dataindsamlingen. Når du vælger et investeringsafkast til billeddannelse, er det vigtigt at vælge et epitelark, der ikke er blevet beskadiget eller forstyrret under indsamlingen af prøven, og ikke en enkelt ikke-vedhæftet epitelcelle, da disse variabler har vist sig at påvirke CBF5. Det er også nødvendigt, at epitelarket er stationært, fordi bevægelser kan skjule dataindsamling. Epitelark i medier orienterer sig ofte i forskellige retninger27. Da det tidligere er blevet påvist, at afvigelser i prøvekvaliteten, såsom forstyrrede epitelkanter, påvirker CBF5, er det sandsynligt, at orienteringen af epitelarket også kan påvirke CBF. En begrænsning ved denne protokol er, at virkningen af epitelarkets orientering ikke er blevet vurderet. Dette forventes at være et vigtigt studieområde for yderligere standardisering.
Modne ALI-modeller har et pseudostratificeret epitel med tilstedeværelsen af bægerceller, der producerer slim34. Overfladen og viskositeten af slimpåvirkning ciliær funktion 2,38. Det blev for nylig vist, at fjernelse af akkumuleret slim fra nasale epitelale ALI-cellemodeller forårsagede en stigning i CBF3. En cyklisk proces blev beskrevet, hvor regenerering af slim over en 24-timers periode kompromitterede CBF, indtil slimet blev fjernet og CBF steg igen. For at påvise, at repeterbarheden af CBF-målinger er betinget af reguleringen af cilias fysiologiske miljø, blev virkningen af slimfjernelse på CBF vurderet. En statistisk signifikant 3,5 Hz ændring i CBF blev observeret efter slimfjernelse. I sammenligning med disse resultater rapporterede en nylig undersøgelse, der testede cilia-respons på CFTR-modulerende forbindelser3, en ændring i CBF, der ikke var større end den, der var forårsaget af slimfjernelse i vores modelsystem. Dette understreger vigtigheden af at regulere miljøvariabler, der påvirker CBF, især hvis dette modelsystem skal etableres som en platform til at studere det patientspecifikke respons på behandlinger i fremtiden. Som sådan anbefales det at være konsekvent med enten at fjerne slim eller ikke fjerne det før billeddannelse for at kontrollere indflydelsen af denne miljøvariabel af kvantificeringer af CBF.
Temperatur er den dominerende faktor, der forårsager udsving i CBF. Cilia har tidligere vist sig at være følsom over for udsving i fysiologisk temperatur i muselungeskiver og næsebiopsier39,40. Som sådan er det vigtigt at observere trin, der minimerer temperaturudsving i omgivelserne, når man håndterer prøver til billedoptagelse og sikrer, at celler stabiliseres i 37 ° C mikroskopkammeret inden billeddannelse. Ved billeddannelse af cilia skal cilia komme i fokus lige over cellemonolaget. Hvis ciliaslag ikke kan observeres via lysmikroskopi, kan fjernelse af akkumuleret slim ved vask med opvarmet PBS øge ciliaslag, da det vides, at slim forhindrer cilia at slå3. En anden suboptimal situation vil være, hvis der er en bevægelse af slim over cellerne, da dette vil hindre dataindsamling. En løsning ville være at vælge en ROI uden den synlige bevægelse af slim. Men i den situation, hvor dette er uundgåeligt, anbefales det at fjerne slim ved vask.
En vigtig advarsel at overveje er at vælge et passende kamera og objektivt objektiv til at opfylde den tidsmæssige og rumlige Nyquist-prøveudtagning. Det lange arbejdsdistanceobjektiv, der anvendes i denne undersøgelsesprotokol, gør det muligt at fange et relativt stort synsfelt. Dette gør det muligt at afbilde CBF i intakte ALI-kulturer med en rumlig opløsning på ~ 500 nm (NA0.45). Som sådan kan ciliarybundtet løses rumligt. Alligevel er en begrænsning ved denne protokol, at hele ALI-modellen ikke kan afbildes i en opløsning, der kan analyseres. Som følge heraf skal der vælges et investeringsafkast til dataindsamling. For at begrænse den bias, der er forbundet med at vælge et investeringsafkast, anbefales det, at der vælges seks ROI'er fra forskellige zoner inden for hver permeabel supportindsats. Dette er vigtigt, da det tidligere er blevet påvist, at cilia ikke slår synkront inden for en prøve, og CBF varierer mellem forskellige kanter og ROI16,41, hvilket indebærer, at forskellige ROI'er sandsynligvis har forskellige gennemsnitlige CBF-værdier. Desuden er det vigtigt at have adgang til højhastighedskameraer med en billedhastighed på mindst 100 Hz, således at enhver tidsmæssig begivenhed, der sker med en hastighed på 50 Hz, kan løses ved hjælp af Nyquist-samplingskriteriet. Et hurtigt sCMOS-kamera med ekstremt lav støj, der muliggør måling af et enkelt molekyle, anbefales. Denne protokol er dog ikke begrænset af brugen af denne type kamera, så længe kameraet opfylder tidsmæssige samplingskrav og fanger pixels intensitetsudsving som følge af ciliary beating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker undersøgelsesdeltagerne og deres familier for deres bidrag. Vi sætter pris på hjælpen fra Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick respiratoriske afdeling i organisationen og indsamlingen af patientbiospecimens - særlig tak til Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson og Rhonda Bell. Vi anerkender hjælpen fra Iveta Slapetova og Renee Whan fra Katharina Gaus Light Microscopy Facility inden for Mark Wainwright Analytical Center ved UNSW Sydney. Dette arbejde støttes af National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia og Sydney Children's Hospital Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health for dets bidrag og støtte. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health er et non-profit kooperativt joint venture mellem Sydney Children's Hospitals Network, Children's Medical Research Institute og Children's Cancer Institute. Det er blevet oprettet med støtte fra NSW-regeringen for at koordinere og integrere pædiatrisk forskning. Luminesce Alliance er også tilknyttet University of Sydney og University of New South Wales Sydney. KMA støttes af et australsk regerings forskningsuddannelsesprogramstipendium. LKF er støttet af Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children's Hospital Foundation og UNSW University postgraduate award stipendier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
References
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).
- Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
- Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
- Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41 (2018).
- Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
- Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
- Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
- Salathe, M.
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).
- Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
- Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
- Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
- Ratjen, F., et al.
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
- Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
