Summary
Dit protocol beschrijft nasale epitheelcelverzameling, uitbreiding en differentiatie naar organotypische luchtwegepitheelcelmodellen en kwantificering van de trilharenslagfrequentie via live-cell imaging en op maat gemaakte scripts.
Abstract
Metingen van de trilhaarfunctie (slagfrequentie, patroon) zijn vastgesteld als diagnostische hulpmiddelen voor aandoeningen van de luchtwegen, zoals primaire ciliaire dyskinesie. De bredere toepassing van deze technieken wordt echter beperkt door de extreme gevoeligheid van de ciliaire functie voor veranderingen in omgevingsfactoren, zoals temperatuur, vochtigheid en pH. In de luchtwegen van patiënten met Cystic Fibrosis (CF) belemmert slijmaccumulatie het kloppen van trilharen. De Cilia-functie is onderzocht in primaire luchtwegcelmodellen als een indicator van CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) kanaalactiviteit. Er is echter een aanzienlijke variabiliteit van patiënt tot patiënt in de frequentie van trilharen gevonden als reactie op CFTR-modulerende geneesmiddelen, zelfs voor patiënten met dezelfde CFTR-mutaties . Bovendien is de impact van disfunctionele CFTR-gereguleerde chloridesecretie op de ciliaire functie slecht begrepen. Er is momenteel geen uitgebreid protocol dat de monstervoorbereiding van in vitro luchtwegmodellen, beeldacquisitie en analyse van Cilia Beat Frequency (CBF) demonstreert. Gestandaardiseerde kweekomstandigheden en beeldacquisitie uitgevoerd in een milieugecontroleerde toestand zouden een consistente, reproduceerbare kwantificering van CBF tussen individuen en in reactie op CFTR-modulerende geneesmiddelen mogelijk maken. Dit protocol beschrijft de kwantificering van CBF in drie verschillende luchtwegepitheelcelmodelsystemen: 1) native epithelial sheets, 2) lucht-vloeistof interfacemodellen afgebeeld op permeabele steuninzetstukken, en 3) extracellulaire matrix-ingebedde driedimensionale organoïden. De laatste twee repliceren in vivo longfysiologie, met kloppende trilharen en productie van slijm. De ciliaire functie wordt vastgelegd met behulp van een hogesnelheidsvideocamera in een omgevingsgestuurde kamer. Voor de analyse van CBF worden op maat gemaakte scripts gebruikt. Vertaling van CBF-metingen naar de kliniek is bedoeld als een belangrijk klinisch hulpmiddel voor het voorspellen van de respons op CFTR-modulerende geneesmiddelen per patiënt.
Introduction
Metingen van Cilia Beat Frequency (CBF) en patroon zijn vastgesteld als diagnostische hulpmiddelen voor respiratoire aandoeningen zoals primaire ciliaire dyskinesie (PCD)1. Bij Cystic Fibrosis (CF) veroorzaakt disfunctie van het CF Transmembraangeleidingsregulator (CFTR) chloridekanaal uitdroging van de luchtwegoppervlakvloeistof en verminderde mucociliaire klaring2. De ciliaire functie is in vitro onderzocht in primaire luchtwegcelmodellen als indicator voor CFTR-kanaalactiviteit3. Er bestaat echter een aanzienlijke variabiliteit van patiënt tot patiënt in CBF als reactie op CFTR-modulerende geneesmiddelen, zelfs voor patiënten met dezelfde CFTR-mutaties 3. Bovendien is de impact van disfunctionele CFTR-gereguleerde chloridesecretie op de ciliaire functie slecht begrepen. Er is momenteel geen uitgebreid protocol dat de monstervoorbereiding van in vitro luchtwegmodellen, beeldacquisitie en analyse van CBF aantoont.
Nasale epitheliale platen geïsoleerd van nasale mucosale borstelingen worden direct gebruikt voor metingen van de ciliaire functie voor PCD-diagnose4. Hoewel er geen controle is over de grootte of kwaliteit van de verkregen nasale epitheliale vellen, varieert CBF afhankelijk van of het wordt gemeten op enkele cellen of celbladen en op epitheelplaat trilhaarranden die verstoord of ongestoord zijn5. Als zodanig kan secundaire dyskinesieën veroorzaakt door schade aan cellen tijdens het verzamelen van neusslijmvliesborstels CBF beïnvloeden. Primaire celkweek van nasale epitheelcellen en hun differentiatie bij Air-Liquid Interface (ALI) of in driedimensionale keldermembraanmatrix in trilhaarepepitheelorganoïden geven aanleiding tot trilhaartjes die vrij zijn van secundaire dyskinesieën 4,6,7,8. Luchtwegepitheelcellen gedifferentieerd bij ALI (voortaan ALI-modellen genoemd) worden beschouwd als een belangrijk secundair diagnostisch hulpmiddel dat de ciliaire slagpatronen en frequentie van ex vivo neusslijmvliesborstelsrepliceert 6 en analyse van ciliaire ultrastructuur, beatpatroon en slagfrequentie mogelijk maakt met behoud van patiëntspecifieke defecten9 . Toch bestaan er discrepanties in de methodologieën die worden gebruikt om deze pseudostratified, mucociliair gedifferentieerde celmodellen te maken. Verschillende kweekuitbreidings- of differentiatieprotocollen kunnen verschillende epitheliale fenotypen (trilhaar of secretoir)10 induceren en resulteren in significante verschillen in CBF11. CBF is gekwantificeerd in nasale epitheliale borstels 4,6,12,13,14,15,16, luchtwegepitheel organoïden 14,17,18 en ALI modellen 3,4,6,13,19,20, 21. Toch zijn er onder deze protocollen grote variabiliteiten en vaak worden veel parameters niet gecontroleerd. In sommige studies wordt CBF bijvoorbeeld in situ afgebeeld terwijl de cellen van het ALI-model op de permeabele steuninzet 3,19,20,21 blijven, terwijl anderen de cellen van de permeabele steuninzet schrapen en ze in media 4,6,13 ophangen.
Bovendien wordt de bredere toepassing van technieken die de ciliaire functie meten beperkt door de extreme gevoeligheid van de ciliaire functie voor veranderingen in omgevingsfactoren. Omgevingsfactoren zoals temperatuur22,vochtigheid 23,24 en pH25,26 beïnvloeden de ciliaire functie en moeten worden gereguleerd om CBF nauwkeurig te kwantificeren. De verschillende fysiologische parameters die in verschillende laboratoria worden gebruikt en hoe ze CBF beïnvloeden, zijn eerder beoordeeld27.
Verschillende beeldvormingstechnologieën en benaderingen van CBF-metingen worden gerapporteerd in de literatuur. Voor PCD-diagnostiek wordt videomicroscopie gebruikt om ciliaire functie28,29 te meten. Onlangs werd een video-analysealgoritme op basis van differentiële dynamische microscopie gebruikt om zowel CBF- als cilia-coördinatie in luchtwegepitheelcel ALI-modellen 3,30 te kwantificeren. Deze methode maakt de karakterisering van ciliaire kloppen in luchtwegepitheelcellen op een snelle en volledig geautomatiseerde manier mogelijk, zonder de noodzaak om regio's te segmenteren of te selecteren. Verschillende methoden voor beeldvorming en kwantificering van CBF kunnen bijdragen aan de verschillen die in cbf in de literatuur worden gerapporteerd (aanvullend dossier 1).
Een protocol van cultuur tot kwantificering om bestaande methoden, standaardisatie van cultuuromstandigheden en beeldacquisitie te stroomlijnen, uitgevoerd in strikte milieugecontroleerde omstandigheden, zou een consistente, reproduceerbare kwantificering van CBF binnen en tussen individuen mogelijk maken.
Dit protocol biedt een volledige beschrijving van de verzameling epitheelcellen, expansie- en differentiatiecultuuromstandigheden en kwantificering van CBF in drie verschillende luchtwegepitheelcelmodelsystemen van nasale oorsprong: 1) inheemse epitheelbladen, 2) ALI-modellen afgebeeld op permeabele steuninzetstukken en 3) Extracellulaire Matrix (ECM)-ingebedde driedimensionale organoïden (figuur 1) ). Nasale epitheelcellen verkregen uit nasale inferieure turbinaatborstels worden gebruikt als vertegenwoordigers van het luchtwegepitheel, omdat ze een effectief surrogaat zijn voor bronchiale epitheelcellen31 terwijl ze de invasieve procedure overwinnen die gepaard gaat met het verzamelen van bronchiale borstels. De Conditional Reprogramming Cell (CRC) methode wordt gebruikt om primaire luchtwegepitheelcellen uit te breiden voor het maken van ALI-modellen en driedimensionale organoïden. Voorwaardelijke herprogrammering van luchtwegepitheelcellen tot een stamcelachtige toestand wordt geïnduceerd door cocultuur met groei-gestopt fibroblast feedercelsysteem en Rho-associated kinase (ROCK) -remmer32. Belangrijk is dat de CRC-methode de bevolking verdubbelt in luchtwegepitheelcellen met behoud van hun weefselspecifieke differentiatiepotentieel33,34. In alle luchtwegepitheelcelmodellen wordt de ciliaire functie vastgelegd in een temperatuurgecontroleerde kamer met behulp van een hogesnelheidsvideocamera met gestandaardiseerde beeldacquisitie-instellingen. Op maat gemaakte scripts worden gebruikt voor de kwantificering van CBF.
Figuur 1: Schema van de workflow. Na het borstelen van het nasale inferieure turbinaat van de deelnemers, worden luchtwegepitheelcellen op twee manieren gebruikt. Ofwel worden luchtwegepitheelbladen geïsoleerd en de trilhaartjes worden onmiddellijk in beeld gebracht, ofwel worden luchtwegepitheelcellen uitgebreid via de voorwaardelijke herprogrammeringscelmethode. CRC-geëxpandeerde luchtwegepitheelcellen worden gedifferentieerd om luchtwegepitheelcellen vast te stellen op een lucht-vloeistof interface of luchtepitheel organoïde culturen. Beeldvorming van de ciliaire beatfrequentie wordt verkregen met behulp van een live-cell imaging microscoop met een verwarmings- en vochtigheidsomgevingskamer en een wetenschappelijke camera met snelle framesnelheid (>100Hz). Gegevensanalyse wordt uitgevoerd met behulp van op maat gemaakte scripts. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studiegoedkeuring werd ontvangen van de Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC / 16 / SCHN / 120). Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle deelnemers (of de voogd van de deelnemers) voorafgaand aan het verzamelen van biospecimens.
1. Voorbereidingen voor het opstellen van luchtwegepitheelcelmodellen
- Bereid nasale celverzamelingsmedia voor door 80% Dulbecco's Modified Eagle Medium en 20% Foetaal Runderserum te combineren. Supplement met 1 μL/ml penicilline/streptomycine. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Bekleed de kolven of doorlatende steuninzetstukken per behoefte met collageenoplossing volgens de stappen 1.2.1-1.2.4. Bewaar collageen-gecoate vaten niet langdurig.
- Maak een verdunning van 1:100 van type I collageenoplossing (3 mg / ml bouillon) met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 0, 03 mg / ml. Meng goed.
- Bedek de celkweekkolven (punt 4) met 160 μL/cm2 (d.w.z. 4 ml per T25-kolf) en doorlatende steuninzetstukken (punt 5) met 455 μL/cm2 (d.w.z. 150 μL per inzetstuk van 6,5 mm) van de bereide collageenoplossing.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 2-24 uur.
- Verwijder de collageenoplossing met een pipet of vacuümaspirator voordat u cellen zaait. Was het vat niet voordat u cellen zaait.
- Bereid CRC-media (Conditional Reprogramming Cell) voor door componenten32 in tabel 1 te combineren. Filter steriliseren met behulp van een vacuümfiltersysteem op fles. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
- Voeg op de dag van gebruik de humane epidermale groeifactor, ROCK-remmer en antibiotica toe zoals aangegeven in tabel 1.
| Bestanddeel | Volume |
| DMEM, hoge glucose | 156,7 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | 313,3 ml |
| Hydrocortison | 55,6 μL |
| Insuline | 1,25 ml |
| Cholera toxine | 21 μL |
| Adenine | 1,2 ml |
| HI-FBS | 25 ml |
| Penicilline-Streptomycine | 5 ml |
| Humane epidermale groeifactor | 1 μL/ml |
| ROCK-remmer | 1 μL/ml |
| Fungizone | 2 μl/ml |
| Tobramycine | 2 μL/ml |
| Ceftazidimhydraat | 4 μL/ml |
| Gentamicine oplossing | 1 μL/ml |
Tabel 1: Componenten voor 500 ml voorwaardelijke herprogrammeringscelmedia
2. Verzameling van nasale inferieure turbinaatborstels
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol vereist een verzamelbuis (50 ml) met nasale celverzamelingsmedia, cytologieborstels, weefsels en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Vermijd poetsen tijdens een infectie van de bovenste luchtwegen. Er is een klein risico op bloedingen, dat verhoogd is als er een ontsteking aanwezig is. Als het doel van het poetsen is om luchtwegepitheelplaten te verkrijgen voor ex vivo CBF-metingen, moet het borstelen minimaal 6 weken na een infectie van de bovenste luchtwegen plaatsvinden; idealiter meer dan 10 weken na infectie35.
- Bereid de nasale celverzamelmedia voor (sectie 1) en houd de buis op ijs.
- Beschrijf de procedure aan de deelnemer als ongemakkelijk. Leg uit dat er tijdens het poetsen een volledig gevoel in het neusgat wordt gevoeld, vergelijkbaar met het springen in de oceaan / het zwembad en water dat in de neusholte stroomt. Adviseer deelnemers dat de procedure de productie van tranen als reflex zal induceren.
- Beoordeel welke positionering geschikt is voor de deelnemer. Leg de deelnemer in rugligging als er een onderzoeksbank beschikbaar is, omdat rugligging voorkomt dat het hoofd van de deelnemer tijdens de procedure van de borstel van de borstel wordt verplaatst. U kunt de deelnemer ook naast een muur plaatsen, waar ze hun hoofd tegenaan kunnen drukken.
- Inspecteer de neusholte. Noteer septumafwijking, poliepen en andere anatomische afwijkingen die de passage van de borstel in de neusholte kunnen beïnvloeden en het bloedingsrisico kunnen verhogen.
- Reinig de neus van overtollig slijm door deelnemers te vragen hun neus in een tissue te snuiten.
- Vraag de deelnemer om door zijn mond te ademen. Neem een cytologieborstel in de dominante hand. Terwijl u het vijfde cijfer op de kin van de deelnemer laat rusten om de hand te verankeren, steekt u de cytologieborstel in de neusholte van de deelnemer (figuur 2). Steek de borstel op ~45° in het gezicht van de deelnemer om door de neus meatus te gaan.
- Draai de borstel rechtop zodat deze loodrecht op het gezicht van de deelnemer staat. Beweeg de borstel zachtjes maar stevig tegen de zijwand van de neus onder het inferieure turbinaat totdat deze zich in het midden tot achterste deel van het inferieure turbinaat bevindt.
OPMERKING: Vermijd over-insertie; als een plotselinge daling van de weerstand wordt gevoeld, is de neusholte binnengedrongen en moet de borstel worden ingetrokken totdat de weerstand opnieuw door de proceduralist wordt gevoeld. - Draai de borstel 360° tot drie keer. Verwijder de borstel voorzichtig in omgekeerde richting van de inbrengmanoeuvre, zodat cellen niet loskomen van het penseel.
- Plaats de borstel in de voorbereide opvangbuis met nasale celverzamelmedia. Plaats de opvangbuis op ijs.
- Herhaal het poetsen in het tweede neusgat als de deelnemer het ermee eens is/een groot aantal cellen nodig is (bijvoorbeeld om celkweek te initiëren).
OPMERKING: Hetzelfde neusgat kan opnieuw worden geborsteld als er geen zichtbare bloedcellen op de borstel waren, waarbij echter wordt opgemerkt dat het risico op bloedingen enigszins is verhoogd met een tweede borsteling in hetzelfde neusgat.
Figuur 2: Verzameling van nasale epitheelcellen. Illustratie van de locatie van de cytologieborstel in het midden tot achterste deel van het inferieure turbinaat. Deze positie wordt bereikt door de borstel door de neusgaten te steken, de borstel in een hoek van 90° ten opzichte van het gezicht te draaien en de borstel langs de neusholte onder het inferieure turbinaat te leiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Voorbereiding van luchtwegepitheelplaten
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol vereist een verzamelbuis (cytologieborstel(sen) + 1 ml nasale celverzamelingsmedia) (sectie 2) en 96-well flat-bottomed plaat. Als u neusturbinaatborstels verzamelt met het oog op het in beeld brengen van luchtwegepitheelvellen, gebruik dan slechts 1 ml antibioticavrije nasale celverzamelingsmedia; anders zullen epitheliale vellen te verspreid zijn voor beeldvorming.
- Draai voorzichtig de verzamelbuis met de cytologieborstel(sen) om de luchtwegepitheelvellen van de borstel(sen) los te maken.
- Verzamel alle media en cellen met een P1000 pipet. Dispense 5-6 valt in een put van een 96-well flat-bottomed plaat. Herhaal dit voor ongeveer zeven putten.
- Breng de plaat over naar de microscoop volgens stap 7.1.4 en volg de rest van sectie 7 om de trilhaarslagfrequentie in beeld te brengen.
- Beeldepitheelbladen (figuur 1) en niet afzonderlijke niet-losgemaakte cellen, omdat is aangetoond dat de ciliaire functie verschilt tussen epitheelplaten en enkele niet-gehechte cellen5.
4. Uitbreiding en onderhoud van luchtwegepitheelcellen
- Luchtwegepitheel voorwaardelijke herprogrammering celexpansiecultuur
OPMERKING: Collageenoplossing gecoat vat (sectie 1), Bestraalde embryonale feedercellen van muizen (NIH-3T3), Conditional Reprogramming Cell (CRC) media (sectie 1), cytologieborstel(sen) in nasale celverzamelingsmedia (sectie 2).- Doorstraalde voedercellen in bereide met collageenoplossing beklede kweekvaten met een zaaidichtheid van 8.000 cellen/cm2 ten minste 2 uur en niet meer dan 72 uur voorafgaand aan cocultuur met luchtwegepitheelcellen (zie36 voor feedercelkweek en -bestraling).
- Breng de geborstelde cellen in de verzamelbuis (cytologieborstel(sen) + nasale celverzamelingsmedia) over naar de vortex op ijs. Bij een lage snelheid, vortexbuis 10 s aan, 10 s uit (houd ijs ertussen) om cellen van de borstel(sen) los te maken. Krachtige vortexing kan de levensvatbaarheid van cellen verminderen. Inspecteer de borstel(sen) om te controleren of het slijm nog vastzit. Als dat zo is, herhaal dan de vortexing.
- Breng de buis(en) op ijs terug naar de bioveiligheidskast. Gebruik een serologische pipet om de media van de verzamelbuis over te brengen naar een nieuwe buis (buis B), waarbij de cytologieborstels achterblijven. Centrifuge buis B bij 300 × g gedurende 7 min bij 4 °C.
- Verwijder buis B uit de centrifuge, gooi het supernatant weg. Als het slijm zichtbaar is, wast u de pellet met nog eens 5 ml nasale celverzamelmedia en centrifugeert u opnieuw.
- Voeg 1 ml CRC-media toe om de celpellet in buis B te resuspenderen. Gebruik een serologische pipet van 5 ml om cellen in een cirkelvormige beweging door een celzeef te laten gaan die bovenop een buis van 50 ml (buis C) is geplaatst.
- Herhaal dit meerdere keren om een suspensie met één cel te vormen. Verzamel de resterende media van de bodem van de zeef en integreer deze met de media. Gooi de celzeef weg.
- Gebruik een serologische pipet van 5 ml, neem 1 ml media uit buis C en breng deze over in een microcentrifugebuis.
- Neem 10 μL van deze celsuspensie en voeg deze toe aan de microcentrifugebuis die vooraf is gealiquoteerd met 10 μL trypan blue. Meng goed en gebruik onmiddellijk een geautomatiseerde celteller om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te registreren.
- Zaai de luchtwegepitheelcellen in de T25-kolf voorbezaaid met bestraalde voedingscellen.
- Onderhoud en dissociatie van luchtwegepitheelcellen
OPMERKING: CRC-media moeten worden opgewarmd tot 37 °C door ze in een temperatuurgecontroleerd laboratoriumwaterbad of een kralenbadapparaat te plaatsen voordat ze aan de cellen worden toegevoegd.- Controleer cellen onder de celkweekmicroscoop (4× objectieve lens) regelmatig op hechting, verontreiniging, morfologie en samenvloeiing.
- Verander CRC-media elke tweede dag. Wanneer geherprogrammeerde cellen worden waargenomen (figuur 1) en er geen besmetting aanwezig is, vermindert of onttrekt u antibiotica.
- Wanneer cellen 90% confluency bereiken, gebruik dan een dubbele trypsinemethode32 om de cellen te dissociëren en voer een celtelling uit zoals beschreven in stap 4.1.8 (zie aanvullend bestand 2 voor celdissociatie en bevriezing).
5. Zaaien en differentiëren van luchtwegepitheelcellen en onderhoud van gedifferentieerde ALI-modellen
- Het zaaien van luchtwegepitheelcellen naar doorlaatbare steuninzetstukken
- Breng de met collageenoplossing gecoate permeabele steuninzetstukken (sectie 1) over van de CO2-incubator naar de bioveiligheidskast. Aspirateer de collageenoplossing en gooi weg. Voeg 750 μL expansiemedium (antibioticavrij) toe aan het basale compartiment van de doorlatende steuninzetstukken.
- Breng de gedissocieerde cellen of ontdooide cellen op ijs over naar de bioveiligheidskast. Voeg het volume expansiemedium toe dat nodig is om 200.000-250.000 cellen in 150 μL te zaaien aan het apicale compartiment van elke permeabele steuninzet.
- Voorzichtig zijn om geen bubbels te creëren; meng goed om ervoor te zorgen dat de cellen homogeen en in suspensie zijn. Voeg 150 μL van de celsuspensie toe aan de apicale zijde van elk permeabel steunelement.
- Resuspensie de cellen na het zaaien van elke drie permeabele steuninzetstukken om een homogene celsuspensie te behouden.
- Om de twee dagen totdat een confluente celmonolaag is gevormd (meestal op dag 4 na het zaaien), gooit u de media weg en voegt u vers expansiemedium toe dat is opgewarmd tot kamertemperatuur (RT, 15-25 °C).
- Differentiatie van luchtwegepitheelcellen op het lucht-vloeistof raakvlak
- Warme ALI media (antibioticavrij) tot RT (15-25 °C).
- Verwijder het expansiemedium en verander in differentiatiemedia (ALI) op zowel apicale als basale compartimenten.
- Na 2 dagen cultuur in ondergedompelde ALI-media, aspirateer en gooi de media weg.
- Voeg 750 μL ALI-media alleen toe aan het basale compartiment om een lucht-vloeistofinterface te creëren.
OPMERKING: Als na 1 week cultuur de monolaag niet confluent is en er nog steeds gaten worden waargenomen, hebben cellen mogelijk niet langer de capaciteit om uit te breiden naar de lege gebieden, overweeg dan om de luchtwegepitheelcellen weg te gooien.
- Onderhoud van gedifferentieerd ALI-model en slijmverwijdering
- Verander de apicale en basale media om de tweede dag tot volledige differentiatie (dag 21-25 post lucht-vloeistof interface-instelling).
- Was eenmaal per week slijm van de apicale kant volgens de stappen 5.3.3-5.3.4.
- Warme PBS tot RT (15-25 °C).
- Voeg 200 μL PBS toe aan het apicale compartiment. Incubeer in de CO2-incubator gedurende 10 minuten. Gebruik een aspiratieapparaat of pipet om de PBS te verwijderen.
6. Driedimensionale luchtwegepitheelorganoïden
- Preparaten voor luchtwegepitheel organoïde cultuur
- Plaats 24-putplaat(en) in een CO2-incubator om 's nachts op te warmen tot 37 °C.
- Ontdooi een injectieflacon van 10 ml ECM (Materiaaltabel) op ijs volgens de instructies van de fabrikant. Bereid 500 μL aliquots (eenmalig gebruik) om het aantal vries-dooicycli te minimaliseren.
OPMERKING: Gebruik ECM met een eiwitconcentratie > 10,5 mg / ml voor de beste kweekresultaten wordt aanbevolen. Lagere concentratie zal de desintegratie van de ECM-koepel versnellen en het optreden van apicale-naar buiten gerichte organoïden vergroten. - Gebruik de Airway Organoid Kit (Materiaaltabel) om Airway Organoid Seeding Media (AOSM) en Differentiation Media (AODM) voor te bereiden volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid luchtwegorganoïde basale media volgens tabel 2.
| Bestanddeel | Volume |
| Geavanceerde DMEM/F-12 | 500 ml |
| Hepes | 5 ml |
| Alanyl-glutamine | 5 ml |
| Penicilline-Streptomycine | 5 ml |
Tabel 2: Componenten van organoïde basale media van de luchtwegen
- Gebruik het aantal levende luchtwegepitheelcellen gedissocieerd in rubriek 4.2 om te berekenen hoeveel putten kunnen worden gezaaid met een zaaidichtheid van 10.000 cellen (zie tabel 3).
- Bereken het totale volume van ECM en AOSM dat nodig is om 1 x 50 μL van 90% ECM dome (45 μL ECM en 5 μL AOSM) per put te maken.
OPMERKING: De aanbevolen zaaidichtheid van 10.000 cellen per put is voor CRC-geëxpandeerde nasale epitheelcellen bij passage 1. Later passage cellen kan een hogere zaaidichtheid nodig hebben om de vorming van hetzelfde aantal organoïden te bereiken.
| Aantal putten | Aantal cellen | Aantal koepels | Vol van Matrigel ECM | Vol van AOSM |
| 1 | 10.000 cellen | 1 | 45 μL x 1,1 | 5 μL x 1,1 |
| 2 | 20.000 cellen | 2 | 90 μL x 1,1 | 10 μL x 1,1 |
| 5 | 50.000 cellen | 5 | 225 μL x 1,1 | 25 μL x 1,1 |
| ......... | ......... Cellen | ......... | .........μL x 1,1 | .........μL x 1,1 |
Tabel 3: Berekeningen voor het zaaien van luchtwegepitheelcellen in ECM-koepels
- Zaaien van luchtwegepitheelcellen in ECM-koepels
OPMERKING: Houd ECM te allen tijde op ijs en voer alle stappen uit met betrekking tot ECM op ijs, omdat ECM begint te stollen bij temperaturen >10 °C.- Resuspensie van de luchtwegepitheelcellen die in rubriek 4.2 zijn gedissocieerd met het berekende volume van 90% ECM volgens tabel 3.
- Houd de pipet in een hoek van 90° (verticaal) zo dicht mogelijk bij de bodem van de put en doseer 50 μL (naar de eerste stop om te voorkomen dat er bellen ontstaan) van de ECM-celsuspensie naar het midden van de put. Vermijd het aanraken van de muur van de put.
- Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 20 minuten totdat de ECU stolt. Terwijl de ECU stolt, warmt AOSM tot RT (15-25 °C) om te voorkomen dat deze bij toevoeging opnieuw liquificatie en desintegratie van de ECM-koepel veroorzaakt.
- Voeg 500 μL verwarmde AOSM toe aan elke put door de wand van de put af te geven. Pipetteer media niet rechtstreeks op de ECM-koepel.
- Verander media om de 2 dagen gedurende 4-7 dagen. Om media aan te zuigen, kantelt u de plaat in een hoek van 45° en zuigt u vanaf de onderrand van de put weg van de ECM-koepel.
- Start na 4-7 dagen organoïde differentiatie door 500 μL AODM (15-25 °C) aan elke put toe te voegen en gedurende 7 dagen om de 2 dagen van media te wisselen.
- Relating van luchtwegepitheelorganoïden op dag 7 van differentiatie
OPMERKING: Het hervormen van luchtwegepitheelorganoïden is noodzakelijk omdat de rand van de ECM-koepels geleidelijk uiteenvalt gedurende de kweekperiode van 2 weken. Luchtwegepitheelorganoïden aan de rand van de koepel kunnen verloren gaan (losraken in de media) of een apicale-naar-buiten gerichte oriëntatie hebben wanneer ze niet volledig zijn ingebed in ECU. De herindelingsstap "ruimt" ook de ECM-koepel op door cellen / puin te verwijderen dat niet met succes organoïden vormt.- Haal de media uit elke put. Voeg 500 μL organoïde basale media (voortaan basale media) toe aan elk putje.
- Gebruik de P1000-pipet omdat deze pipetpunt de grootste opening heeft en de kans op barsten van organoïden tijdens het pipetteren vermindert. Pas de pipet aan op 350 μL om te voorkomen dat er bellen ontstaan en pipetteer vervolgens voorzichtig op en neer om de ECM-koepel in elke put te verstoren. Verzamel alle ECU/basale media in een centrifugebuis van 15 ml.
- Spoel elk putje af met 500 μL koude basale media. Verzamel de basale media met eventuele resterende ECU en organoïden in dezelfde centrifugebuis van 15 ml als hierboven.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Van de drie lagen die zichtbaar zijn na centrifugeren - (1) supernatant, (2) ECM met cellulair puin (pluizig) en (3) pellet met organoïden - gooit u het supernatant en de ECM-laag weg en bewaart u de organoïde pellet.
- Voeg 1 ml koude basale media toe aan de organoïde pellet en pipetteer voorzichtig op en neer om eventuele resterende ECU's te scheiden. Voeg 6 ml koude basale media toe aan de buis en meng voorzichtig.
- Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Als overtollige ECU nog steeds zichtbaar is, herhaalt u stap 6.3.5- 6.3.6 om een nieuwe was uit te voeren.
- Resuspendeer de organoïde pellet met een geschikt volume van 90% ECM (gebruik AODM in plaats van AOSM) om ~30 organoïden per 50 μL van de koepel te platen.
- Controleer de dichtheid van organoïden onder de celkweekmicroscoop (4x objectieflens) na het beplateren van de eerste koepel. Voeg bij een te dichte 90% ecu extra toe om de gewenste dichtheid van ~30 organoïden te bereiken.
- Volg de stappen 6.2.3- 6.2.4 om ECM en voedingscellen elke tweede dag te stollen met 500 μL verwarmd aodm aan elke put gedurende nog eens 14 dagen totdat ze volwassen zijn (na 21 dagen differentiatie) met lumenvorming omgeven door naar binnen gericht pseudostratified epitheel met basale cellen, trilhaarcellen en bokaalcellen.
OPMERKING: De hier beschreven luchtwegepitheelorganoïden zijn terminaal gedifferentieerd en kunnen niet worden gepasseerd of gecryopreserveerd.
7. Beeldvorming van trilharen beat frequentie
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol vereist een live-cell imaging microscoop met een verwarmings- en vochtigheidsomgevingskamer, een snelle framesnelheid (>100 Hz) wetenschappelijke camera, een 20x lange werkafstandsdoelstelling en beeldbewerkingssoftware (raadpleeg de tabel met materialen voor aanbevolen apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt).
- Microscoopopopstelling
- Zorg ervoor dat het microscoopverwarmingssysteem is ingeschakeld en in evenwicht is tot 37 °C. Zet de microscoop aan. Stel het gas in op 5% CO2 via de CO2/lucht gasmenger.
- Vul de fles met vochtigheidsmodule waar de CO2 doorheen gaat bij met gezuiverd water. Stel de relatieve luchtvochtigheid in op 85% via de stage top controller zodat het water wordt verwarmd en de cellen worden voorzien van bevochtigde lucht. Breng de kamer gedurende 30 minuten in evenwicht.
- Plaats de microscoopplaatinzet in de microscoophouder.
- Breng de luchtwegepitheelcelmodellen over van de incubator naar de microscoop op een warmteblok of thermische kralen die in evenwicht zijn met 37 °C om het monster op een fysiologische temperatuur te houden.
- Plaats de kweekplaat met de luchtwegepitheelcelmodellen in de microscoopplaatinzet. Sluit de microscoop-omgevingskamer.
- Laat het monster gedurende 30 minuten in evenwicht komen in de voorverwarmde microscoopkamer van 37 °C en 5% co2.
OPMERKING: Een kortere evenwichtstijd kan voldoende zijn. Dit kan worden bepaald door een experiment uit te voeren om de tijd te bepalen die nodig is voor de stabilisatie van CBF (zie figuur 3).
Figuur 3: Stabilisatie van de ciliaire beatfrequentie in de live-cell imaging microscoop. Dot plots van gemiddelde trilhaar beat frequentie (CBF) in luchtwegepitheelcellen op de lucht-vloeistof interface (ALI-modellen) na overdracht in een live-cell imaging microscoop met een omgevingskamer. De kamer werd in evenwicht gehouden en gehandhaafd op 37 °C, 5% CO2 en een relatieve vochtigheid van 85% gedurende 30 minuten voordat de kamerdeur werd geopend en de kweekplaat in de microscoopplaat werd geplaatst. Celmodellen werden gedurende 60 minuten met aangegeven intervallen in beeld gebracht. ALI-modellen werden afgeleid van twee deelnemers met CF. Zes gezichtsveldbeelden (FOV) werden verkregen per ALI-model. Elke stip (blauw) vertegenwoordigt de gemiddelde CBF in 12-36 FOV-afbeeldingen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, met gemiddelde verbonden door een stippellijn. One-way analysis of variance (ANOVA) werd gebruikt om statistische verschillen te bepalen. P < 0,0001, ns: geen betekenis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Open tijdens de evenwichtsperiode achter de computer de acquisitiesoftware. Selecteer de objectieflens voor 20x lange werkafstand.
- Focus bij het microscoop-oculair op het celmodel (~Z = 8000 μm).
- Zorg ervoor dat de microscoop is ingesteld voor Kohler-verlichting, zodat gloeidraden van transmissielichtbronnen niet op het monstervlak worden gericht, waardoor artefacten in de beeldvorming worden vermeden. Volg hiervoor de stappen 7.1.10-7.1.13
- Sluit het irismembraan boven de condensor volledig af. Open langzaam het veld irismembraan en beweeg de condensor omhoog/omlaag totdat er een achthoekige vorm verschijnt.
- Als het irismembraan van het veld niet is uitgelijnd (d.w.z. de achthoek bevindt zich niet in het midden van het gezichtsveld (FOV)), lijnt u het uit op het midden met behulp van inbustoetsen.
- Zodra het veld irismembraan is uitgelijnd, past u de focus van de condensor aan om de achthoek scherp te stellen.
- Open het veld irismembraan totdat het niet meer te zien is binnen de FOV.
- Klik met behulp van de acquisitiesoftware op L100 om het lichtpad naar de poort te schakelen waar de camera is gemonteerd. Klik op de groene play (Run) knop om de microscoop FOV via de software te visualiseren. Controleer of de trilharen scherp zijn en pas indien nodig aan.
- Stel de microscoop met behulp van de acquisitiesoftware in met de volgende instellingen: Filters: leeg; Condensor: leeg; Formaat: geen binning; Belichtingstijd: 0,003 s; Uitleesmodus: rolluik; ROI: 512 × 512 pixels.
OPMERKING: De belichtingstijd is gebaseerd op de hoogste frequentie die moet worden gemeten, aangezien 1/belichtingstijd minstens tweemaal deze frequentie moet zijn. Bijvoorbeeld, als het maximale fysiologische bereik van trilharen kloppen = 30 Hz, dan 1 / belichtingstijd = 60, en belichtingstijd moet ≤ 0,016 s zijn. ROI is afhankelijk van de specificaties van de cameraframesnelheid. Selecteer een ROI die framesnelheden > 100 Hz vastlegt.
- Beeldacquisitie
- Om time-lapse-afbeeldingen uit het menu te verkrijgen, klikt u op Acquire en vervolgens op Fast Time Lapse. Selecteer in het pop-upvenster een opslaglocatie en bestandsnaam. Verkrijg 1000 frames.
- Klik op Toepassen. Klik op de groene afspeelknop (Uitvoeren) om een voorbeeld van de trilhaartjes in de microscoop FOV te bekijken en de Z-focus indien nodig aan te passen. Klik op Nu uitvoeren om de snelle time-lapse vast te leggen.
- Zodra de snelle time-lapse is vastgelegd, klikt u op de groene play (Run) knop om de microscoop FOV te visualiseren. Beweeg met behulp van de microscoopjoystick langs de X/Y-as naar een andere FOV.
- Pas de Z-focus aan om de trilharen scherp te stellen. Klik op Nu uitvoeren om nog een snelle time-lapse vast te leggen.
- Herhaal stap 7.2.3-7.2.4. Voor ALI-modellen en luchtwegorganoïden, afbeelding 6x FOV in elk van de 3x repliceermonsters. Voor luchtwegepitheelbladen, afbeelding minimaal 4x repliceren beelden per deelnemer.
8. Data-analyse en kwantificering van cbf
- Voorbereidingen voor data-analyse
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol vereist aangepaste analysescripts (aanvullend bestand 3), ONBEWERKTE afbeeldingsbestanden (verkregen in paragraaf 7.2), computersoftware en analysesoftware.- Installeer de computersoftware, bij voorkeur de nieuwste versie, op de analysecomputer. Zorg ervoor dat standaard computersoftware toolboxen (elmat, ops, datafun, uitools, datatypes, iofun, iotools, audiovideo) en Image and Signal Processing toolboxen zijn geïnstalleerd.
- Kopieer de aangepaste analysescripts 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' en 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' en 'support scripts' map naar de lokale schijf van de computer.
- Klik in de computersoftware op het tabblad Start. Klik vervolgens op Pad instellen (Figuur 4A-B).
- Klik in het pop-upvenster op Toevoegen met submappen (figuur 4C). Selecteer onder 'MATLAB-zoekpad' de mappen in Figuur 4D en klik vervolgens op Opslaan en sluiten (Figuur 4E-F).
- Controleer of de analysescripts zijn gekoppeld aan de computersoftware door te controleren of ze in het linkerdeelvenster verschijnen (figuur 4G).
- Breng de RAW-afbeeldingsbestanden (OME-indeling (Open Microscopy Environment) die zijn verkregen in paragraaf 7.2 over naar het lokale station van de computer.
OPMERKING: Voorbeelden van RAW-afbeeldingsbestanden zijn toegankelijk op: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.
Figuur 4: Computersoftware instellen voor data-analyse. (A) Open het tabblad Start . (B) Selecteer Pad instellen. (C) Selecteer Toevoegen met submappen. (D) Selecteer mappen met de analysescripts. (E) Selecteer Opslaan. (F) Selecteer Sluiten. (G) De analysescripts verschijnen in het linkerdeelvenster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Kwantificering van CBF door piekdetectie van het intensiteitsspectrum van enkele pixels
- Open de computersoftware. Klik op het analysescriptbestand 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' (figuur 5A).
- Klik op het tabblad Editor en klik vervolgens op de groene knop afspelen (Uitvoeren) om het script uit te voeren (Figuur 5B-C). Selecteer in het promptvenster de RAW-afbeeldingsbestanden die u wilt analyseren (afbeelding 5D).
- Voer de belichtingstijd van stap 7.1.15 in het promptvenster in voor acquisitietijd per frame en klik vervolgens op OK (Figuur 5E).
- Wacht ~ 15 minuten per bestand terwijl het script de CBF berekent en uitvoert in het 'AveSpectrum'-bestand (aanvullend bestand 4), dat automatisch wordt opgeslagen in dezelfde map als de RAW-afbeeldingsbestanden. Visualiseer de voortgang via de voortgangsbalk (figuur 5F).
Figuur 5: Analysescripts uitvoeren met behulp van computersoftware. (A) Open het script voor analyse van CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') of het maken van cilia beating movie ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Open het tabblad Editor . (C) Selecteer de groene knop afspelen (Uitvoeren) om het analysescript uit te voeren. (D) Een promptvenster vereist de selectie van bestanden voor analyse of het maken van films. (E) Tijdens het uitvoeren van het 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m'-script verschijnt er een prompt om handmatig de acquisitietijd per frame (s) in te voeren voor het geval het script voor het lezen van bestanden de metagegevens niet goed leest. (F) Voortgangsbalk die aangeeft dat de trilhaar-beatfrequentie wordt berekend. (G) Tijdens het uitvoeren van het script 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' verschijnt er een prompt om handmatig het type film in te voeren dat moet worden uitgevoerd (mp4 of avi), de filmframesnelheid (fps), of de immobiele component uit de filmgegevens wordt verwijderd ('y' of 'n'), de frametijd (s) en de pixelgrootte (micron) van de gegevens die naar de film zijn geëxporteerd. Het wordt aanbevolen om 'y' te gebruiken voor onbeweeglijke filtering, omdat het slijm of andere belemmerende immobiele lagen in de gegevens verwijdert. (H) Voortgangsbalk voor het aangeven van films die worden geëxporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voer het script 'GetFirstAmplitude.m' uit op de map met de 'AveSpectrum'-bestanden met behulp van het proces in stappen 8.2.1-8.2.2. Wacht tot het script het bestand 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' uitvoert, dat de frequentie bevat die de hoogste amplitude heeft en binnen het fysiologische bereik van luchtwegepitheel trilhaartjes klopt, ≥3 en <30 Hz.
- Kopieer de frequentiewaarden uit het bestand 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' en plot met behulp van wetenschappelijke analysesoftware.
OPMERKING: Een uitleg over hoe het aangepaste analysescript CBF kwantificeert, wordt gegeven in aanvullend bestand 5. Voorbeeld geanalyseerde datasets zijn toegankelijk op: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
- Een video exporteren van trilharen die slaan
- Open de computersoftware. Klik op het scriptbestand 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' (Figuur 5A) om het script te laden.
- Klik op het tabblad Editor en klik vervolgens op de groene knop afspelen (Uitvoeren) om het script uit te voeren (Figuur 5C). Selecteer in het promptvenster de RAW-afbeeldingsbestanden die naar filmbestanden moeten worden geëxporteerd (Afbeelding 5D).
- Voer de instellingen in tabel 4 in het pop-upvenster 'Film maken' in (figuur 5G).
- Wacht ~ 8 minuten per bestand terwijl het script de filmbestanden maakt en deze uitvoert naar de locatie van de RAW-afbeeldingsbestanden. Visualiseer de voortgang via de voortgangsbalk (Figuur 5H).
| Filmingangen | Beschrijving |
| Bestandstype | Voer het bestandstype in dat u wilt exporteren (mp4 of avi). |
| Framesnelheid | Voer de framesnelheid in waarmee de film moet worden geëxporteerd. Als u ~1000 frames per tijdreeks hebt verkregen, is het raadzaam om de framesnelheid ~30 fps in te stellen. |
| Onbeweeglijk filteren | Opties zijn 'y' of 'n'. Standaard is 'y' en het tijdfilterscript verwijdert, met behulp van Fourierruimte, alle onbeweeglijke componenten uit filmgegevens. Typisch, alle lagen cellen onder trilharen of onbeweeglijk slijm zullen een nul-frequentie offset component of tijd invariante component in het signaal bijdragen die kan worden uitgefilterd. |
| Acquisitietijd per frame | De acquisitietijd per frame van verkregen gegevens. Het wordt gebruikt om een tijdstempel in de film in seconden weer te geven. |
| Pixelgrootte | De pixelgrootte in micrometer wordt gebruikt om een schaalbalk in de film in micrometer weer te geven. |
Tabel 4: Invoerinstellingen voor het maken van films
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie van dit protocol bij het kwantificeren van CBF aan te tonen, worden de resultaten van CBF gemeten in luchtwegepitheelcel ALI-modellen afgeleid van drie deelnemers met CF en drie gezonde controledeelnemers gepresenteerd. Op dag 14 van de cultuurdifferentiatie waren kloppende trilharen aanwezig (figuur 6). Van dag 14 tot 21 van cultuurdifferentiatie werd een statistisch significante (P < 0,0345) toename van CBF waargenomen binnen beide cohorten. Op dag 21 van cultuurdifferentiatie was de gemiddelde CBF voor gezonde controledeelnemers (7,61 ± 0,11 Hz) significant hoger dan die van deelnemers met CF (6,75 ± 0,17 Hz). Om te begrijpen in hoeverre slijmaccumulatie en -verwijdering CBF beïnvloeden, werd CBF in dezelfde celmodellen in beeld gebracht na het verwijderen van slijm. In ALI-modellen van zowel gezonde personen als mensen met CF was er een statistisch significante (P < 0,0001) toename van CBF wanneer slijm werd verwijderd (figuur 6).
Figuur 6: Effect van slijmverwijdering op de slagfrequentie van trilhaartjes. Dot plots van gemiddelde trilhaar beat frequentie (CBF) in luchtwegepitheelcellen op de lucht-vloeistof interface (ALI-modellen), verkregen pre- en post-slijm washout op dag 14 en 21 van cultuurdifferentiatie. Slijmuitwassing werd uitgevoerd door het apicale celoppervlak te wassen met 200 μL verwarmd PBS. ALI-modellen werden afgeleid van gezonde deelnemers (n = 3) en deelnemers met CF (n = 3). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt een enkele beeldhoekafbeelding. Zes gezichtsveldbeelden werden verkregen in drie replica ALI-modellen. Elke deelnemer heeft een andere kleur. One-way analysis of variance (ANOVA) werd gebruikt om statistische verschillen te bepalen. P < 0,0001, ** P < 0,01, * P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Samenvatting van 18 publicaties die de diversiteit van cultuur- en live-cell imaging-parameters laten zien die worden gebruikt om de trilharenslagfrequentie te kwantificeren in organotypische modellen van het luchtwegepitheel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Dissociatie van luchtwegepitheelcellen voor differentiatie of cryopreservatie Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Aangepaste analysescripts Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Gegevensbestanden die worden uitgevoerd door een analysescript Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Beschrijving van het CBF-analysealgoritme Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn meerdere factoren die de kwantificering van CBF in nasale epitheliale vellen kunnen verdoezelen. Epitheliale vellen moeten binnen 3-9 uur na het verzamelen van monsters worden afgebeeld, omdat de ciliaire functie gedurende deze tijd het meest stabiel is37. Minder rode bloedcellen en puin zijn het meest optimaal voor beeldvorming, omdat deze interfereren met data-acquisitie. Bij het selecteren van een ROI voor beeldvorming is het belangrijk om een epithelial sheet te selecteren waarvan is aangetoond dat de rand niet is beschadigd of verstoord tijdens het verzamelen van het monster, en geen enkele niet-gehechte epitheelcel, omdat van deze variabelen is aangetoond dat ze CBF5 beïnvloeden. Het is ook noodzakelijk dat het epitheliale blad stationair is, omdat bewegingen de gegevensverzameling kunnen verdoezelen. Epithelial sheets in media oriënteren zich vaak in verschillende richtingen27. Aangezien eerder is aangetoond dat variaties in monsterkwaliteit, zoals verstoorde epitheliale randen, cbf5 beïnvloeden, is het waarschijnlijk dat de oriëntatie van het epitheliale blad ook cbf kan beïnvloeden. Een beperking van dit protocol is dat de impact van de epithelial sheet oriëntatie niet is beoordeeld. Dit zal naar verwachting een belangrijk studiegebied zijn voor verdere standaardisatie.
Volwassen ALI-modellen hebben een pseudostratified epitheel met de aanwezigheid van bokaalcellen die slijm produceren34. De abundantie en viscositeit van slijm beïnvloeden ciliaire functie 2,38. Onlangs werd aangetoond dat het verwijderen van opgehoopt slijm uit nasale epitheel ALI-celmodellen een toename van CBF3 veroorzaakte. Een cyclisch proces werd beschreven, waarbij de regeneratie van het slijm gedurende een periode van 24 uur CBF compromitteerde totdat het slijm werd verwijderd en CBF weer toenam. Om aan te tonen dat de herhaalbaarheid van CBF-metingen afhankelijk is van de regulatie van de fysiologische omgeving van trilharen, werd de impact van slijmverwijdering op CBF beoordeeld. Een statistisch significante verandering van 3,5 Hz in CBF werd waargenomen na slijmverwijdering. In vergelijking met deze resultaten rapporteerde een recente studie die de respons van trilharen op CFTR-modulerende verbindingen3 testte, een verandering in CBF die niet groter was dan die veroorzaakt door slijmverwijdering in ons modelsysteem. Dit benadrukt het belang van het reguleren van omgevingsvariabelen die cbf beïnvloeden, vooral als dit modelsysteem moet worden opgezet als een platform voor het bestuderen van de patiëntspecifieke respons op behandelingen in de toekomst. Als zodanig wordt aanbevolen om consistent te zijn in het verwijderen van slijm of het niet verwijderen voorafgaand aan beeldvorming om de invloed van deze omgevingsvariabele van kwantificeringen van CBF te beheersen.
Temperatuur is de dominante factor die schommelingen in CBF veroorzaakt. Van trilharen is eerder aangetoond dat ze gevoelig zijn voor schommelingen in fysiologische temperatuur in muizenlongplakken en neusbiopten39,40. Als zodanig is het van cruciaal belang om stappen te observeren die schommelingen in de omgevingstemperatuur minimaliseren bij het hanteren van monsters voor beeldacquisitie en ervoor zorgen dat cellen worden gestabiliseerd in de microscoopkamer van 37 °C voorafgaand aan beeldvorming. Bij het afbeelden van trilharen moeten de trilharen net boven de celmonolaag in beeld komen. Als het kloppen van trilharen niet waarneembaar is via lichtmicroscopie, kan het verwijderen van opgehoopt slijm door wassen met verwarmd PBS het kloppen van trilharen verhogen, omdat bekend is dat slijm trilharen belemmertdie kloppen 3. Een andere suboptimale situatie zal zijn als er een beweging van slijm over de cellen is, omdat dit de gegevensverzameling zal belemmeren. Een oplossing zou zijn om een ROI te selecteren zonder de zichtbare beweging van slijm. In de situatie waarin dit onvermijdelijk is, wordt het verwijderen van het slijm door wassen echter aanbevolen.
Een belangrijk voorbehoud om te overwegen is het selecteren van een geschikte camera en objectieve lens om de temporele en ruimtelijke Nyquist-bemonstering te vervullen. De lange werkafstandslens die in dit onderzoeksprotocol wordt gebruikt, maakt het mogelijk om een relatief groot gezichtsveld vast te leggen. Hierdoor kan CBF worden afgebeeld in intacte ALI-culturen, met een ruimtelijke resolutie van ~ 500 nm (NA0,45). Zo kan de ciliaire bundel ruimtelijk worden opgelost. Toch is een beperking van dit protocol dat het hele ALI-model niet kan worden afgebeeld met een resolutie die vatbaar is voor analyse. Als gevolg hiervan moet een ROI worden geselecteerd voor data-acquisitie. Om de vertekening te beperken die gepaard gaat met het selecteren van een ROI, wordt aanbevolen dat zes ROI's worden geselecteerd uit verschillende zones binnen elke permeabele ondersteuningsinzet. Dit is belangrijk omdat eerder is aangetoond dat trilharen niet synchroon in een steekproef kloppen, en CBF varieert tussen verschillende randen en ROI16,41, wat impliceert dat verschillende ROI's waarschijnlijk verschillende gemiddelde CBF-waarden hebben. Bovendien is het van essentieel belang om toegang te hebben tot hogesnelheidscamera's met een framesnelheid van ten minste 100 Hz, zodat elke tijdelijke gebeurtenis met een snelheid van 50 Hz kan worden opgelost door het Nyquist-bemonsteringscriterium. Een snelle sCMOS-camera met extreem weinig ruis die meting van één molecuul mogelijk maakt, wordt aanbevolen. Dit protocol wordt echter niet beperkt door het gebruik van dit type camera, zolang de camera voldoet aan de temporele bemonsteringsvereisten en de intensiteitsschommelingen van de pixels vastlegt die het gevolg zijn van ciliair kloppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.
Acknowledgments
We bedanken de deelnemers aan het onderzoek en hun families voor hun bijdragen. We waarderen de hulp van sydney children's hospitals (SCH) Randwick respiratoire afdeling bij de organisatie en verzameling van patiënt biospecimens - speciale dank aan Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson en Rhonda Bell. We erkennen de hulp van Iveta Slapetova en Renee Whan van de Katharina Gaus Light Microscopy Facility binnen het Mark Wainwright Analytical Centre in UNSW Sydney. Dit werk wordt ondersteund door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia en Sydney Children's Hospital Foundation. De auteurs willen Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health bedanken voor haar bijdrage en ondersteuning. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health is een non-profit samenwerkingsverbanden tussen het Sydney Children's Hospitals Network, het Children's Medical Research Institute en het Children's Cancer Institute. Het is opgericht met de steun van de NSW-regering om pediatrisch onderzoek te coördineren en te integreren. Luminesce Alliance is ook verbonden aan de Universiteit van Sydney en de Universiteit van New South Wales Sydney. KMA wordt ondersteund door een Australian Government Research Training Program Scholarship. LKF wordt ondersteund door de Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children's Hospital Foundation en UNSW University postdoctorale beurzen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
References
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).
- Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
- Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
- Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41 (2018).
- Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
- Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
- Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
- Salathe, M.
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).
- Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
- Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
- Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
- Ratjen, F., et al.
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
- Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
