Summary
Denne protokollen beskriver nasal epitelcelleinnsamling, utvidelse og differensiering til organotypiske luftveisepitelcellemodeller og kvantifisering av cilia beat-frekvens via live-celleavbildning og spesialbygde skript.
Abstract
Målinger av flimmerhårfunksjon (slagfrekvens, mønster) er etablert som diagnostiske verktøy for luftveissykdommer som primær ciliær dyskinesi. Imidlertid er den bredere anvendelsen av disse teknikkene begrenset av den ekstreme følsomheten til ciliærfunksjonen for endringer i miljøfaktorer, for eksempel temperatur, fuktighet og pH. I luftveiene hos pasienter med cystisk fibrose (CF) hindrer slimakkumulering cilia-juling. Flimmerfunksjonen har blitt undersøkt i primære luftveiscellemodeller som en indikator på CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) kanalaktivitet. Imidlertid er det funnet betydelig pasient-til-pasient-variasjon i cilia-slagfrekvens som respons på CFTR-modulerende legemidler, selv for pasienter med de samme CFTR-mutasjonene . Videre er virkningen av dysfunksjonell CFTR-regulert kloridsekresjon på ciliær funksjon dårlig forstått. Det er for tiden ingen omfattende protokoll som demonstrerer prøvepreparering av in vitro luftveismodeller, bildeinnsamling og analyse av Cilia Beat Frequency (CBF). Standardiserte kulturforhold og bildeoppkjøp utført i en miljøkontrollert tilstand vil muliggjøre konsistent, reproduserbar kvantifisering av CBF mellom individer og som svar på CFTR-modulerende legemidler. Denne protokollen beskriver kvantifiseringen av CBF i tre forskjellige luftveisepitelcellemodellsystemer: 1) innfødte epitelark, 2) luft-væske-grensesnittmodeller avbildet på permeable støtteinnlegg, og 3) ekstracellulære matrise-innebygde tredimensjonale organoider. De to sistnevnte replikerer in vivo lungefysiologi, med slagcilia og produksjon av slim. Ciliary-funksjonen er fanget ved hjelp av et høyhastighets videokamera i et miljøstyrt kammer. Spesialbygde skript brukes til analyse av CBF. Oversettelse av CBF-målinger til klinikken er tenkt å være et viktig klinisk verktøy for å forutsi respons på CFTR-modulerende legemidler per pasient.
Introduction
Målinger av Cilia Beat Frequency (CBF) og mønster er etablert som diagnostiske verktøy for luftveissykdommer som primær ciliær dyskinesi (PCD)1. Ved cystisk fibrose (CF) forårsaker dysfunksjon av CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR)-kloridkanalen dehydrering av væsken på luftveisoverflaten og nedsatt slimclearance2. Ciliærfunksjonen er undersøkt in vitro i primære luftveiscellemodeller som en indikator på CFTR-kanalaktivitet3. Imidlertid eksisterer det betydelig pasient-til-pasient-variasjon i CBF som respons på CFTR-modulerende legemidler, selv for pasienter med de samme CFTR-mutasjonene 3. Videre er virkningen av dysfunksjonell CFTR-regulert kloridsekresjon på ciliær funksjon dårlig forstått. Det er for tiden ingen omfattende protokoll som demonstrerer prøvepreparering av in vitro luftveismodeller, bildeinnsamling og analyse av CBF.
Neseepitelark isolert fra neseslimhinnebørsting brukes direkte til målinger av ciliær funksjon for PCD-diagnose4. Likevel, mens det ikke er kontroll over størrelsen eller kvaliteten på neseepitelarkene som er oppnådd, varierer CBF avhengig av om det måles på enkeltceller eller celleark og på epitelark cilierte kanter som er forstyrret eller uforstyrret5. Som sådan kan sekundære dyskinesier forårsaket av skade på celler under samlingen av neseslimhinnebørster påvirke CBF. Primær cellekultur av neseepitelceller og deres differensiering ved luft-væskegrensesnitt (ALI) eller i tredimensjonal kjellermembranmatrise i cilierte luftveisepitelorganoider gir opphav til cilia som er fri for sekundære dyskinesier 4,6,7,8. Luftveisepitelceller differensiert ved ALI (heretter kalt ALI-modeller) har blitt ansett som et viktig sekundært diagnostisk hjelpemiddel som replikerer ciliary beat-mønstrene og frekvensen av ex vivo nasal mucosal brushings6 og muliggjør analyse av ciliær ultrastruktur, beatmønster og beatfrekvens samtidig som pasientspesifikke defekter opprettholdes9 . Likevel eksisterer det uoverensstemmelser i metodene som brukes til å lage disse pseudostratifiserte, mucociliary differensierte cellemodellene. Ulike kulturutvidelses- eller differensieringsprotokoller kan indusere distinkte epitelfenotyper (ciliert eller sekretorisk)10 og resultere i signifikante forskjeller i CBF11. CBF har blitt kvantifisert i neseepitelbørster 4,6,12,13,14,15,16, luftveisepitelorganoider 14,17,18 og ALI-modeller 3,4,6,13,19,20, 21. Likevel, blant disse protokollene, er det store variasjoner, og ofte er mange parametere ikke kontrollert for. For eksempel, i noen studier, er CBF avbildet in situ mens cellene i ALI-modellen forblir på den permeable støtteinnsatsen 3,19,20,21, mens andre skraper cellene fra den permeable støtteinnsatsen og avbilder dem suspendert i media 4,6,13.
Videre er den bredere anvendelsen av teknikker som måler ciliær funksjon begrenset av den ekstreme følsomheten til ciliær funksjon for endringer i miljøfaktorer. Miljøfaktorer som temperatur22, fuktighet 23,24 og pH 25,26 påvirker ciliærfunksjonen og må reguleres for å kvantifisere CBF nøyaktig. De ulike fysiologiske parametrene som brukes på tvers av ulike laboratorier og hvordan de påvirker CBF har blitt gjennomgått tidligere27.
Ulike bildeteknologier og tilnærminger til CBF-målinger er rapportert i litteraturen. For PCD-diagnostikk brukes videomikroskopi til å måle ciliær funksjon28,29. Nylig ble en videoanalysealgoritme basert på differensiell dynamisk mikroskopi brukt til å kvantifisere både CBF og cilia-koordinasjon i luftveisepitelcelle ALI-modeller 3,30. Denne metoden gjør det mulig å karakterisere ciliær juling i luftveisepitelceller på en rask og helautomatisk måte, uten behov for å segmentere eller velge regioner. Ulike metoder for avbildning og kvantifisering av CBF kan bidra til forskjeller rapportert i CBF i litteraturen (tilleggsfil 1).
En protokoll fra kultur til kvantifisering for å effektivisere eksisterende metoder, standardisering av kulturforhold og bildeoppkjøp, utført under strenge miljøkontrollerte forhold, vil muliggjøre konsistent, reproduserbar kvantifisering av CBF innenfor og mellom individer.
Denne protokollen gir en fullstendig beskrivelse av samlingen av epitelceller, ekspansjons- og differensieringskulturforhold og kvantifisering av CBF i tre forskjellige luftveisepitelcellemodellsystemer av nasal opprinnelse: 1) innfødte epitelark, 2) ALI-modeller avbildet på permeable støtteinnlegg og 3) Ekstracellulær matrise (ECM)-innebygde tredimensjonale organoider (figur 1 ). Neseepitelceller oppnådd fra nasal dårligere turbinatbørster brukes som representanter for luftveisepitelet siden de er et effektivt surrogat for bronkialepitelceller31 mens de overvinner den invasive prosedyren forbundet med å samle bronkial børster. Metoden Conditional Reprogramming Cell (CRC) brukes til å utvide primære luftveisepitelceller for opprettelse av ALI-modeller og tredimensjonale organoider. Betinget omprogrammering av luftveisepitelceller til stamcellelignende tilstand induseres av samkultur med vekstarrestert fibroblastmatercellesystem og Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer32. Det er viktig at CRC-metoden øker populasjonsdoblingen i luftveisepitelceller samtidig som de beholder sitt vevsspesifikke differensieringspotensial33,34. I alle luftveisepitelcellemodeller fanges ciliary-funksjonen i et temperaturkontrollert kammer ved hjelp av et høyhastighets videokamera med standardiserte bildeinnsamlingsinnstillinger. Spesialbygde skript brukes til kvantifisering av CBF.
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt. Etter børsting av deltakernes nasale nedre turbinat, brukes luftveisepitelceller på en av to måter. Enten isoleres luftveisepitelark, og cilia beat-frekvensen avbildes umiddelbart, eller luftveienes epitelceller utvides via den betingede omprogrammeringscellemetoden. CRC-ekspanderte luftveisepitelceller differensieres for å etablere luftveisepitelceller ved et luft-væskegrensesnitt eller luftveisepitelorganoidkulturer. Avbildning av ciliær beatfrekvens oppnås ved hjelp av et levende celleavbildningsmikroskop med et varme- og fuktighetsmiljøkammer og et raskt bildefrekvens (>100Hz) vitenskapelig kamera. Dataanalyse utføres ved hjelp av spesialbygde skript. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studiegodkjenning ble mottatt fra Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Det ble innhentet skriftlig samtykke fra alle deltakere (eller deltakernes verge) før innsamling av biospecimens.
1. Forberedelser for etablering av luftveisepitelcellemodeller
- Forbered nasal celle samling media ved å kombinere 80% Dulbecco's Modified Eagle Medium og 20% Fetal Bovine Serum. Supplement med 1 μL / ml Penicillin / Streptomycin. Oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder.
- Belegg kolbene eller permeable støtteinnsatsene med kollagenoppløsning per behov ved å følge trinn 1.2.1-1.2.4. Ikke oppbevar kollagenbelagte kar på lang sikt.
- Lag en 1:100 fortynning av type I kollagenoppløsning (3 mg / ml lager) med fosfatbufret saltvann (PBS) til en sluttkonsentrasjon på 0,03 mg / ml. Bland godt.
- Belegge cellekulturkolber (avsnitt 4) med 160 μL/cm 2 (dvs. 4 ml per T25 kolbe) og permeable støtteinnlegg (avsnitt 5) med 455 μL/cm2 (dvs. 150 μL per 6,5 mm innsats) av den tilberedte kollagenoppløsningen.
- Inkuber ved 37 °C i 2-24 timer.
- Fjern kollagenoppløsningen med pipette eller vakuumsuger før såceller. Ikke vask fartøyet før såceller.
- Klargjør CRC-medier (Conditional Reprogramming Cell) ved å kombinere komponenter32 som er oppført i tabell 1. Filter steriliser ved hjelp av et vakuumfiltersystem med flaske. Oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
- På bruksdagen legges human epidermal vekstfaktor, ROCK-hemmer og antibiotika som angitt i tabell 1.
| Komponent | Volum |
| DMEM, høy glukose | 156,7 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | 313,3 ml |
| Hydrocortisone | 55,6 μL |
| Insulin | 1,25 ml |
| Koleratoksin | 21 μL |
| Adenin | 1,2 ml |
| HI-FBS | 25 ml |
| Penicillin-streptomycin | 5 ml |
| Menneskelig epidermal vekstfaktor | 1 μL/ml |
| ROCK-hemmer | 1 μL/ml |
| Fungizone | 2 μl/ml |
| Tobramycin | 2 μL/ml |
| Ceftazidimhydrat | 4 μL/ml |
| Gentamicin løsning | 1 μL/ml |
Tabell 1: Komponenter for 500 ml betinget omprogrammering av cellemedier
2. Samling av nasal dårligere turbinat børsting
MERK: Denne delen av protokollen krever et oppsamlingsrør (50 ml) med nasal celleinnsamlingsmedier, cytologibørster, vev og passende personlig verneutstyr. Unngå børsting under en øvre luftveisinfeksjon. Det er liten risiko for blødning, som økes hvis betennelse er tilstede. Hvis formålet med børstingen er å oppnå luftveisepitelark for ex vivo CBF-målinger, bør børsting skje minst 6 uker etter øvre luftveisinfeksjon; ideelt sett mer enn 10 uker etter infeksjon35.
- Forbered oppsamlingsmediet for nesecellene (avsnitt 1) og hold tuben på is.
- Beskriv prosedyren til deltakeren som ubehagelig. Forklar at en full følelse er følt i neseboret under børstingen, som ligner på å hoppe i havet / bassenget og vann rushing inn i nesepassasjen. Gi deltakerne beskjed om at prosedyren vil indusere produksjonen av tårer som en refleks.
- Vurder hvilken posisjonering som passer for deltakeren. Legg deltakeren i liggende stilling hvis en eksamenssofa er tilgjengelig, siden liggende posisjonering forhindrer bevegelse av deltakerens hode vekk fra børsten under prosedyren. Alternativt kan du plassere deltakeren ved siden av en vegg, som de kan trykke hodet tilbake mot.
- Inspiser nesepassasjen. Legg merke til septalavvik, polypper og andre anatomiske abnormiteter som kan påvirke penselens passasje i nesepassasjen og øke blødningsrisikoen.
- Rengjør nesen av overflødig slim ved å be deltakerne om å blåse nesen inn i et vev.
- Be deltakeren om å puste gjennom munnen. Ta en cytologibørste i den dominerende hånden. Mens du hviler det femte sifferet på deltakerens hake for å forankre hånden, setter du cytologibørsten inn i deltakerens nesepassasje (figur 2). Sett børsten på ~ 45 ° til deltakerens ansikt for å passere gjennom nasal meatus.
- Drei penselen oppreist slik at den er vinkelrett på deltakerens ansikt. Før børsten forsiktig, men bestemt mot sideveggen av nesen under det nedre turbinatet til det er på midten til bakre del av det nedre turbinatet.
MERK: Unngå over-innsetting; Hvis et plutselig fall i motstand er følt, har nesesvelget blitt lagt inn, og børsten skal trekkes tilbake til motstanden igjen føles av proceduralisten. - Roter penselen 360° opptil tre ganger. Fjern børsten forsiktig i revers av innsettingsmanøveren, slik at cellene ikke løsnes fra børsten.
- Plasser børsten i det forberedte oppsamlingsrøret med nasal celleoppsamlingsmedium. Legg oppsamlingsrøret på is.
- Gjenta børstingen i det andre neseboret hvis deltakeren er enig / et stort antall celler er nødvendig (f.eks. for å starte cellekultur).
MERK: Det samme neseboret kan børstes igjen hvis det ikke var synlige blodceller på børsten, og merker seg imidlertid at risikoen for blødning er litt økt med en andre børsting i samme nesebor.
Figur 2: Oppsamling av neseepitelceller. Illustrasjon av plasseringen av cytologibørsten i midten til bakre del av det dårligere turbinatet. Denne posisjonen oppnås ved å sette børsten gjennom nares, dreie børsten til en 90 ° vinkel mot ansiktet og lede børsten langs nesepassasjen under det nedre turbinatet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. Forberedelse av luftveisepitelark
MERK: Denne delen av protokollen krever oppsamlingsrør (cytologibørste(r) + 1 ml nasal celleoppsamlingsmedium) (avsnitt 2) og 96-brønns flatbunnet plate. Hvis du samler neseturbinatbørster med det formål å avbilde luftveisepitelark, bruk bare 1 ml antibiotikafrie nesecelleinnsamlingsmedier; Ellers vil epitelark være for spredt for avbildning.
- Virvle oppsamlingsrøret som inneholder cytologibørsten(e) forsiktig for å løsne luftveisepitelarkene fra børsten(e).
- Samle alle medier og celler med en P1000-pipette. Dispenser 5-6 dråper i en brønn med en 96-brønns flatbunnet plate. Gjenta i omtrent syv brønner.
- Overfør platen til mikroskopet i henhold til trinn 7.1.4 og følg resten av avsnitt 7 for å avbilde cilia beat-frekvensen.
- Bildeepitelark (figur 1) og ikke enkeltstående ufestede celler siden det er vist at ciliærfunksjonen er forskjellig mellom epitelark og enkeltstående ufestede celler5.
4. Utvidelse og vedlikehold av luftveisepitelceller
- Luftveier epithelial betinget omprogrammering celle ekspansjon kultur
MERK: Kollagenoppløsning belagt kar (seksjon 1), bestrålte mus embryonale materceller (NIH-3T3), Conditional Reprogramming Cell (CRC) media (seksjon 1), cytologi børste (er) i nasal celle samling media (avsnitt 2).- Plate bestrålte materceller i forberedt kollagenoppløsning belagt kulturbeholder (er) med en såtetthet på 8000 celler / cm 2 minst2 timer og ikke mer enn 72 timer før samkultur med luftveisepitelceller (se36 for matercellekultur og bestråling).
- Overfør de børstede cellene i oppsamlingsrøret (cytologibørste(r) + nasal celleoppsamlingsmedium) til virvelen på is. På en lav hastighet, vortex rør 10 s på, 10 s av (holde på is i mellom) for å løsne celler fra børsten (e). Kraftig vorteksing kan redusere cellens levedyktighet. Inspiser børsten (e) for å sjekke om slimet fortsatt er festet. Gjenta i så fall virvelen.
- Overfør røret (e) på is tilbake til biosikkerhetsskapet. Bruk en serologisk pipette til å overføre mediet fra oppsamlingsrøret til et nytt rør (rør B), og etterlate cytologibørstene. Sentrifugerrør B ved 300 × g i 7 minutter ved 4 °C.
- Fjern rør B fra sentrifugen, kast supernatanten. Hvis slimet er synlig, vask pelleten med ytterligere 5 ml nasal celleinnsamlingsmedium og sentrifuge igjen.
- Legg til 1 ml CRC-medier for å resuspendere cellepelleten i rør B. Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette, pass celler gjennom en cellesikt plassert på toppen av et 50 ml rør (rør C) i en sirkulær bevegelse.
- Gjenta flere ganger for å danne en enkeltcellesuspensjon. Samle restmediet fra bunnen av silen og inkorporer det med mediet. Kast cellesikten.
- Bruk en 5 ml serologisk pipette, ta 1 ml media fra rør C og overfør den til et mikrosentrifugerør.
- Ta 10 μL av denne cellesuspensjonen og legg den til mikrosentrifugerøret pre-aliquoted med 10 μL trypanblå. Bland godt og bruk umiddelbart en automatisert celleteller for å registrere celleantall og levedyktighet.
- Frø luftveisepitelcellene inn i T25-kolben forsådd med bestrålte materceller.
- Vedlikehold og dissosiasjon av luftveisepitelceller
MERK: CRC-medier må varmes opp til 37 °C ved å plassere det i et temperaturkontrollert laboratorievannbad eller et perlebadapparat før det tilsettes cellene.- Kontroller celler under cellekulturmikroskopet (4× objektivlinsen) regelmessig for vedlegg, forurensning, morfologi og sammenløp.
- Bytt CRC-medier annenhver dag. Når omprogrammerte celler observeres (figur 1) og det ikke er noen forurensning tilstede, reduseres eller seponeres antibiotika.
- Når celler når 90% konløpens, bruk en dobbel trypsinmetode32 for å dissosiere cellene og utføre et celletall som beskrevet i trinn 4.1.8 (se tilleggsfil 2 for celledissosiasjon og frysing).
5. Såing og differensiering av luftveisepitelceller og vedlikehold av differensierte ALI-modeller
- Såing av luftveisepitelceller til permeable støtteinnlegg
- Overfør kollagenoppløsningsbelagte permeable støtteinnsatser (avsnitt 1) fra CO2-inkubatoren til biosikkerhetsskapet. Aspirer kollagenoppløsningen og kast den. Tilsett 750 μL ekspansjonsmedium (antibiotikafritt) til basalrommet i de permeable støtteinnsatsene.
- Overfør de dissosierte cellene eller tinte cellene på is til biosikkerhetsskapet. Legg volumet av ekspansjonsmedium som trengs for å frø 200.000-250.000 celler i 150 μL til det apikale rommet til hver permeabel støtteinnsats.
- Å være forsiktig så du ikke lager bobler; Bland godt for å sikre at cellene er homogene og i suspensjon. Tilsett 150 μL av cellesuspensjonen på den apikale siden av hvert permeable støtteinnlegg.
- Resuspender cellene etter sådd hver tredje gjennomtrengelige støtteinnsats for å opprettholde en homogen cellesuspensjon.
- Annenhver dag inntil et konfluent cellemonolag dannes (vanligvis innen dag 4 etter såing), kast mediet og tilsett friskt ekspansjonsmedium oppvarmet til romtemperatur (RT, 15-25 °C).
- Differensiering av luftveisepitelceller ved luft-væske-grensesnittet
- Varme ALI-medier (antibiotikafrie) til RT (15-25 °C).
- Fjern ekspansjonsmediet og bytt til differensieringsmedier (ALI) på både apikale og basale rom.
- Etter 2 dager med kultur i nedsenket ALI media, aspirere og kaste media.
- Legg til 750 μL ALI-medier til basalrommet bare for å skape et luft-væske-grensesnitt.
MERK: Hvis monolaget etter 1 ukes kultur ikke er sammenflytende og hull fortsatt observeres, kan det hende at celler ikke lenger har kapasitet til å utvide seg til voidområdene, vurder å kaste bort luftveisepitelceller.
- Vedlikehold av differensiert ALI-modell og slimfjerning
- Bytt apikale og basale medier annenhver dag til full differensiering (dag 21-25 etter etablering av luft-væskegrensesnitt).
- En gang i uken, vask slim fra den apikale siden ved å følge trinn 5.3.3-5.3.4.
- Varm PBS til RT (15-25 °C).
- Tilsett 200 μL PBS i det apikale rommet. Inkuber i CO 2-inkubatoren i 10 minutter. Bruk en aspirasjonsenhet eller pipette for å fjerne PBS.
6. Tredimensjonale luftveisepitelorganoider
- Forberedelser for luftveisepitelorganoidkultur
- Plasser 24-brønnsplate (er) i en CO 2-inkubator for å varme til 37 ° C over natten.
- Tine et 10 ml hetteglass med ECM (Table of Materials) på is i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered 500 μL aliquots (engangsbruk) for å minimere antall fryse-tine sykluser.
MERK: Bruk ECM med proteinkonsentrasjon >10,5 mg / ml for de beste kulturutfallene anbefales. Lavere konsentrasjon vil akselerere oppløsningen av ECM-kuppelen og øke forekomsten av apikale vendt utover organoider. - Bruk Airway Organoid Kit (Table of Materials) for å forberede Airway Organoid Seeding Media (AOSM) og Differensieringsmedier (AODM) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klargjør luftveisorganoide basalmedier i henhold til tabell 2.
| Komponent | Volum |
| Avansert DMEM/F-12 | 500 ml |
| HEPES | 5 ml |
| Alanyl-glutamin | 5 ml |
| Penicillin-streptomycin | 5 ml |
Tabell 2: Komponenter i luftveisorganoide basalmedier
- Bruk antall celler med levende luftveisepitel dissosiert i pkt. 4.2 til å beregne hvor mange brønner som kan sås med en såtetthet på 10 000 celler (se tabell 3).
- Beregn det totale volumet av ECM og AOSM som trengs for å lage 1 x 50 μL 90% ECM-kuppel (45 μL ECM og 5 μL AOSM) per brønn.
MERK: Den anbefalte såtettheten på 10 000 celler per brønn er for CRC-utvidede neseepitelceller ved passasje 1. Senere passasjeceller kan kreve høyere såtetthet for å oppnå dannelsen av samme antall organoider.
| Antall brønner | Antall celler | Antall kupler | Vol av Matrigel ECM | Vol av AOSM |
| 1 | 10 000 celler | 1 | 45 μL x 1,1 | 5 μL x 1,1 |
| 2 | 20 000 celler | 2 | 90 μL x 1,1 | 10 μL x 1.1 |
| 5 | 50 000 celler | 5 | 225 μL x 1,1 | 25 μL x 1,1 |
| ......... | ......... Celler | ......... | .........μL x 1.1 | .........μL x 1.1 |
Tabell 3: Beregninger for såing av luftveisepitelceller i ECM-kupler
- Såing av luftveisepitelceller i ECM-kupler
MERK: Hold ECM på is til enhver tid og utfør alle trinn som involverer ECM på is, siden ECM vil begynne å stivne ved temperaturer > 10 °C.- Bland luftveisepitelcellene dissosiert i pkt. 4.2 med det beregnede volumet på 90 % ECM i henhold til tabell 3.
- Hold pipetten i en 90 ° vinkel (vertikal) så nær bunnen av brønnen som mulig, dispenser 50 μL (til første stopp for å unngå å lage bobler) av ECM-cellesuspensjonen til midten av brønnen. Unngå å berøre veggen på brønnen.
- Inkuber platen ved 37 °C i 20 minutter til ECM stivner. Mens ECM stivner, varm AOSM til RT (15-25 ° C) for å forhindre at den forårsaker re-liquification og oppløsning av ECM-kuppelen ved tillegg.
- Tilsett 500 μL oppvarmet AOSM til hver brønn ved å dispensere ned veggen i brønnen. Ikke pipettemedier direkte på ECM-kuppelen.
- Bytt media hver 2. dag i 4-7 dager. For å aspirere medier, vipp platen i en 45 ° vinkel og aspirer fra den nederste kanten av brønnen vekk fra ECM-kuppelen.
- Etter 4-7 dager, start organoid differensiering ved å legge til 500 μL AODM (15-25 ° C) til hver brønn og bytt media hver 2. dag i 7 dager.
- Replating av luftveisepitelorganoider på dag 7 av differensiering
MERK: Replating av luftveisepitelorganoider er nødvendig fordi kanten av ECM-kuplene gradvis oppløses i løpet av 2-ukers kulturperioden. Luftveisepitelorganoider i kanten av kuppelen kan gå tapt (løsne i media) eller ha apikal-vendt-utover-orientering når de ikke er fullt innebygd i ECM. Replating-trinnet "rydder også opp" ECM-kuppelen ved å fjerne celler / rusk som ikke lykkes med å danne organoider.- Aspirer media fra hver brønn. Tilsett 500 μL kalde luftveisorganoide basalmedier (heretter kalt basalmedier) til hver brønn.
- Bruk P1000-pipetten, siden denne pipettespissen har den største åpningen og vil redusere sannsynligheten for at organoider sprekker under pipettering. Juster pipetten til 350 μL for å unngå å lage bobler, og pipetter deretter forsiktig opp og ned for å forstyrre ECM-kuppelen i hver brønn. Samle alle ECM / basale medier i et 15 ml sentrifugerør.
- Skyll hver brønn med 500 μL kalde basalmedier. Samle basalmediet som inneholder gjenværende ECM og organoider i samme 15 ml sentrifugerør som ovenfor.
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Av de tre lagene som er synlige etter sentrifugering - (1) supernatant, (2) ECM som inneholder cellulært rusk (fluffy) og (3) pelletsholdige organoider - kast supernatanten og ECM-laget og bevar organoidpelleten.
- Tilsett 1 ml kalde basalmedier til organoidpelleten og pipetten forsiktig opp og ned for å skille eventuell gjenværende ECM. Tilsett 6 ml kalde basalmedier i røret og bland forsiktig.
- Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Hvis overflødig ECM fortsatt er synlig, gjenta trinn 6.3.5- 6.3.6 for å utføre en ny vask.
- Resuspender organoidpelleten med et passende volum på 90% ECM (bruk AODM i stedet for AOSM) til plate ~ 30 organoider per 50 μL av kuppelen.
- Kontroller tettheten av organoider under cellekulturmikroskopet (4x objektivlinsen) etter plating den første kuppelen. Hvis det er for tett, tilsett ytterligere 90% ECM for å oppnå ønsket tetthet på ~ 30 organoider.
- Følg trinn 6.2.3- 6.2.4 for å størkne ECM og mate celler annenhver dag med 500 μL oppvarmet AODM til hver brønn i ytterligere 14 dager til de når modenhet (etter 21 dagers differensiering) med lumendannelse omgitt av innovervendt pseudostratifisert epitel som inneholder basalceller, cilierte celler og begerceller.
MERK: Luftveisepitelorganoidene beskrevet her er terminalt differensiert og kan ikke passeres eller kryoreserveres.
7. Avbildning av cilia beat frekvens
MERK: Denne delen av protokollen krever et levende celleavbildningsmikroskop med et varme- og fuktighetsmiljøkammer, et vitenskapelig kamera med rask bildefrekvens (>100 Hz), et 20x langt arbeidsavstandsmål og bildebehandlingsprogramvare (se materialtabell for anbefalt utstyr som brukes i denne protokollen).
- Mikroskop satt opp
- Forsikre deg om at mikroskopvarmesystemet er slått på og likevektet til 37 °C. Slå på mikroskopet. Juster gassen til 5 % CO 2 via CO2/luftgassblanderen.
- Fyll på fuktighetsmodulflasken som CO2 passerer gjennom med renset vann. Sett den relative fuktigheten til 85% via trinntoppkontrolleren slik at vannet varmes opp og cellene tilføres fuktet luft. Balanser kammeret i 30 min.
- Plasser mikroskopplateinnsatsen i mikroskopholderen.
- Overfør luftveisepitelcellemodellene fra inkubatoren til mikroskopet på en varmeblokk eller termiske perler likevektet til 37 ° C for å opprettholde prøven ved en fysiologisk temperatur.
- Plasser kulturplaten som inneholder luftveisepitelcellemodellene i mikroskopplateinnsatsen. Lukk mikroskopets miljøkammer.
- La prøven balansere i det forvarmede mikroskopkammeret på 37 °C, 5 % CO2-fylt mikroskop i 30 minutter.
MERK: En kortere likevektstid kan være tilstrekkelig. Dette kan bestemmes ved å utføre et eksperiment for å identifisere tiden som kreves for stabilisering av CBF (se figur 3).
Figur 3: Stabilisering av ciliær beatfrekvens i levende celleavbildningsmikroskop. Punktplott av gjennomsnittlig cilia beatfrekvens (CBF) i luftveisepitelceller ved luft-væske-grensesnittet (ALI-modeller) etter overføring til et levende-celle-bildemikroskop med et miljøkammer. Kammeret ble likevektet og opprettholdt ved 37 °C, 5 % CO2 og relativ fuktighet på 85 % i 30 minutter før kammerdøren åpnes og kulturplaten plasseres i mikroskopplateinnsatsen. Cellemodeller ble avbildet i 60 minutter med angitte intervaller. ALI-modeller ble avledet fra to deltakere med CF. Seks synsfeltbilder (FOV) ble anskaffet per ALI-modell. Hver prikk (blå) representerer gjennomsnittlig CBF i 12-36 FOV-bilder. Data er representert som gjennomsnittlig ± SEM, med gjennomsnitt forbundet med en stiplet linje. Enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for å bestemme statistiske forskjeller. P < 0,0001, ns: ingen betydning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- I løpet av likevektsperioden åpner du anskaffelsesprogramvaren på datamaskinen. Velg objektivlinsen med 20 ganger lang arbeidsavstand.
- Ved mikroskopokularet fokuserer du på cellemodellen (~ Z = 8000 μm).
- Forsikre deg om at mikroskopet er satt opp for Kohler-belysning, slik at transmisjonspærefilamenter ikke er fokusert på prøveplanet, og unngår gjenstander i avbildningen. Følg trinnene 7.1.10-7.1.13 for dette
- Lukk feltet irismembranen helt over kondensatoren. Åpne irismembranen langsomt, og flytt kondensatoren opp/ned til en åttekantfigur vises.
- Hvis feltirismembranen ikke er justert (dvs. oktogonen ikke er i midten av synsfeltet (FOV)), justerer du den til midten ved hjelp av Allen-tastene.
- Når feltirismembranen er justert, justerer du kondensatorfokuset for å bringe oktogonen i skarpt fokus.
- Åpne feltet irismembran til det ikke lenger kan sees i FOV.
- Bruk anskaffelsesprogramvaren til å klikke på L100 for å bytte lysbane til porten der kameraet er montert. Klikk på den grønne play (Run) -knappen for å visualisere mikroskopet FOV via programvaren. Kontroller at flimmerhårene er i fokus og juster om nødvendig.
- Bruk anskaffelsesprogramvaren til å sette opp mikroskopet med følgende innstillinger: Filtre: tom; Kondensator: tom; Format: ingen binning; Eksponeringstid: 0,003 s; Avlesningsmodus: rullende lukker; Avkastning: 512 × 512 piksler.
MERK: Eksponeringstiden er basert på den høyeste frekvensen som må måles siden 1/eksponeringstiden må være minst dobbelt så høy som mulig. F.eks. hvis det maksimale fysiologiske området for flimmerhårslag = 30 Hz, må 1/eksponeringstid = 60, og eksponeringstiden være ≤ 0,016 s. ROI avhenger av kameraets bildefrekvensspesifikasjoner. Velg en ROI som fanger opp bildefrekvenser >100 Hz.
- Oppkjøp av bilder
- For å hente time-lapse-bilder fra menyen, klikk på Skaff deg og klikk deretter på Fast Time Lapse. I popup-vinduet velger du et lagringssted og filnavn. Skaff 1000 rammer.
- Klikk på Bruk. Klikk på den grønne avspillingsknappen (Kjør) for å forhåndsvise flimmerhårene i mikroskopet FOV og juster Z-fokuset om nødvendig. Klikk Kjør nå for å fange opp den raske time-lapse.
- Når den raske time-lapse er fanget, klikker du på den grønne play (Run) -knappen for å visualisere mikroskopet FOV. Bruk mikroskop-joysticken til å bevege deg langs X / Y-aksen til en annen FOV.
- Juster Z-fokuset for å få flimmerhårene i fokus. Klikk på Kjør nå for å fange en annen rask time-lapse.
- Gjenta trinn 7.2.3-7.2.4. For ALI-modeller og luftveisorganoider, bilde 6x FOV i hver av 3x replikere prøver. For luftveisepitelark, bilde minst 4x replikere bilder per deltaker.
8. Dataanalyse og kvantifisering av CBF
- Forberedelser for dataanalyse
MERK: Denne delen av protokollen krever tilpassede analyseskript (tilleggsfil 3), råbildefiler (anskaffet i avsnitt 7.2), et dataprogram og analyseprogramvare.- Installer databehandlingsprogramvaren, helst den nyeste versjonen, på analysedatamaskinen. Kontroller at standard verktøykasser for databehandlingsprogramvare (elmat, ops, datafun, uitools, datatyper, iofun, iotools, audiovideo) og verktøykasser for bilde- og signalbehandling er installert.
- Kopier de egendefinerte analyseskriptene 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' og 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' og 'support scripts'-mappen til den lokale stasjonen på datamaskinen.
- På databehandlingsprogramvaren klikker du på Hjem-fanen. Klikk deretter på Angi bane (figur 4A-B).
- I popup-vinduet klikker du på Legg til undermapper (figur 4C). Under 'MATLAB-søkebane' velger du mappene som vises i figur 4D, og klikker deretter på Lagre og lukk (figur 4E-F).
- Bekreft at analyseskriptene er koblet til dataprogramvaren ved å kontrollere at de vises i panelet til venstre (figur 4G).
- Overfør raw-bildefilene (åpent mikroskopimiljø (OME)-format) som er anskaffet i avsnitt 7.2, til datamaskinens lokale stasjon.
MERK: Eksempler på råbildefiler kan nås på: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.
Figur 4: Sette opp databehandlingsprogramvare for dataanalyse. (a) Åpne Hjem-fanen . (b) Velg Angi bane. (C) Velg Legg til undermapper. (D) Velg mapper som inneholder analyseskriptene. (e) Velg Lagre. (f) Velg Lukk. (G) Analyseskriptene vises i panelet til venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Kvantifisering av CBF ved toppdeteksjon av intensitetsspekteret til enkeltpiksler
- Åpne databehandlingsprogramvaren. Klikk på analyseskriptfilen 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' (figur 5A).
- Klikk på Editor-fanen, og klikk deretter på den grønne play (Run) -knappen for å kjøre skriptet (Figur 5B-C). I ledetekstvinduet velger du RAW-bildefilene som skal analyseres (figur 5D).
- Skriv inn eksponeringstiden fra trinn 7.1.15 i hurtigvinduet for anskaffelsestid per ramme, og klikk deretter på OK (figur 5E).
- Vent ~ 15 min per fil mens skriptet beregner og sender ut CBF i 'AveSpectrum' -filen (tilleggsfil 4), som automatisk lagres i samme mappe som råbildefilene. Visualiser fremdriften via fremdriftslinjen (figur 5F).
Figur 5: Kjører analyseskript ved hjelp av dataprogramvare. (A) Åpne skriptet for analyse av CBF ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') eller opprettelse av cilia beating movie ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m'). (B) Åpne Editor-fanen . (C) Velg den grønne avspillingsknappen (Kjør) for å kjøre analyseskriptet. (D) Et hurtigvindu krever valg av filer for analyse eller filmoppretting. (E) Mens du kjører skriptet 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m', vises en melding om å manuelt legge inn anskaffelsestiden per ramme (er) i tilfelle fillesingsskriptet ikke leser metadataene riktig. (F) Fremdriftslinje som indikerer cilia beat frekvens som beregnes. (G) Når du kjører skriptet LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m., vises en melding om å manuelt legge inn typen film som skal sendes ut (mp4 eller avi), filmbildefrekvensen (fps), om den immobile komponenten fjernes fra filmdataene ("y" eller "n"), rammetiden (e) og pikselstørrelsen (mikron) til dataene som eksporteres til filmen. Det anbefales å bruke 'y' for immobil filtrering, da det vil fjerne slim eller andre hindrende immobile lag i dataene. (H) Fremdriftsindikator for å angi film som eksporteres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Kjør skriptet 'GetFirstAmplitude.m' på mappen som inneholder 'AveSpectrum'-filene ved å bruke prosessen i trinn 8.2.1-8.2.2. Vent til skriptet sender ut filen 'FirstAmplitudeStacked.xlsx', som inneholder frekvensen som har høyest amplitude og er innenfor det fysiologiske området for luftveisepitel-cilia-juling, ≥3 og <30 Hz.
- Kopier frekvensverdiene fra filen 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' og plott ved hjelp av et vitenskapelig analyseprogram.
MERK: En forklaring på hvordan det egendefinerte analyseskriptet kvantifiserer CBF, finnes i tilleggsfil 5. Eksempler på analyserte datasett kan nås på: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.
- Eksporterer en video av flimmerhår som slår
- Åpne databehandlingsprogramvaren. Klikk på skriptfilen 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' (figur 5A) for å laste inn skriptet.
- Klikk på Editor-fanen , og klikk deretter på den grønne play (Run) -knappen for å kjøre skriptet (figur 5C). I ledetekstvinduet velger du raw-bildefilene som skal eksporteres til filmfiler (figur 5D).
- Skriv inn innstillingene som er beskrevet i tabell 4 , i popup-vinduet "Lag film" (figur 5G).
- Vent ~8 minutter per fil mens skriptet oppretter filmfilene og sender dem ut til plasseringen av raw-bildefilene. Visualiser fremdriften via fremdriftslinjen (figur 5H).
| Filminnganger | Beskrivelse |
| Filtype | Skriv inn filtypen du vil eksportere (mp4 eller avi). |
| Bildefrekvens | Skriv inn bildefrekvensen som filmen skal eksporteres med. Hvis du har ~ 1000 bilder per tidsserie anskaffet, anbefales det å stille bildefrekvens ~ 30 fps. |
| Filtrering av immobile enheter | Alternativene er 'y' eller 'n'. Standard er 'y', og tidsfiltreringsskriptet fjerner, ved hjelp av Fourier-plass, alle immobile komponenter fra filmdata. Vanligvis vil alle lag av celler under cilia eller immobile slim bidra med en nullfrekvensforskyvningskomponent eller tidsinvariant komponent i signalet som kan filtreres ut. |
| Anskaffelsestid per ramme | Anskaffelsestiden per ramme for innhentede data. Den brukes til å vise et tidsstempel i filmen i sekunder. |
| Pikselstørrelse | Pikselstørrelsen i mikrometer brukes til å vise en skalalinje i filmen i mikrometer. |
Tabell 4: Inndatainnstillinger for filmoppretting
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere effektiviteten av denne protokollen ved kvantifisering av CBF, presenteres resultatene av CBF målt i luftveisepitelcelle ALI-modeller avledet fra tre deltakere med CF og tre friske kontrolldeltakere. På dag 14 av kulturdifferensiering var det bankende flimmerhår til stede (figur 6). Fra dag 14 til 21 av kulturdifferensiering ble det observert en statistisk signifikant (P < 0,0345) økning i CBF i begge kohortene. På dag 21 av kulturdifferensiering var gjennomsnittlig CBF for friske kontrolldeltakere (7,61 ± 0,11 Hz) signifikant høyere enn for deltakere med CF (6,75 ± 0,17 Hz). For å forstå i hvilken grad slimakkumulering og fjerning påvirker CBF, ble CBF avbildet i de samme cellemodellene etter fjerning av slim. I ALI-modeller av både friske individer og de med CF var det en statistisk signifikant (P < 0,0001) økning i CBF når slim ble fjernet (figur 6).
Figur 6: Effekt av slimfjerning på cilia beat frekvens. Punktplott av gjennomsnittlig cilia beat frekvens (CBF) i luftveisepitelceller ved luft-væske-grensesnittet (ALI-modeller), oppnådd før og etter slimutvasking på dag 14 og 21 av kulturdifferensiering. Slimutvasking ble utført ved å vaske den apikale celleoverflaten med 200 μL oppvarmet PBS. ALI-modeller ble avledet fra friske deltakere (n = 3) og deltakere med CF (n = 3). Data er representert som gjennomsnittlig ± SEM. Hver prikk representerer et enkelt synsfeltbilde. Seks synsfeltbilder ble anskaffet i tre replikerende ALI-modeller. Hver deltaker er kodet med en annen farge. Enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for å bestemme statistiske forskjeller. P < 0,0001, ** P < 0,01, * P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Sammendrag av 18 publikasjoner som viser mangfoldet av kultur og levende celleavbildningsparametere som brukes til å kvantifisere cilia beatfrekvens i organotypiske modeller av luftveisepitelet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Luftveisepitelcelledissosiasjon for differensiering eller kryopreservering Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Tilpassede analyseskript Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Datafiler utsendt av analyseskript Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Beskrivelse av CBF-analysealgoritmen Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere faktorer som kan skjule kvantifiseringen av CBF i neseepitelark. Epitelark bør avbildes innen 3-9 timer etter prøvetaking siden ciliærfunksjonen er mest stabil i løpet av denne tiden37. Mindre røde blodlegemer og rusk er mest optimale for avbildning siden disse forstyrrer datainnsamlingen. Når du velger en ROI for avbildning, er det viktig å velge et epitelark som kanten ikke har blitt skadet eller forstyrret under innsamlingen av prøven, og ikke en eneste ufestet epitelcelle, siden disse variablene har vist seg å påvirke CBF5. Det er også nødvendig at epitelarket er stasjonært fordi bevegelser kan skjule datainnsamling. Epitelark i media orienterer seg ofte i ulike retninger27. Siden det tidligere er vist at avvik i prøvekvalitet, for eksempel forstyrrede epitelkanter, påvirker CBF5, er det sannsynlig at orienteringen av epitelarket også kan påvirke CBF. En begrensning ved denne protokollen er at virkningen av epitelarkorienteringen ikke er vurdert. Dette forventes å være et viktig fagområde for videre standardisering.
Eldre ALI-modeller har et pseudostratifisert epitel med tilstedeværelse av begerceller som produserer slim34. Overflod og viskositet av slimpåvirkning ciliær funksjon 2,38. Det ble nylig vist at fjerning av akkumulert slim fra neseepitelial ALI-cellemodeller forårsaket en økning i CBF3. En syklisk prosess ble beskrevet, hvor regenerering av slimet over en 24-timers periode kompromitterte CBF til slimet ble fjernet og CBF økte igjen. For å demonstrere at repeterbarheten av CBF-målinger er betinget av reguleringen av det fysiologiske miljøet til cilia, ble virkningen av slimfjerning på CBF vurdert. En statistisk signifikant 3,5 Hz endring i CBF ble observert etter slimfjerning. Sammenlignet med disse resultatene rapporterte en nylig studie som testet ciliarespons på CFTR-modulerende forbindelser3 en endring i CBF ikke større enn den som skyldes slimfjerning i vårt modellsystem. Dette understreker viktigheten av å regulere miljøvariabler som påvirker CBF, spesielt hvis dette modellsystemet skal etableres som en plattform for å studere den pasientspesifikke responsen på behandlinger i fremtiden. Som sådan anbefales det å være konsekvent i enten å fjerne slim eller ikke fjerne det før avbildning for å kontrollere påvirkningen av denne miljøvariabelen av kvantifiseringer av CBF.
Temperatur er den dominerende faktoren som forårsaker svingninger i CBF. Cilia har tidligere vist seg å være følsomme for svingninger i fysiologisk temperatur i muselungeskiver og nesebiopsier39,40. Som sådan er det viktig å observere trinn som minimerer temperaturvariasjoner i miljøet ved håndtering av prøver for bildeinnsamling og sikrer at celler stabiliseres i mikroskopkammeret på 37 ° C før avbildning. Ved avbildning av cilia, bør cilia komme i fokus like over cellemonolaget. Hvis cilia-juling ikke kan observeres via lysmikroskopi, kan fjerning av akkumulert slim ved vasking med oppvarmet PBS øke cilia-juling siden det er kjent at slim hindrer cilia som slår3. En annen suboptimal situasjon vil være hvis det er en bevegelse av slim over cellene, da dette vil hindre datainnsamling. En løsning ville være å velge en avkastning uten synlig bevegelse av slim. Men i situasjonen der dette er uunngåelig, anbefales det å fjerne slimet ved vask.
Et viktig forbehold å vurdere er å velge et passende kamera og objektivobjektiv for å oppfylle den tidsmessige og romlige Nyquist-prøvetakingen. Den lange arbeidsavstandslinsen som brukes i denne studieprotokollen, gjør det mulig å fange et relativt stort synsfelt. Dette gjør at CBF kan avbildes i intakte ALI-kulturer, med en romlig oppløsning på ~ 500 nm (NA0.45). Som sådan kan ciliary bunten være romlig løst. Likevel er en begrensning av denne protokollen at hele ALI-modellen ikke kan avbildes med en oppløsning som er egnet til analyse. Som et resultat må en avkastning velges for datainnsamling. For å begrense skjevheten knyttet til valg av ROI, anbefales det at seks ROIer velges fra forskjellige soner innenfor hvert permeable støtteinnlegg. Dette er viktig da det tidligere er vist at cilia ikke slår synkront i en prøve, og CBF varierer mellom forskjellige kanter og ROI16,41, noe som innebærer at forskjellige avkastninger sannsynligvis har forskjellige gjennomsnittlige CBF-verdier. Videre er det viktig å ha tilgang til hurtigkameraer med en bildefrekvens på minst 100 Hz, slik at enhver tidsmessig hendelse som skjer med en hastighet på 50 Hz kan løses med Nyquist-samplingskriteriet. Et raskt sCMOS-kamera med ekstremt lite støy som tillater måling av enkeltmolekyler anbefales. Denne protokollen er imidlertid ikke begrenset av bruken av denne typen kamera, så lenge kameraet oppfyller tidsmessige prøvetakingskrav og fanger opp pikselintensitetsfluktuasjonene som følge av ciliær juling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker studiedeltakerne og deres familier for deres bidrag. Vi setter pris på hjelpen fra Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick respiratorisk avdeling i organisering og innsamling av pasientbiospecimens - spesiell takk til Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson og Rhonda Bell. Vi anerkjenner assistansen fra Iveta Slapetova og Renee Whan fra Katharina Gaus Light Microscopy Facility i Wainwright Analytical Centre ved UNSW Sydney. Dette arbeidet støttes av National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia og Sydney Children's Hospital Foundation. Forfatterne ønsker å anerkjenne Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health for sitt bidrag og støtte. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health er et non-profit samarbeidsprosjekt mellom Sydney Children's Hospitals Network, Children's Medical Research Institute og Children's Cancer Institute. Det er etablert med støtte fra NSW-regjeringen for å koordinere og integrere pediatrisk forskning. Luminesce Alliance er også tilknyttet University of Sydney og University of New South Wales Sydney. KMA støttes av et australsk regjeringsforskningsprogramstipend. LKF støttes av Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children's Hospital Foundation og UNSW University postgraduate award stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
| Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
| Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
| Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
| CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
| Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
| Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
| Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
| Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
| Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
| HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
| Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
| Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
| Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
| MATLAB | MathWorks | Computing software | |
| Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
| NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
| NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
| PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
| PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
| rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
| Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
References
- Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).
- Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells. Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).
- Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia. Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Pifferi, M., et al. Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis. European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).
- Lee, D. D. H., et al. Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PloS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Castillon, N., et al. Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture. Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).
- Jorissen, M., Bessems, A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension. Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- Pique, N., De Servi, B. Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study. Allergy, Asthma & Clinical Immunology. 14, 41 (2018).
- Chen, Q., et al. Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
- Ballenger, J. J., Orr, M. F. Quantitative measurement of human ciliary activity. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).
- Mercke, U. The influence of varying air humidity on mucociliary activity. Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).
- Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).
- Salathe, M.
- Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
- Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
- Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Feriani, L., et al. Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Martinovich, K. M., et al. Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics. Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).
- Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy. Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).
- Gentzsch, M., et al. Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).
- Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).
- Ratjen, F., et al.
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).
- Smith, C. M., et al. Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing. Chest. 140 (1), 186-190 (2011).
- Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
