Summary
Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.
Abstract
Retinopathien sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die das neurosensorische Gewebe des Auges betreffen. Sie sind gekennzeichnet durch Neurodegeneration, Gliose und eine fortschreitende Veränderung der Gefäßfunktion und -struktur. Obwohl der Beginn der Retinopathien durch subtile Störungen der visuellen Wahrnehmung gekennzeichnet ist, sind die Veränderungen im Gefäßplexus die ersten Anzeichen, die von Klinikern festgestellt werden. Das Fehlen oder Vorhandensein einer Neovaskularisation bestimmt, ob die Retinopathie entweder als nicht-proliferativ (NPDR) oder proliferativ (PDR) klassifiziert wird. In diesem Sinne versuchten mehrere Tiermodelle, spezifische vaskuläre Merkmale jedes Stadiums nachzuahmen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestimmen, die an Endothelveränderungen, neuronalem Tod und anderen Ereignissen in der Netzhaut beteiligt sind. In diesem Artikel werden wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren bereitstellen, die für die Messung der retinalen vaskulären Parameter bei Erwachsenen und Frühgeburtsmäusen am postnatalen Tag (P) 17 erforderlich sind. Wir werden die Protokolle zur Durchführung der retinalen Gefäßfärbung mit Isolectin GSA-IB4 in ganzen Halterungen für die spätere mikroskopische Visualisierung detailliert beschreiben. Wichtige Schritte für die Bildverarbeitung mit der Software Image J Fiji werden ebenfalls bereitgestellt, daher können die Leser Gefäßdichte, Durchmesser und Tortuosität, vaskuläre Verzweigung sowie avaskuläre und neovaskuläre Bereiche messen. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um vaskuläre Veränderungen sowohl bei nicht-proliferativen als auch bei proliferativen Retinopathien zu bewerten und zu quantifizieren.
Introduction
Die Augen werden von zwei arterio-venösen Systemen genährt: dem choroidalen Gefäßsystem, einem externen vaskulären Netzwerk, das retinales pigmentiertes Epithel und Photorezeptoren bewässert; und das neuroretinale Gefäßsystem, das die Ganglienzellschicht und die innere Kernschicht der Netzhaut bewässert1. Das retinale Gefäßsystem ist ein organisiertes Netzwerk von Gefäßen, die Nährstoffe und Sauerstoff an die Netzhautzellen liefern und Abfallprodukte ernten, um eine ordnungsgemäße visuelle Signalübertragung zu gewährleisten. Dieses Gefäßsystem weist einige Besonderheiten auf, darunter: das Fehlen einer autonomen Innervation, die Regulierung des Gefäßtonus durch intrinsische Netzhautmechanismen und den Besitz einer komplexen Netzhaut-Blut-Schranke2. Daher stand das retinale Gefäßsystem im Mittelpunkt vieler Forscher, die nicht nur die Vaskulogenese während der Entwicklung, sondern auch die Veränderungen und die pathologische Angiogenese, die diese Gefäße bei Krankheiten durchlaufen, umfassend untersucht haben3. Die häufigsten vaskulären Veränderungen, die bei Retinopathien beobachtet werden, sind Gefäßdilatation, Neovaskularisation, Verlust der vaskulären Arborisierung und Deformation der netzhautlichen Hauptgefäße, was sie zickzaggiger macht4,5,6. Eine oder mehrere der beschriebenen Veränderungen sind die frühesten Anzeichen, die von Ärzten erkannt werden können. Die vaskuläre Visualisierung bietet eine schnelle, nicht-invasive und kostengünstige Screening-Methode7. Die umfangreiche Untersuchung der im Gefäßbaum beobachteten Veränderungen wird bestimmen, ob die Retinopathie nicht proliferativ oder proliferativ ist und die weitere Behandlung. Die nicht-proliferativen Retinopathien können sich unter anderem mit abweichender vaskulärer Morphologie, verminderter Gefäßdichte, azellulären Kapillaren, Perizytentod, Makulaödemen manifestieren. Darüber hinaus entwickeln proliferative Retinopathien auch eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, extrazelluläres Remodeling und die Bildung von vaskulären Büscheln in Richtung der Glaskörperhöhle, die leicht abbauen oder eine Netzhautablösung induzieren8.
Einmal erkannt, kann die Retinopathie durch ihre Gefäßveränderungen überwacht werden9,10. Das Fortschreiten der Pathologie kann durch die strukturellen Veränderungen der Gefäße verfolgt werden, die die Stadien der Krankheit klar definieren11. Die Quantifizierung von Gefäßveränderungen in diesen Modellen ermöglichte es, Gefäßveränderungen und neuronalen Tod zu korrelieren und pharmakologische Therapien für Patienten in verschiedenen Phasen der Krankheit zu testen.
Im Lichte der obigen Aussagen sind wir der Ansicht, dass die Erkennung und Quantifizierung von Gefäßveränderungen in Retinopathiestudien von grundlegender Bedeutung ist. In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Parameter misst. Dazu werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Sauerstoff-induzierte Retinopathie-Mausmodell12, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie nachahmt13,14. In diesem Modell werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Hauptgefäße messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das Metabolische Syndrom (MetS) entwickelt, das eine nicht-proliferative Retinopathie induziert15. Hier werden wir die Gefäßdichte und Verzweigung bewerten.
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Protocol
C57BL/6J-Mäuse wurden gemäß den Richtlinien des ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research behandelt. Die experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) der Fakultät für Chemische Wissenschaften der Nationalen Universität Córdoba entworfen und genehmigt (Res. HCD 1216/18).
1. Herstellung von Pufferlösungen und Reagenzien
- Herstellung von 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS): 8 g Natriumchlorid (NaCl), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 14,4 g Dinatrium-Wasserstoffphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 2H2O) und 0,24 g Kalium-Dihydrogenphosphat (KH2PO4) zu 800 mL destilliertem Wasser geben. Rühren Sie die Lösung bis zur vollständigen Auflösung der Salze um. Stellen Sie den pH-Wert mit Chloridsäure (HCl) auf 7,4 ein und stellen Sie das Volumen mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf 1 L ein. Die Lösung wird filtriert und bei 4 °C gelagert.
- Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA): 40 g festes PFA zu 800 ml frisch zubereitetem PBS geben. Rühren Sie die Lösung in einer Heizplatte bei einer konstanten Temperatur von 60 °C. Fügen Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzu, bis PFA vollständig gelöst ist, und überprüfen Sie, ob der pH-Wert in einem Bereich von 7,2-7,4 gehalten wird. Füllen Sie das Volumen mit PBS auf 1.000 ml auf und mischen Sie es. Schalten Sie die Heizplatte aus und filtern Sie die Lösung, wenn ihre Temperatur unter 35 °C liegt. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C für bis zu 3 Tage.
VORSICHT: PFA ist schädlich, wenn es geschluckt oder eingeatmet wird und ist wahrscheinlich eine mutagene Verbindung. Verwenden Sie während des gesamten Prozesses Handschuhe und Gesichtsmaske und arbeiten Sie in einer Sicherheitskabine. - Herstellung von 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS): 6,1 g Tris und 9 g NaCl zu 800 mL destilliertem Wasser geben. Rühren Sie die Lösung bis zur vollständigen Auflösung der Salze um. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und stellen Sie das Volumen mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf 1 L ein. Die Lösung wird filtriert und bei 4 °C gelagert.
- Herstellung von TBS- 0,1% Triton X-100: 0,1 ml TritonX-100 bis 100 ml TBS zugeben. Vorsichtig mischen und bei 4 °C bis zu 1 Woche aufbewahren.
HINWEIS: Da Triton ein sehr dichtes Reinigungsmittel ist, schneiden Sie den Anschluss der Spitze für ein besseres Pipettieren leicht ab. - Herstellung von TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: 5 g BSA wiegen und TBS- 0,1% Triton X-100 Lösung bis zu einem Endvolumen von 100 ml hinzufügen. Vorsichtig umrühren. Aliquot und bei -20 °C bis zu 2 Monate lagern.
- Isolectin GSA-IB4 Alexa Fluor-488 Konjugat (Isolectin GSA-IB4): Gewicht 36,75 mg Calciumchloriddihydrat (CaCl2·2H2O) und zu 500 ml frisch zubereitetem PBS geben. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab um. 500 μL der CaCl2/PBS-Lösung pipettieren und in die Durchstechflasche geben, die 500 μg lyophilisiertes Isolectin GSA-IB4-Pulver enthält. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und aliquotieren Sie sie in 0,5 ml Röhrchen. Lagern Sie sie bei -20 °C lichtgeschützt.
- Poly(vinylalkohol) in Glycerin/Tris: 2,4 g Poly(vinylalkohol) wiegen, 6 g Glycerin zugeben und vorsichtig umrühren. Dann fügen Sie 6 ml Wasser hinzu und rühren Sie mehrere Stunden bei Raumtemperatur weiter. 12 mL vorgewärmte 0,2 M Tris-Lösung (pH: 8,5) zugeben und bei einer konstanten Temperatur von 50 °C für 10 min erhitzen und gelegentlich mischen. Zum Schluss wird die Lösung zur Klärung 15 min bei 5.000 x g zentrifugiert.
HINWEIS: Die Lösung bei Raumtemperatur abkühlen lassen, aliquotieren und bei -20 °C lagern.
2. Fluoreszierende Lektinfärbung
- Wenn Mäuse durch Einatmen von Kohlendioxid (CO2) opfern, enukleieren Sie die Augen mit einer Schere16. Fixieren Sie die enukleierten Augen mit frisch zubereiteten 4% PFA für 1 h bei Raumtemperatur (RT).
HINWEIS: Die Fixierung kann auch durch Inkubation der Augen in 4% PFA über Nacht (ON) bei 4 °C erfolgen. Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und des Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) der Fakultät für Chemische Wissenschaften der Nationalen Universität Córdoba (Res. HCD 1216/18) geopfert. - Entfernen Sie unter dem Seziermikroskop die Hornhaut mit einer Schere, indem Sie entlang des Limbus schneiden und die gesamte Netzhaut sezieren. Verwerfen Sie das vordere Segment des Auges und trennen Sie dann die Netzhaut von der RPE-Aderhaut.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die verbleibenden Ablagerungen und Hyaloidgefäße mit einer Pinzette aus der Netzhaut entfernen. - Legen Sie die Netzhaut in 200 μL Röhrchen. Anschließend wird die Netzhaut in 100 μL Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 5% Bovine Serum Albumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100 enthält, während 6 h bei 4 °C mit sanfter Bewegung im Shaker blockiert und permeabilisiert.
HINWEIS: Dieser Schritt kann für 2 h bei RT durchgeführt werden. - Dann drehen Sie den Schlauch um, um die Netzhaut in die Kappe zu legen und die Blocklösung mit einer Pipette zu entfernen.
- Fügen Sie 100 μL der Lösung hinzu, die 0,01 μg/μL Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4) enthält. Wickeln Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um die Proben vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Netzhaut mit der Lektinlösung ON bei 4 °C oder für 2 h bei RT mit sanfter Bewegung im Shaker.
- Waschen Sie die Netzhaut mit 100 μL TBS mit 0,1% Triton-X-100 für 20 min unter sanfter Bewegung im Shaker. Zum richtigen Waschen legen Sie die Netzhaut in die Kappe der Röhre, indem Sie sie umkehren. Bringen Sie das Rohr in seine stehende Position zurück und entfernen Sie das im Behälter verbleibende Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Legen Sie die Netzhaut in einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen PBS hinzu. Führen Sie unter dem Seziermikroskop vier gleich weit entfernte Schnitte von den Rändern der Netzhaut in Richtung Sehnerv durch.
- Um die Blütenblätter der Netzhaut zu entfalten, verwenden Sie eine Pinzette oder kleine Stücke Filterpapier. Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorseite nach unten zeigt.
- Entfernen Sie die restliche PBS des Objektträgers mit Filterpapier. Fügen Sie dann ein Montagemedium (Poly (Vinylalkohol) in Glycerin / Tris) und einen Deckglas hinzu. Lassen Sie es 1 h bei RT trocknen.
- Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt aufbewahren.
HINWEIS: Netzhaut kann auch in PBS bei 4 °C bis zur konfokalen Mikroskopievisualisierung gelagert werden.
3. Konfokale Mikroskopie-Visualisierung und Mikrofotografie-Erfassung
- Vor der Visualisierung inkubieren Sie die Dias für 10 minuten bei RT, die von Licht bedeckt sind.
- Legen Sie am konfokalen Mikroskop den Objektträger mit der Vorderseite nach unten in die Platte.
- Fokussieren Sie den oberen Plexus des retinalen Gefäßsystems und wählen Sie einen Bereich aus, um die Bildaufnahme zu starten.
- Stellen Sie allgemeine Laserparameter in der Software ein: Wellenlänge: 488 nm; Laserintensität; HV; Offset; Gewinnen.
HINWEIS: Laserintensität, PMT, Offset und Verstärkung können je nach den Bedingungen und der Verwendung der Lampe variieren. Die optimalen Einstellungen liefern ein klares Bild der Gefäße, wobei die Sättigung der Empfindlichkeit der Photomultiplierröhre vermieden wird, um eine lineare Beziehung zum Fluoreszenzsignal zu haben. - Stellen Sie andere Erfassungsparameter ein: Modus; Größe; Objektiv, ohne Zoom; Kein Kalman; Schrittweite.
HINWEIS: Für die Abbildung der Kontroll- und Versuchsproben müssen identische Erfassungsbedingungen verwendet werden. - Stellen Sie die Koordinaten in x- und y-Achse ein: Scannen Sie die Netzhaut 2x scharf. Wenn der Bereich Gefäße zeigt, wählen Sie ihn aus, indem Sie zweimal auf den Bereich klicken, um ihn für die spätere Bildaufnahme zu markieren.
HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, den Netzhautbereich auszuwählen, indem Sie dem oberen Gefäßplexus folgen, da die Fluoreszenz größerer Gefäße höher ist. - Bewegen Sie sich im Raster zu einem benachbarten Quadrat, fokussieren Sie die Netzhaut und wählen Sie den Bereich aus, wenn er entspricht. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der ausgewählte Bereich die gesamte Netzhaut umfasst.
- Wählen Sie einen Bereich aus und legen Sie die Koordinaten in der z-Achse fest, um die zu scannende Dickenausdehnung zu definieren. Visualisieren Sie dazu die Netzhaut 2x im Fokus; Gehen Sie mit dem Mikrometer an die Spitze der Netzhaut und klicken Sie in der Startposition auf Set . Bewegen Sie sich dann zur Unterseite der Netzhaut und klicken Sie auf Set in der Endposition.
- Wiederholen Sie Schritt 3.8 in jedem im Raster ausgewählten Bereich.
HINWEIS: Um den gescannten Bereich in der Tiefe zu überprüfen, drücken Sie an der Startposition Auf Gehe zu. Wenn Gefäße noch sichtbar sind, passen Sie die Position durch Bewegen des Mikrometers neu an und klicken Sie dann auf Festlegen. Wiederholen Sie den Vorgang an der Endposition. - Initialisieren Sie das automatisierte Scannen.
- Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bild.
- Wählen Sie das Serienformat aus, um das Bild als Mosaik aufzunehmen und mit der bevorzugten Erweiterung zu speichern. Schließlich wird das zusammengefügte Bild auf dem Bildschirm angezeigt.
4. Bildverarbeitung
- Gehen Sie in der ImageJ FIJI-Software zur Menüleiste und klicken Sie auf Datei > Öffnen. Wählen Sie das zu bearbeitende Bild aus. Wählen Sie im Fenster Importoptionen für Bioformate die Option OME-XML-Metadaten anzeigen aus und klicken Sie auf OK.
HINWEIS: Bilder mit ähnlichem Namen sollten in separaten Ordnern gespeichert werden. - Suchen Sie im Fenster OME-Metadaten nach den Pixelgrößeninformationen mit den Namen PhysicalSizeX, PhysicalSizeY und PhysicalSizeZ. Kopieren Sie diese Daten.
- Gehen Sie zur Bildkalibrierung zur Menüleiste und wählen Sie > Eigenschaften. Kopieren Sie die Informationen des Bildes in Schritt 4.2 und klicken Sie auf OK. Das Bild öffnet sich als Fenster mit mehreren Fotos, wobei jedes die mit einer z-Achse aufgenommenen Mikrofotografien darstellt.
- Weisen Sie dem Bild eine bevorzugte Lut zu, um eine Farbe an die fluoreszierende Markierung zu senden. Gehen Sie dazu zur Menüleiste und klicken Sie auf das LUT-Symbol .
- Um alle Stapel in einem einzelnen Bild zu visualisieren, gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild > Stapel > Z-Projekt.
- Wählen Sie im angezeigten Fenster Z-Projektion alle Stapel aus, in denen Gefäße visualisiert werden. Wählen Sie unter Projektionstyp die Option Durchschnittliche Intensität und klicken Sie auf OK.
HINWEIS: Das Ergebnis der Summe der Stapel wird in einem neuen Bild mit dem Namen AVG (Bildname) angezeigt. - Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast im resultierenden Bild an, um den Hintergrund zu reduzieren und Gefäße hervorzuheben. Gehen Sie in die Menüleiste und klicken Sie auf Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast. In den B- und C-Fenstern bewegen Sie die Balken, bis eine bessere Intensität beobachtet wird. Klicken Sie auf Übernehmen und speichern Sie die Änderungen.
- Kopieren Sie die für Helligkeit/Kontrast ausgewählten Parameter. diese müssen für alle Bilder identisch sein.
- Definieren Sie vor der Bildquantifizierung die Parameter, die gemessen werden sollen. Wechseln Sie in der Menüleiste zu Messungen analysieren > festlegen. In den hier beschriebenen Verfahren wird es notwendig sein, Fläche und Umfang zu erhalten (dies wird letztendlich auch benötigt, um Entfernungen zu messen). Klicken Sie auf OK.
- Laden Sie das für die Gefäßdichtequantifizierung erforderliche Plugin herunter17 und folgen Sie den Installationsanweisungen des Plugins.
- Fahren Sie mit der Quantifizierung eines bestimmten vaskulären Parameters fort.
5. Quantifizierung avaskulärer Flächen
- Wählen Sie in der Menüleiste das Zauberstab-Tool aus. Wählen Sie den Netzhautbereich aus, dem Gefäße fehlen.
HINWEIS: Je nach Toleranz können größere oder kleinere Bereiche ausgewählt werden. Um die Toleranz anzupassen, klicken Sie zweimal auf das Zauberstab-Werkzeugsymbol. Verwendeter Modus: Legacy. - Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 und 5.2 mit allen avaskulären Bereichen der Netzhaut.
- Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die avaskulären Bereichsinformationen zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
HINWEIS: In einigen Bildern kann man es vorziehen, die avaskulären Bereiche manuell auszuwählen. Wählen Sie in diesem Fall das Polygonauswahl-Werkzeug, zeichnen Sie kurze Entfernungen um den avaskulären Bereich und klicken Sie auf das Bild, wenn eine neue Entfernung beginnt. Schließen Sie den ausgewählten Bereich, indem Sie auf den ersten Punkt klicken. - Wiederholen Sie die Schritte 5.1, 5.2 und 5.3, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu messen.
- Berechnen Sie die avaskuläre Fläche der Netzhaut als Summe aller gemessenen avaskulären Bereiche geteilt durch die Gesamtfläche der Netzhaut.
6. Quantifizierung neovaskulärer Bereiche
- Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus.
- Zoomen Sie in das Bild, um Neoschiffe besser zu visualisieren. Wählen Sie die Neoschiffe nacheinander mit dem Zauberstabwerkzeug aus.
HINWEIS: Stellen Sie die Toleranz nicht höher als 20 ein, um die Auswahl eines einzelnen Neoschiffes sicherzustellen. Diese Toleranzstufe muss bei allen Bildquantifizierungen konstant bleiben. - Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 und 6.2 mit allen neovaskulären Bereichen der Netzhaut.
- Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die Flächendaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1, 6.2 und 6.3, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu quantifizieren.
- Berechnen Sie den neovaskulären Bereich der Netzhaut als Summe aller gemessenen Bereiche der Neoschiffe dividiert durch die Gesamtfläche der Netzhaut.
7. Quantifizierung des Gefäßdurchmessers
- Wählen Sie in der Menüleiste das Geradeaus-Werkzeug aus.
- Zoomen Sie in das Bild, um die Gefäßwand besser zu visualisieren. Führen Sie vor dem ersten Zweig drei Querlinien zum Hauptschiff durch. Dies muss geschehen, indem eine Linie von der Grenze einer Wand des Gefäßes zur gegenüberliegenden gezogen wird.
HINWEIS: Die Linie muss perfekt senkrecht zum Wandgefäß stehen, um Quantifizierungsfehler zu vermeiden. - Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2 in allen behältern, die quantifiziert werden müssen.
- Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die Entfernungsdaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
8. Quantifizierung der Gefäßtortuosität
- Klicken Sie in der Menüleiste mit der rechten Maustaste auf das Symbol Straight-Line Tool und wählen Sie Segmentierte Linie oder Freihandlinie. Zeichnen Sie eine Linie innerhalb des Gefäßes vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung, die der Gefäßform folgt.
HINWEIS: Die Linie muss der Gefäßform folgen, um Quantifizierungsfehler zu vermeiden. - Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
- Wählen Sie in der Menüleiste das Geradeaus-Werkzeug aus. Zeichnen Sie eine Linie vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung.
- Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
- Klicken Sie im ROI Manager auf Messen , um die Entfernungsdaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
- Berechnen Sie den Tortuositätsindex wie folgt: Entfernung, die mit segmentierter Linie erhalten wird, dividiert durch den mit gerader Linie erhaltenen Abstand.
9. Quantifizierung der Gefäßverzweigung
- Definieren Sie mit dem Ovalwerkzeug der Menüleiste einen Bereich, der auf alle experimentellen Bedingungen gleichermaßen angewendet wird. Der ausgewählte Bereich muss ein konzentrischer Kreis sein, der um den Sehnerv gezogen wird.
- Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
HINWEIS: In diesem Fall ist es empfehlenswert, den ROI zu speichern, da die Quantifizierung langsam ist und der identische ROI in allen Bildern verwendet werden muss. Klicken Sie dazu im ROI Manager auf MEHR > Speichern. - Zählen Sie manuell die Anzahl der primären Zweige, die aus hauptschiffen innerhalb des Auswahlbereichs entstehen.
- Wiederholen Sie die Schritte 9.2 und 9.3 in benachbarten Bereichen, wobei die Kriterien für die Sehnervenperipherie beibehalten werden.
10. Quantifizierung der Gefäßdichte
- Transformieren Sie das Bild in den 8-Bit-Modus.
- Gehen Sie in der Menüleiste zu Plugins und wählen Sie Gefäßanalyse > Gefäßdichte.
- Definieren Sie mit dem Quadrat-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, in dem die Gefäßdichte gemessen werden muss. Klicken Sie auf OK.
- Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
- Wiederholen Sie die Schritte 10.2, 10.3 und 10.4 in den benachbarten Bereichen, wobei Sie den ROI beibehalten, aber neunmal die Peripherie und das Zentrum der gesamten Netzhaut umfassen.
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Representative Results
Wie im Protokollabschnitt beschrieben, können Sie aus einem einzigen Fluoreszenzfärbungsassay die vaskuläre Morphologie erhalten und mehrere Parameter von Interesse quantitativ bewerten. Die Suche nach einer spezifischen Veränderung hängt von der Art der untersuchten Retinopathie ab. In diesem Artikel wurden avaskuläre und neovaskuläre Bereiche, Tortuosität und Dilatation in einem Mausmodell der proliferativen Retinopathie bewertet, während die vaskuläre Verzweigung und Dichte in einem MetS-Mausmodell analysiert wurden, das eine nicht-proliferative Retinopathie induziert.
Im ersten experimentellen Beispiel wurde das Mausmodell der sauerstoffinduzierten Retinopathie (OIR) verwendet, das der Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einigen Merkmalen des proliferativen Stadiums der diabetischen Retinopathie ähnelt. In diesem Modell werden Würfe mit ihrer stillenden Mutter in einer hyperoxischen Kammer vom postnatalen Tag (P) 7 bis P1218 gehalten. Intravitreale Injektionen wurden bei P12 durchgeführt, um die Wirksamkeit eines Arzneimittels als antiangiogenes Arzneimittel zu bestimmen (Zustand, der als Behandlung bezeichnet wird). Mäuse wurden auf P17 geopfert, dem Zeitpunkt der maximalen Neogefäßbildung19. Mäuse, denen Vehikel injiziert wurden, wurden als Kontrolle eingesetzt. Beide Proben wurden fixiert und mit Isolectin GSA-IB4 zusammen gefärbt. Nach der konfokalen Aufnahme wurden die Bilder wie oben angegeben mit der ImageJ FIJI-Software analysiert. Mit dem in Das Konfokalmikroskop integrierten Stitching-Modul wurde die gesamte Montierung als einzigartiges Bild betrachtet (Abbildung 1). Bei P17 ist es möglich, das zungenbeinische Gefäßsystem zu beobachten, ein vorübergehendes Gefäßsystem, das während des intrauterinen Lebens unerlässlich ist (Abbildung 1, weiße Pfeile)20.
Als Folge einer übermäßigen Sauerstoffzufuhr in der hyperoxischen Kammer stoppen OIR-Mäuse die physiologische Gefäßentwicklung und erzeugen avaskuläre Bereiche in der Netzhaut. Dann werden die avaskulären Bereiche als die Zonen definiert, denen retinale Blutgefäße fehlen (Abbildung 2). Aus den aufgenommenen Bildern können avaskuläre Flächen als Summe der Regionen ohne Gefäße dividiert durch die Gesamtfläche der Netzhaut quantifiziert werden. Bereiche mit mechanischen Beschädigungen zeigen auch das Fehlen von Schiffen. Um beschädigte Bereiche zu identifizieren, analysieren Sie die Integrität neuronaler Schichten mit Hoechst-Färbung.
Die avaskulären Bereiche der Netzhaut vermeiden die Sauerstoffzufuhr und daher wird eine starke pro-angiogene Reaktion eingestellt, die eine Neovaskularisierung induziert16. Neoschiffe sind kleinkalibrige Gefäße, die aus einem bereits vorhandenen Gefäß des Plexus vaskula superior stammen. Ihre Struktur ist unorganisiert, daher wachsen Neoschiffe als Büschel in Richtung der Glaskörperhöhle21. Wir berechneten die fläche, die von den büscheln der neoschiffe besetzt ist, indem wir den neovaskulären bereich der netzhaut dividiert durch die gesamtfläche der netzhaut quantifizierten (Abbildung 3). Da die Form und Größe von Neoschiffen variabel ist, können sie gelegentlich Trümmern und Artefakten ähneln. Um Neoschiffe zu unterscheiden, überprüfen Sie, ob das Büschel aus einem reifen Gefäß wächst.
Vaskuläre Dilatation und Tortuosität sind zwei weitere häufige Veränderungen, die sich negativ auf die Gefäßbiologie auswirken, da sie eine turbulente Durchblutung erzeugen. Für die Analyse der Dilatation haben wir den Durchmesser der Hauptgefäße in drei Höhen vor dem ersten Ast gemessen22,23 (Abbildung 4). Forscher müssen eine vorbestimmte Entfernung definieren, um den Gefäßdurchmesser zu messen, um die Variabilität zwischen den Ergebnissen zu reduzieren. Idealerweise sollte der am weitesten vom Sehnerv entfernte Punkt bei etwa 300 μm liegen. Wir schlagen vor, die Analyse durchzuführen und später durchschnittlich mindestens sechs Mäuse pro Erkrankung zu nehmen.
In Bezug auf die Tortuosität messen wir die Entfernung, die von den Hauptgefäßen zurückgelegt wird, die ihrer Form folgen, in Bezug auf den geraden Abstand zwischen dem Sehnerv und dem ersten Verzweigungspunkt24 (Abbildung 5). Wie wir im Bild sehen können, gibt es Heterogenität in der Geschmeidigkeit der Hauptgefäße. Um ein repräsentatives Ergebnis zu erhalten, müssen mindestens sechs Mäuse pro Bedingung quantifiziert werden.
Die neuesten Parameter, vaskuläre Verzweigung und Dichte, wurden im MetS-Modell mit nicht-proliferativer Retinopathie analysiert. Bei MetS sind sowohl Lipid- als auch Kohlenhydratstörungen mit retinalen Perizyten und Endothelzellendysfunktion und -tod verbunden, was zur Bildung azellulärer Kapillaren oder einer verminderten vaskulären Verzweigung führt25. In unserem Modell wurden ApoE-KO-Mäuse mit Fructose gefüttert, die dem Trinkwasser in einer Konzentration von 10% w/v zugesetzt wurde. Kontrolltiere haben gerade Leitungswasser erhalten. Nach 4 Monaten Diät wurden Mäuse geopfert und die Netzhaut wie zuvor angegeben verarbeitet. Für die Messung der Gefäßverzweigung definierten wir den Quantifizierungsbereich, indem wir einen konzentrischen Kreis zeichneten, und dann zählten wir nacheinander die primären Zweige, die aus einem zentralen Hauptgefäß hervorgingen (Abbildung 6).
Aus den aufgenommenen Bildern wurde die Gefäßdichte quantifiziert als die von Gefäßen eingenommene Fläche geteilt durch die Fläche des ROI (ein Quadrat von 0,015 mm2, siehe Abflachung in Abbildung 7), die in jeder Mikrofotografie an verschiedenen Stellen positioniert war, wie im Protokollabschnitt erläutert wurde. Vermeiden Sie die Quantifizierung von Bereichen mit mechanischer Beschädigung (Abbildung 7, weiße Pfeile). Wenn es mehr als zwei Bereiche mit Einstiche gibt, muss die Netzhaut verworfen werden.
Abbildung 1: Vaskuläre Färbung der Netzhaut ganz mit Isolectin GSA-IB4 markiert: Repräsentative konfokale Bilder von P17 OIR-Mäuse Netzhaut injiziert mit Vehikel oder Behandlung bei P12. Die fluoreszierende Färbung wurde in ganzen Netzhäuten mit Isolectin GSA-IB4 Alexa 488 gemäß Protokoll durchgeführt. Avaskuläre Bereiche (AV) und neovaskuläre Bereiche (NV) sind indiziert. Maßstabsleiste: 500 μm. Weiße Pfeile zeigen das übrig gebliebene Hyaloid-Gefäßsystem. Gelbe Pfeile zeigen unvollständige Scanbereiche während der konfokalen Bildaufnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Quantifizierung avaskulärer Bereiche: (A) Repräsentative Bilder der gesamten Netzhaut am P17, die die GSA-IB4-Gefäßfärbung in OIR-Vehikel- und OIR-Behandlungsmäusen zeigen. Bereiche mit Vaso-Auslöschung sind gelb markiert. Maßstabsbalken: 500 μm. (B) Die AV-Fläche (%) wurde als Verhältnis der zentralen avaskulären Fläche zur gesamten Netzhautfläche quantifiziert. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *** S. < 0,001. Für jede Erkrankung wurden in der untersuchten Überlebenszeit mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung neovaskulärer Bereiche: (A) Repräsentative Bilder der gesamten Netzhaut am P17, die die GSA-IB4-Gefäßfärbung in OIR-Vehikel- und OIR-Behandlungsmäusen zeigen. Bereiche mit Neovaskularisation sind weiß gekennzeichnet. Maßstabsbalken: 500 μm. (B) Die NV-Fläche (%) wurde quantifiziert als das Verhältnis der von Neoschiffen besetzten Fläche zur gesamten Netzhautfläche. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *** S. < 0,001. Für jede Erkrankung wurden in der untersuchten Überlebenszeit mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung der vaskulären Dilatation: (A) Repräsentative Bilder der gesamten Netzhaut am P17, die die GSA-IB4-Gefäßfärbung in OIR-Vehikel- und OIR-Behandlungsmäusen zeigen. Linke Bereiche: FÜR die Quantifizierung ausgewählte ROIs. Rechte Tafeln: Zoom der ROIs, die gerade Linien zeigen, die in einem Hauptgefäß durchgeführt werden, um den Gefäßdurchmesser zu messen. Drei Linien wurden quer zum Schiff verfolgt und gemittelt. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Der Gefäßdurchmesser (%) wurde als der durchschnittliche Durchmesser quantifiziert, der in wichtigen Gefäßen der Netzhaut gemessen wurde. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. *p < 0,05. Für jede Erkrankung wurden in der untersuchten Überlebenszeit mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bestimmung des Tortuositätsindex: (A) Repräsentative Bilder der gesamten Netzhaut am P17, die die GSA-IB4-Gefäßfärbung in OIR-Vehikel- und OIR-Behandlungsmäusen zeigen. Linke Bereiche: FÜR die Quantifizierung ausgewählte ROIs. Mittlere Panels: Zoom der ROIs, die segmentierte Linien zeigen, die in einem Hauptgefäß vom Sehnerv bis zum ersten Verzweigungspunkt verfolgt werden. Rechte Tafeln: Zoom der ROIs, die gerade Linien zeigen, die in einem Hauptgefäß vom Sehnerv bis zum ersten Verzweigungspunkt verfolgt werden. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Der Tortuositätsindex wurde erhalten, indem der Abstand der segmentierten Linie zum Abstand der geraden Linie dividiert wurde. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. ns dargestellt, nicht signifikant. Für jede Erkrankung wurden in der untersuchten Überlebenszeit mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Quantifizierung der vaskulären Verzweigung: (A) Repräsentative Bilder ganzer Netzhäute, die eine isolektin-GSA-IB4-Gefäßfärbung bei ApoE-KO- und ApoE-KO + fructose-gefütterten Mäusen zeigen. Kreisförmige Quantifizierungsbereiche wurden gelb definiert. Maßstabsleiste: 100 μm, 100-fache Vergrößerung. (B) Die Anzahl der Zweige wurde quantifiziert als die Anzahl der primären Zweige von einem Hauptgefäß, da der Sehnerv zur Peripherie. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. ns dargestellt, nicht signifikant. Für jede Erkrankung wurden mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Quantifizierung der Gefäßdichte: (A) Repräsentative Bilder der gesamten Netzhaut des Mounts, die die Isolectin GSA-IB4-Gefäßfärbung bei ApoE-KO- und ApoE-KO + Fructose-gefütterten Mäusen zeigen. Das Quadrat von 0,015 mm2 Quantifizierungsfläche wurde gelb definiert. Maßstabsleiste: 100 μm, 100-fache Vergrößerung. (B) Die Gefäßdichte wurde als das Verhältnis des Gefäßbereichs zum gesamten ROI-Bereich quantifiziert, der in jeder Mikrofotografie neunmal an verschiedenen Stellen positioniert wurde. Weiße Pfeile zeigen Bereiche mit mechanischer Beschädigung. Für den statistischen Vergleich wurde der zweiseitige ungepaarte t-Test verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. ns dargestellt, nicht signifikant. Für jede Erkrankung wurden mindestens sechs Tiere eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Tiermodelle von Retinopathien sind leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Gefäßentwicklung, des Remodelings oder der pathologischen Angiogenese. Der Erfolg dieser Studien auf diesem Gebiet beruht auf dem einfachen Zugang zum Gewebe, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Techniken durchzuführen und Daten von In-vivo- und postmortalen Mäusen zu liefern26,27. Darüber hinaus wurde eine große Korrelation zwischen In-vivo-Studien und klinischen Analysen gefunden, die eine solide Rückverfolgbarkeit und Zuverlässigkeit dieser Modelle gewährleisten28. In diesem Artikel präsentieren wir eine einfache und robuste Beschreibung der Schritte zur Charakterisierung des vaskulären Netzwerks in Mausmodellen für retinale Gefäßerkrankungen. In der Literatur finden die Leser weitere mögliche Messgrößen und parallele Ansätze zur Quantifizierung der hier ausgewählten. Die kompilierten Protokolle haben viele Vorteile gegenüber anderen, weil sie reproduzierbar sind, und sie benötigen nur eine freie Software, um die Analyse durchzuführen (Image J Fiji).
Darüber hinaus sind diese Protokolle leicht von Studenten durchzuführen, die nicht über umfangreiche Kenntnisse des Programms verfügen, und die meisten Messungen benötigen keine zusätzlichen Plugins (außer der Gefäßdichte).
Probenextraktion und Fluoreszenzfärbungstechnik sind einfach und kurz29. Es ist sehr wichtig, mit frischen Netzhäuten zu arbeiten, obwohl sie bei 4 ° C in PBS mit Inhibitoren des Bakterienwachstums gelagert werden können. Da das Gewebe dünn und weich ist, zerfallen alte Proben häufig während der Inkubation oder beim Entfalten der Probe vor der Montage. Außerdem macht eine übermäßige Fixierung mit 4% PFA die Netzhaut übermäßig starr und spröde, aber dies hat keinen Einfluss auf die Lektinfärbung. Die Isolectin-GSA-IB4-Färbung ermöglicht es, das gesamte Gefäßnetzwerk in jeder Schicht, einschließlich Neogefäßen und proliferierenden Endothelzellen, sichtbar zu machen. Andere Marker, wie CD 31, erfordern die Inkubation der Probe mit konzentrierten Antikörpern und sie haben mehr Hintergrund. Auf der anderen Seite neigt der Fluoreszenzfarbstoff in der Angiographie dazu, aus den Gefäßen zu diffundieren, was die Variabilität des Gefäßkalibers und der Tortuositätsquantifizierung erhöht. Ein Nachteil von Isolectin GSA-IB4 ist, dass es auch Mikrogliazellen markieren kann30. Vorsicht ist geboten, wenn intravitreale Injektionen oder andere experimentelle Verfahren durchgeführt werden, die eine übermäßige Infiltration induzieren, da die Mikrogliazellen Agglomerate bilden können.
Die Bildaufnahme könnte mit jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden. Die Verwendung eines motorisierten Plattenpaares mit einer Software, die das Stitching-Modul enthält, bietet eine vollständige Visualisierung der gesamten montierten Netzhaut in einem einzigen Bild. Achten Sie bei der Auswahl des Netzhautbereichs darauf, dass alle Extreme der Probe enthalten sind, da das Foto sonst unvollständig ist (Abbildung 1, gelbe Pfeile). Dies ist beispielsweise im Mausmodell des OIR nicht sehr relevant, da sich Gefäßveränderungen in der Nähe des Sehnervs befinden. Im Rattenmodell des OIR kann dieser Fehler zu einer ungenauen Quantifizierung führen, da sich die avaskulären und neovaskulären Bereiche neben dem Limbus befinden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, individuelle netzhautmikroskopische Aufnahmen zu machen. Der Benutzer kann sie später mit einer geeigneten Software als Puzzle organisieren. Es ist nicht empfehlenswert, das Epifluoreszenzmikroskop zu verwenden, insbesondere bei der Analyse der Verzweigung, da Gefäße in der gesamten Dicke der Netzhaut sprießen und einige Gefäße nicht in einem rein z-Stapel nachgewiesen werden.
Während der Bildverarbeitung mit ImageJ FIJI wird empfohlen, die Software erst zu aktualisieren, wenn alle Bilder quantifiziert sind, um identische Bedingungen in der Software zu erhalten. Die Kalibrierung der Bilder (Zuweisung der Pixelgröße in Mikrometern) ist ein kritischer Schritt, da diese Protokolle die Quantifizierung von Entfernungen und Flächen implizieren. Wenn der Benutzer mit dem Programm vertraut ist, kann er neben dem Zauberstabwerkzeug auch andere Werkzeuge zur Auswahl des neovaskulären und des avaskulären Bereichs erkunden. Das Polygonauswahlwerkzeug ist besonders nützlich, um avaskuläre Bereiche zu messen, die bei der Montagestufe in zwei Teile geschnitten wurden. Andere Forscher haben spezifische Plugins entwickelt, um die Auswahl von Neogefäßen basierend auf der Fluoreszenzintensität dieser Strukturen zu automatisieren. Diese Methoden sind schneller und weniger mühsam, obwohl empfohlen wird, vor der Quantifizierung zu überprüfen, ob kleine, weniger glänzende Neoschiffe ausgewählt wurden31. Die Bereiche der Neoschiffe fluoreszieren intensiver als die umgebenden normalen Gefäße. Mit dem Zauberstab-Werkzeug werden Bereiche ausgewählt, die ähnlich gefärbt sind, und die Toleranz bestimmt, wie ähnlich farblich die ausgewählten Pixel sind. Wenn ein Neoschiff von ähnlicher Intensität wie normale Gefäße ist, kann die Toleranz nach unten angepasst werden, um die Empfindlichkeit gegenüber subtilen Intensitätsunterschieden zu erhöhen. Obwohl die Neogefäßauswahl in jeder Probe mit einem identischen Schwellenwert durchgeführt wird, zeichnen sich einige Neogefäße durch eine geringe Fluoreszenzintensität aus. In diesem Fall ist eine geringere Toleranz für die richtige Auswahl erforderlich.
Tortuosität und Dilatation sind Entfernungsmessungen. Eine umfassende Untersuchung des Gefäßbaums ist hilfreich, um Gefäße gleichen Typs (Arterien oder Venen) und Kalibers auszuwählen. Wir messen die Dilatation in Gefäßen in drei Höhen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Der Winkel der geraden Auswahl in Bezug auf die Gefäßwand ist ein weiterer relevanter Punkt, der zu berücksichtigen ist. Diese sollte so nah wie möglich an 90° liegen, um mögliche Fehler zu vermeiden. Beim Zeichnen der geraden Linie können benutzer das zoom-werkzeug verwenden, um sich dem schiff von interesse annähern.
Die Gefäßverzweigung kann auf Wunsch auch in zwei oder mehr Quantifizierungsbereichen unterschiedlicher Höhe gemessen werden. In diesem Fall sollten die Forscher die analysierte Region der Netzhaut (zentrale, mittlere oder periphere Seite des Sehnervs) konservieren. Obwohl die Verzweigung in mehreren Tiermodellen der Retinopathie verändert ist, zeigen frühe Stadien der Retinopathie, die mit MetS assoziiert sind, immer noch keine solchen Veränderungen15. Für umfangreiche Studien an netztinalen Kapillaren des intermediären und tiefen Plexus und der Gefäßkeimung liefern 3D-Berechnungsmethoden wertvolle Daten über subtile Variationen in der Gefäßmorphologie und im Netzwerk32. Schließlich wird die Gefäßdichte durch die von Gefäßen eingenommene Fläche in Bezug auf die Gesamtfläche eines ausgewählten ROI bestimmt. Die Messung dieses Parameters erfordert die Verwendung eines Plugins und einer aktualisierten Version von ImageJ FIJI, wobei die Werkzeuge Auto Threshold und Geometry to Distance Map verfügbar sein müssen. Trotz dieser zusätzlichen Schritte ist das Plugin einfach zu bedienen, reproduzierbar und zuverlässig. Für die Messung der Gefäßdichte wurde ein ROI von 0,015 mm2 gewählt, um zehn Messungen der Fluoreszenzintensität in verschiedenen Regionen der Netzhaut durchzuführen. Diese Größe ermöglichte es uns, das gesamte Foto abzudecken und so einen repräsentativeren Durchschnittswert und seine Abweichung in jeder Netzhaut zu erhalten.
Trotz der Tatsache, dass diese Methodensammlungen nicht automatisiert sind und eine manuelle Auswahl der Parameter erfordern, sind sie in der Lage, quantitative und rigorose Daten der Netzhaut zu liefern. Die Haupteinschränkung in Bezug auf die oben vorgestellten Protokolle für vaskuläre Messungen beruht auf der Variabilität des Untersuchers bei der Analyse desselben Bildes. Um diese Verzerrung zu minimieren, ist es wichtig, die allgemeine Einstellung als Gefäßwandgrenzen, identifizierung von avaskulären Bereichen und Neogefäßen sowie Ausschlusskriterien für geschädigtes Gewebe im Voraus festzulegen. In Bezug auf die Gefäßtortuosität ist ein vereinbarter Ausgangspunkt neben dem Sehnerv erforderlich. Für Anfänger wird dringend empfohlen, die von zwei oder mehr Prüfern gesammelten Daten zu durchschnittlichen. Bei geschulten Anwendern wurden keine signifikanten Unterschiede in der Messung verschiedener Parameter gefunden, solange die Übereinstimmung in den Quantifizierungskriterien konstant bleibt. Ebenso können den aufgeführten Protokollen zusätzliche Parameter hinzugefügt werden, abhängig von den bei der Retinopathie festgestellten Gefäßveränderungen. Bei nicht-proliferativen Retinopathien sind die Messung der azellulären Kapillarzahl, der wandernden Perizyten, des Verhältnisses der Anzahl der Perizyten / Endothelzellen und der Permeabilität der Netzhautbarriere im Blut die frühesten Parameter, die im retinalen Gefäßsystem verändert sind33,34,35. Bei chronischen Modellen und leichten Retinopathien ist es ratsam, diese zusätzlichen Messungen einzubeziehen. Eine große Anzahl von gemessenen Parametern wird eine getreuere Landschaft der Ereignisse im Gefäßsystem liefern. Zusammenfassend haben wir in diesem Artikel klassische, gut etablierte und reproduzierbare Techniken gezeigt, um einige der relevantesten Parameter zu quantifizieren, die in der klinischen Praxis berücksichtigt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Wir danken Carlos Mas, María Pilar Crespo und Cecilia Sampedro von CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie, Soledad Miró und Victoria Blanco für die engagierte Tierpflege und Laura Gatica für die histologische Unterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication of FCQ) für die Videoproduktion und -edition und Paul Hobson für seine kritische Lektüre und sprachliche Überarbeitung des Manuskripts.
Dieser Artikel wurde durch Stipendien von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle an M.C.S.) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminuim foil | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A4503 | quality |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | C3306 | |
| Hydrochloric acid | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscope FV1200 | Olympus | FV1200 | with motorized plate |
| Covers | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissecting Microscope | NIKON | SMZ645 | |
| Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate | Merck | 119753 | |
| 200 µL tube | Merck | Z316121 | |
| Filter paper | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pHmeter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Potassium chloride | Merck | P9541 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 1,04,873 | |
| Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sodium chloride | Merck | S3014 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
References
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