Summary
تم إثبات تقنيات الجراحة المجهرية التفصيلية لإنشاء نموذج فأر تقنية الوريد الوداجي على المدى الطويل لجمع الدم المتسلسل في نفس الحيوان. تم رصد المعلمات الفسيولوجية والدموية خلال مرحلة تعافي الفئران. تم تطبيق هذا النموذج لدراسة الحرائك الدوائية للبوليفينول الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم دون التسبب في الإجهاد الحيواني.
Abstract
يعد أخذ عينات الدم في المختبر الصغيرة ضروريا لتحسين الرصاص الصيدلاني ولكنه يمكن أن يسبب ضررا كبيرا وإجهادا لحيوانات التجارب ، مما قد يؤثر على النتائج. القنية الوريدية الوداجية (JVC) في الفئران هي نموذج يستخدم على نطاق واسع لجمع الدم المتكرر ولكنه يتطلب تدريبا كافيا على مهارات الجراحة ورعاية الحيوانات. تفصل هذه المقالة الإجراءات الجراحية المجهرية لإنشاء والحفاظ على نموذج دائم للفئران JVC مع التركيز بشكل خاص على وضع وختم القنية الوداجية. تم تسليط الضوء على أهمية المراقبة الفسيولوجية (على سبيل المثال ، وزن الجسم والطعام وتناول الماء) والمعلمات الدموية ، مع النتائج المقدمة لمدة 6 أيام بعد الجراحة أثناء تعافي الفئران. تم تحديد ملف تعريف وقت تركيز البلازما الدوائية لحمض الإيلاجيك الفينول الطبيعي الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم في نموذج الفئران JVC.
Introduction
يعد الحصول المتكرر على عينات الدم من المختبر الصغيرة ، مثل القوارض والخنازير الغينية والأرانب ، جانبا مهما لتحسين الرصاص الصيدلاني وأيضا لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة في البحث 1,2. يتطلب خط الأنابيب لتطوير أدوات تشخيصية جديدة وصياغة دوائية (مثل اللقاح) الوصول إلى كميات مختلفة من الدم من أجل تقييم قوتها وأدائها في الجسم الحي ، مثل الحرائك الدوائية (PK) ، والسمية ، والحساسية3،4،5.
يتم تصنيف النهج المختبري لجمع عينات الدم على نطاق واسع إلى نوعين ، الجراحية وغير الجراحية6. من السهل نسبيا فهم النهج غير الجراحي للباحث ، والذي يتضمن تقنيات شائعة ، مثل ثقب القلب ، وثقب الجيوب الأنفية المدارية ، ونزيف الوريد الصافن والذيل. يمكن أخذ عينات دم متعددة من خلال بعض الطرق غير الجراحية ، ولكن حجم العينة صغير ويمكن أن يسبب جرحا جسديا وضغطا نفسيا للحيوانات1. من ناحية أخرى ، فإن النهج الجراحي هو البديل المفضل للوخز بالإبر الوريدية المتكرر ، وينطوي على وضع قنية مؤقتة أو دائمة في الأوعية الدموية للحيوانات7،8،9. يمكن سحب حجم الدم الكبير بشكل متكرر من خلال القنية في الفئران الواعية مع تجنب الإجهاد والألم بسبب تقنية المناولة وكبح النفس والتخدير7،8،10،11. ومع ذلك ، فإن زرع القنية يتطلب باحثا متمرسا لديه تدريب كاف من أجل جمع الدم بنجاح.
جمع الدم من خلال تقليب الوريد الوداجي (JVC) في الفئران هو الطريقة الأكثر استخداما على نطاق واسع لدراسة الدواء PK 6,10,12,13. ومع ذلك ، فإن إنشاء نموذج الفئران JVC يحتاج إلى ممارسة دقيقة لمهارات الجراحة المجهرية ومعرفة الرعاية والصيانة بعد الجراحة. على وجه الخصوص ، بعد الجراحة ، يتطلب الفئران إعطاء المسكنات ووقت كاف للتعافي للوصول إلى حالة فسيولوجية مستقرة لمزيد من التجارب13،14،15. على الرغم من أن زيادة وزن الجسم (أي >10 جم) هي مؤشر صالح وشائع التطبيق لتعافي الفئران ، إلا أنه ليس من غير المألوف أن الفئران لديها موت غير متوقع بعد العملية الجراحية بسبب الجفاف والعدوى والالتهابات ، والتي قد تكون خفية لملاحظة في البداية المبكرة14,15. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزال انسداد القسطرة في نموذج JVC يمثل مشكلة أثناء جمع الدم.
وقد أظهر هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراءات الجراحية المجهرية ل JVC في فأر مخدر مع التركيز بشكل خاص على تحديد الوريد الوداجي وعزله وتعليبه. يتم تسليط الضوء على أهمية الرصد الفسيولوجي والدموية للفئران خلال مرحلة الانتعاش. وأخيرا ، تم جمع عينات الدم التسلسلية من خلال القسطرة الوريدية لدراسة PK لحمض الإيلاجيك الفينول الطبيعي الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم مع ضعف التوافر البيولوجي (أي التركيز الجهازي المنخفض) للتحقق من نموذج الفئران JVC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات الموضحة أدناه كجزء من بروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة نورث وسترن للفنون التطبيقية (رقم 202101117).
1. التحضير قبل الجراحة (في اليوم السابق للجراحة)
ملاحظة: المحاليل المطلوبة: محلول ملحي عادي (0.9٪ ث / v كلوريد الصوديوم) ، ملحي هيبارين (1٪ ث / v الهيبارين الصوديوم) ، محلول قفل القسطرة ، دواء مضاد للالتهابات غير الستيرويدية (NSAID) ، مثل محلول ميلوكسيكام (2 ملغ / مل).
- إعداد الحلول
- Aliquot 200 ميكرولتر من محلول قفل القسطرة المعبأ مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل.
ملاحظة: يتكون محلول قفل القسطرة من محلول ملحي هيبارين (0.4٪ v/v هيبارين الصوديوم) ممزوج بالجلسرين (v/v,1:1). - امزج 1 غرام من الصوديوم الهيبارين في 100 مل من محلول ملحي طبيعي لإعداد 1٪ من محلول ملحي هيبارين.
- يذوب الميلوكسيكام في محلول ملحي طبيعي لإعداد محلول تركيز 2 ملغ / مل لتخفيف الألم بعد العملية الجراحية.
ملاحظة: يتم ترشيح محلول ملحي هيباريني ومحلول ميلوكسيكام محضر من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يتم تعقيم جميع المحاليل وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
- Aliquot 200 ميكرولتر من محلول قفل القسطرة المعبأ مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل.
- الأدوات والمواد الجراحية
- قم بتعبئة جميع الأدوات الجراحية النظيفة في حقيبة وقم بلصقها بقطعة من شريط تعقيم الأوتوكلاف. ارجع إلى الشكل 1A للاطلاع على الأدوات الجراحية المحددة المستخدمة.
- قم بتعقيم الحقيبة الجراحية عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للاستخدام في اليوم التالي.
- إعداد الحيوانات
- قبل الجراحة ، قم بإيواء جميع ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) في غرفة الحيوانات القياسية مع درجة حرارة يتم التحكم فيها عند 22 ± 1 درجة مئوية. قم بإطعامهم بالطعام والماء المختبري القياسي لمدة 7 أيام على الأقل.
ملاحظة: يمكن استخدام كل من الفئران الذكور والإناث لنموذج JVC ، وتختلف أعمارهم النموذجية وأوزان الجسم من 9-14 أسبوعا و 294 ± 57 جم ، على التوالي. - تخدير الفئران مع 3 ٪ -3.5 ٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين في غرفة ما قبل التخدير. تحديد ما إذا كان الفئران يصبح فاقدا للوعي بسبب عدم الاستجابة لقرصة القدم.
- أخرج الفئران بلطف ، وضع أنف الفئران في قطعة أنف مخدرة توفر 2٪ -2.5٪ isoflurane.
- في الوضع البطني والظهري ، قم بإزالة الفراء جيدا حول كتفه الأيمن والمناطق الخلفية من الرقبة باستخدام كريم مزيل الشعر وماكينة حلاقة للحيوانات الأليفة. أعد الفئران إلى القفص لإجراء الجراحة في اليوم التالي.
- قبل الجراحة ، قم بإيواء جميع ذكور الفئران Sprague-Dawley (SD) في غرفة الحيوانات القياسية مع درجة حرارة يتم التحكم فيها عند 22 ± 1 درجة مئوية. قم بإطعامهم بالطعام والماء المختبري القياسي لمدة 7 أيام على الأقل.
2. قبل الجراحة في اليوم
- إعداد محطة العمل المعقمة
- رش 75٪ من الكحول الطبي لتطهير منطقة العملية ، ثم ضع وسادة التدفئة مغطاة بوسادة نظيفة. اضبط مصباح LED مع مصدر ضوء بارد بجانب محطة العمل.
- قم بتسخين المحاليل المطلوبة مسبقا (الخطوة 1.1) إلى درجة حرارة الغرفة.
- املأ 0.6 مل من محلول ملحي هيبارين و 0.15 مل من محلول قفل القسطرة في حقنتين معقمتين بميل حاد سعة 1.0 مل ، على التوالي. اسحب 2.5 مل من محلول ملحي عادي باستخدام حقنة معقمة سعة 5.0 مل.
- انقع كرات القطن في 75٪ من الكحول الطبي. اضغط على الإيثانول الزائد قبل الاستخدام.
- وزن وتسجيل وزن جسم الفئران.
3. أثناء الجراحة
- التحضير الجراحي
- ارتد المعطف الجراحي والقفازات المعقمة وقناع الوجه. ثم افتح الحقيبة الجراحية المعقمة ، واترك جميع الأدوات الجراحية في 75٪ من الكحول الطبي ، وجففها قبل الاستخدام.
- عزل الوريد الوداجي
ملاحظة: وقت التشغيل المقدر لهذا الجزء هو 10 دقائق.- تخدير الفئران الجاهزة للجراحة والمحلوقة بنسبة 3٪ -3.5٪ من الأيزوفلوران الممزوج بالأكسجين في غرفة الحث وتحديد ما إذا كان الفئران يصبح فاقدا للوعي بسبب عدم الاستجابة لقرصة القدم.
- ضع أنف الفئران في قطعة الأنف المزودة بنسبة 2٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران للحفاظ على التخدير.
- حقن محلول ميلوكسيكام تحت الجلد بجرعة 2 ملغم / كغ.
ملاحظة: تأكد من اختيار المسكنات التي لا تتفاعل مع مركب الدواء محل الاهتمام في دراسة الحرائك الدوائية. - باستخدام شريط لاصق ، قم بتقييد ساعدي الفئران في وضعهما البطني إلى كل جانب من جوانب المنصة الجراحية.
- افرك المنطقة الجراحية بلطف عن طريق التناوب بين كرات القطن المنقوعة في 75٪ من الكحول الطبي والفرك القائم على اليود لما مجموعه ثلاث مرات.
- ارفع الجلد بعناية بالقرب من الترقوة على الجانب الأيمن من خط الوسط من الرقبة باستخدام ملقط وقم بعمل شق نحو الصدر بطول حوالي 1.5-2.0 سم باستخدام زوج من المقصات الجراحية.
- تشريح حاد لغطاء الأنسجة الرقيقة باستخدام مقص القزحية لكشف الوريد الوداجي السفلي. تتكون النهاية الرأسية القريبة من الوريد الوداجي الخارجي من فرعين ، يمكن تحديدهما بصريا.
ملاحظة: اعتمادا على عمر الفئران وجنسها، تختلف الأنسجة الرخوة (مثل الغدد اللعابية والغدد الليمفاوية والأنسجة الدهنية) التي تغطي الوريد الوداجي. بالمقارنة مع الفئران الصغيرة ، فإن الفئران القديمة أكثر بدانة (على سبيل المثال ، BW > 300 جم) ، وبالتالي تحتاج إلى مزيد من فصل الأنسجة قبل أن يكون الوريد الوداجي مرئيا. - ارفع الوريد الوداجي مع أنسجته الغشائية الضامة لتصور الغدة الليمفاوية المرتبطة بالوريد الوداجي. افصل الوريد بعناية على طول اتجاه الأوعية الدموية عن العضلات والدهون والأنسجة الأخرى المحيطة.
- دفع الملقط تحت الوريد الوداجي دون إتلاف الأوعية الدموية الجانبية وتمرير قطعتين من خياطة 6-0 تحت الوريد لتحديد طرفي الوعاء الدموي بشكل فردي.
- اسحب قطعة واحدة من الخيط قدر الإمكان نحو رأس الفئران وقم بربط الوريد بالجمجمة باستخدام 2-3 عقدة باستخدام الملقط.
- ضع الرباط الثاني على الطرف الذيلي للوريد مع 1 عقدة فضفاضة.
- قنية الوريد الوداجي
ملاحظة: وقت التشغيل المقدر لهذا الجزء هو 15 دقيقة.- افتح العبوة التي تحتوي على قسطرة بولي يوريثين (PU) مقاس 11 سم (I.D. 0.6 مم × O.D. 0.9 مم ، الشكل 1B) وقم بتوصيل القسطرة بحقنة حادة محضرة مملوءة بالمحلول الملحي الهيبارين.
- ادفع ببطء المحلول الملحي الهيباريني إلى القسطرة لتجنب فقاعات الهواء.
- ادفع الجانب المسطح غير المائل من الملقط تحت الوريد الوداجي للخروج من الجانب الآخر. قم بعمل قطع صغير على شكل حرف V على الوريد بالقرب من ربطة الجمجمة باستخدام زوج من مقص castroviejo الصغير وافتح الشق بلطف بطرف ملقط موسع وعاء الكوع.
ملاحظة: اشطف الشق بمحلول ملحي طبيعي تم تسخينه مسبقا (37 درجة مئوية) إذا تدفقت كمية صغيرة من الدم. - قطع الفتحة المائلة للطرف الأمامي من قسطرة الوريد الوداجي. قم بتثبيت الطرف المائل للأنبوب باستخدام ملقط وقم بتحريكه في الوريد الوداجي.
ملاحظة: قد تحتاج هذه الخطوة إلى شخص آخر لتسهيل انزلاق القسطرة. - أثناء تقدم القسطرة ، اسحب ببطء ملقط الجراحة المجهرية للمرفق وقم بتثبيت السطح الخارجي للوعاء باستخدام الملقط.
ملاحظة: إذا تم اختيار الوعاء الدموي الصحيح وتم انزلاق طرف القسطرة بنجاح إلى الوعاء الدموي ، فيجب ألا تشعر عملية إدخال القسطرة بأكملها بأي مقاومة للتدفق. - توقف عن إدخال القسطرة عند ضرب العلامة الزرقاء الأولى لأنبوب PU (الشكل 1B) ، والذي يبلغ طوله حوالي 3.0 سم.
- قم بتثبيت القسطرة المثبتة على الوريد باستخدام كل من الأربطة الذيلية والسطحية باستخدام الملقط.
- خيط خياطة 6-0 من خلال الأنسجة المكشوفة على الجانب الأيمن من الشق باستخدام إبرة خياطة (1/2 قطع منحني ، 12 مم) وربط الرباط مع مرقئ.
- ثني القسطرة عند العلامة الزرقاء الثانية (الشكل 1B) للربط بنفس الرباط (في الخطوة 3.3.8) ولتجنب انسداد أنبوب PU.
- قم بقص كل خيط الخياطة الإضافي وأغلق القسطرة عن طريق استبدال المحقنة ذات الرؤوس الحادة بقابس من الفولاذ المقاوم للصدأ 22 جم.
- القسطرة الخارجية
ملاحظة: وقت التشغيل المقدر لهذا الجزء هو 10 دقائق.- ضع الفئران في الوضع الظهري ونظف المنطقة الواقعة بين الكتف بلطف باستخدام كرة القطن المنقوعة في 75٪ من الكحول الطبي.
- قم بعمل شق صغير جدا في وسط الرقبة الظهرية باستخدام مقص جراحي. من خلال الشق الظهري ، قم بتوجيه ودفع trochar بلطف تحت الجلد نحو الشق البطني على الجانب الأيمن من الرقبة.
- ضع القسطرة الوريدية في التروشار ثم اسحب القسطرة الوريدية ووجهها نحو الشق الظهري.
- قم بتثبيت القسطرة الخارجية في طبقة العضلات بنفس الطريقة مع الخيط (انظر الإجراء في الخطوتين 3.3.8 و 3.3.9).
- أغلق طبقة الجلد من الشقوق البطنية والظهرية باستخدام إبرة خياطة وخياطة النايلون 6-0 (3/8 قطع منحني ، 17 مم). مسح جميع الشقوق الجراحية مع اليودوفور.
ملاحظة: مشابك الجرح هي طريقة بديلة لإغلاق شق الجلد. - قم بإزالة قابس القسطرة عن طريق ربط القسطرة بأطراف الأصابع. ضع حقنة حادة جديدة وسحب المحقنة ببطء لاختبار تدفق الدم.
ملاحظة: نظرا لأن الفئران في وضع ضعيف ، فقد لا يتمكن المرء من الحصول على عينات دم. يمكن الحصول على عينات الدم عن طريق التغيير إلى وضع الجسم الجانبي. - امسك القسطرة مرة أخرى بأطراف الأصابع وحقن 0.2 مل من محلول ملحي هيبارين و 0.1 مل من محلول القفل في القسطرة باستخدام حقنة حادة الرؤوس.
- أمسك القسطرة بأطراف الأصابع واستبدل المحقنة بقابس من الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بفك القسطرة وادفع القابس قليلا لضمان ضيق القسطرة.
4. الرعاية الفورية بعد الجراحة
- استعادة الفئران في وضع الاستلقاء الظهري عن طريق قفصها بشكل فردي مع فراش كوز الذرة الطازجة. في كثير من الأحيان ، قم بتوفير وسادة تدفئة منظمة لدرجة الحرارة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية.
ملاحظة: من أجل رعاية الحيوان ، يعد ترك الطعام والماء على الفراش طريقة فعالة لتخفيف الألم الناجم عن حركات الرقبة عند تناول الطعام والشراب. - سجل وقت انتهاء الجراحة وراقب الفئران على فترات 2 ساعة لمدة 4 ساعات على الأقل. توفير مسكن إضافي للتعافي إذا أظهر الفئران علامات الألم أو الضيق.
5. المراقبة الفسيولوجية والدموية خلال مرحلة الشفاء
- مراقبة وزن الجسم وتناول الطعام والماء يوميا وتسجيل البيانات.
- لجمع كمية صغيرة من الدم الطازج لاختبار الدم ، ضع الفئران في مقيد. افتح القابس وأدخل المحقنة في قسطرة PU الوريدية لضمان عدم إعاقة القسطرة.
ملاحظة: تم إجراء جمع الدم في نفس الوقت يوميا لمدة 6 أيام متتالية. - تخلص من الدم المسحوب الأولي ، والذي يحتوي على مزيج من الدم والمحلول الملحي الهيباريني ومحلول قفل القسطرة.
- استخدم حقنة جديدة لجمع 150 ميكرولتر من عينة الدم الطازجة ونقل عينة الدم إلى أنبوب 0.5 مل يحتوي على رذاذ K2EDTA (1.8 مجم / مل دم) المجفف على جدار الأنبوب.
ملاحظة: إذا تم حظر القسطرة، يمكن حقن 0.2 مل من محلول ملحي هيبارين في القسطرة لطرد القسطرة قبل بضع دقائق من وقت جمع الدم التالي. - حقن محلول ملحي معقم في نفس الحجم للتعويض عن الدم المسحوب. حقن 150 ميكرولتر من المياه المالحة العادية المسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) وغرس 0.2 مل من محلول ملحي طبيعي معقم بالهيبارين من خلال القسطرة.
- حقن 100 ميكرولتر من محلول القفل في القسطرة لضمان ختم القسطرة وعقمها قبل جمع العينات التالي.
- تحليل عينات الدم في غضون 2 ساعة من جمعها باستخدام عداد خلايا الدم الآلي.
6. أخذ عينات الدم المتكررة للدراسات الدوائية للدواء الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم
ملاحظة: يقترح تسجيل الفئران التي تزيد وزنها >10 جم ومستوى دموي مستقر للدراسة المستقبلية. وفقا للبروتوكول الحالي ، احتاجت الفئران JVC إلى 4 إلى 6 أيام للتعافي.
- بعد 4-6 أيام من الجراحة ، صوم الفئران لمدة 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الماء.
ملاحظة: اعتمادا على الهدف التجريبي ، فإن صيام الحيوان اختياري. - عن طريق الفم gavage الفئران الصيام مع حمض الإيلاجيك النشط بيولوجيا الفينول الطبيعي بجرعة 6 ملغ / كغ مع إبرة gavage مستقيمة16.
- جمع 200 ميكرولتر من عينات الدم في الأنابيب الهيبارين عبر قنية الوريد الوداجي في نقاط زمنية محددة مسبقا على مدى 24 ساعة بعد تناوله عن طريق الفم. تتبع عملية جمع الدم الإجراء الوارد في الخطوة 5.5.
ملاحظة: لا يلزم إغلاق القسطرة بمحلول القفل حتى يتم الانتهاء من جمع الدم. - الطرد المركزي على الفور عينة الدم في 3000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحليل عينة البلازما المستخرجة بواسطة التحليل الطيفي الكتلي الكتليالسائل 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد أظهر هذا البروتوكول بدقة كيفية إنشاء نموذج JVC طويل الأجل باستخدام مهارات الجراحة المجهرية لجمع الدم التسلسلي. ويبين الشكل 1 ألف الأدوات والمواد الجراحية الأساسية المستخدمة في إجراء الجراحة. كما تم توضيح مواصفات قسطرة PU مع ثلاث علامات زرقاء ، وهو أمر مفيد لتوجيه الباحث لوضع قنية الوريد في الخطوة 3.3. ، وكيفية استخدام العلامات الموجودة على قسطرة PU لتوجيه القنية (الشكل 1B). ومن المهم أيضا أن تكون على دراية بالجدول الزمني المطلوب لإنشاء نموذج الفئران JVC (الشكل 1C). على الرغم من أن وقت تشغيل JVC يبلغ حوالي 35 دقيقة ، إذا كان الباحث ماهرا ، فإن الأمر يستغرق من 10 إلى 14 يوما (مرحلة التكيف والتعافي) حتى يكون نموذج الفئران JVC جاهزا للاستخدام ، مقارنة بالنهج غير الجراحي ، مثل قص الذيل أو ثقب الجيوب الأنفية المداري ، والذي يمكن استخدامه على الفور مع التدريب المناسب.
كما تم التحقيق في الحالات الفسيولوجية والدموية على مدى 6 أيام بعد العملية الجراحية (الشكل 2). كانت زيادة وزن جسم الفئران ، وتناول الطعام والماء ، وعدد خلايا الدم الكامل متغيرة خلال مرحلة الشفاء (الشكل 2A ، B). وقد وجد أن غالبية الفئران تحت حالة الدراسة الحالية تتعافى في غضون 4-6 أيام بعد الجراحة كما يتضح من المستويات المستعادة لبعض الميزات الرئيسية ، مثل زيادة وزن الجسم >10 جم ، وتناول النظام الغذائي بانتظام ، ومكونات الدم المختارة المتعلقة بالعدوى والجفاف والالتهابات ، بما في ذلك تعداد خلايا الدم البيضاء ، وعدد خلايا الدم الحمراء ، عدد الهيموغلوبين والصفائح الدموية (الشكل 2C-F). تجدر الإشارة إلى أن كمية المياه المتناولة في الفئران كانت كبيرة نسبيا في اليوم الأول بعد العملية ، مما يشير إلى الجفاف.
تمت دراسة الحرائك الدوائية للبوليفينول الطبيعي ، حمض الإيلاجيك في نموذج الفئران JVC المعمول به (الشكل 3). يتميز حمض الإيلاجيك بضعف التوافر البيولوجي للأدوية. عندما تدار بجرعة منخفضة (على سبيل المثال ، 6 ملغ / كغ) ، يلزم وجود كمية كبيرة من عينة الدم للكشف عن تركيزها في البلازما. ويبين الشكل 3 انخفاض تركيز حمض الإيلاجيك في البلازما في نانوغرام/مل على مدى 24 ساعة وامتصاصه المتنوع في الجهاز الهضمي بسبب ضعف قابليته للذوبان ونفاذيته.
الشكل 1: نظرة عامة على الأدوات الجراحية الرئيسية واللوازم المستخدمة في إنشاء نموذج الفئران JVC. (أ) أعلى: a-d هو محلول ملحي عادي ، يودوفور ، أدوات بلاستيكية ، زجاجة رش مع 75 ٪ من الكحول الطبي ، على التوالي ؛ الوسط: e-o هو حقنة 5.0 مل ، حقنة 1.0 مل ، حقنة حادة ، قنية معقمة ، مقص جراحي ، مقص قزحية العين ، ملقط نصف منحني ، ملقط متوازن موسع للوعاء ، مقص كاستروفيجو الصغير ، تروشار الفولاذ المقاوم للصدأ ، حلاقة الحيوانات الأليفة ، على التوالي ؛ أسفل: p-w هو مسحات القطن ، 6-0 معقمة غير قابلة للامتصاص خيط خياطة النايلون ، كرات القطن ، نوعين من إبرة خياطة ، قابس الفولاذ المقاوم للصدأ ، مرقئ منحني ، شريط لاصق ، قطعة أنف مخدرة ، على التوالي. (ب) مواصفات قسطرة PU المستخدمة في تعليب الوريد الوداجي في الفئران. يبلغ الطول الإجمالي للقسطرة 11 مم مع O.D 0.6 مم × I.D 0.9 مم. تحتوي القسطرة على ثلاث علامات زرقاء لتكون بمثابة نقطة ربط أثناء القنية. (ج) الجدول الزمني المقترح لإنشاء نموذج الفئران JVC. في هذه الدراسة ، تم تسجيل وزن جسم الفئران ، وكذلك تناول الطعام والماء ، يوميا خلال مرحلة الشفاء ، وتم جمع عينات الدم مرة واحدة يوميا لمراقبة الدم الروتينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرصد الفسيولوجي والمرضي للفئران على مدى 6 أيام بعد الجراحة. (أ) تغير وزن الجسم. (ب) التغير في مدخول الماء والغذاء؛ (C-F) عدد خلايا الدم البيضاء ، وعدد خلايا الدم الحمراء ، والهيموجلوبين ، وعدد الصفائح الدموية ، على التوالي. تمثل البيانات متوسط ± SEM مع n = 6. تمثل القيم الرقمية باللون الأزرق القيمة المتوسطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ملامح تركيز حمض الإيلاجيك في البلازما للفئران التي تزيد عن 24 ساعة بعد الفم. تمثل البيانات متوسط ± SEM مع n = 3. يتم الحصول على قيم معلمات PK باستخدام برنامج الوظيفة الإضافية PKSolver في برنامج جدول بيانات (على سبيل المثال، Microsoft Excel)19. C max: ذروة التركيز ، T max: الوقت للوصول إلى Cmax ؛ AUCinf: المنطقة الواقعة تحت منحنى وقت تركيز البلازما من وقت الصفر إلى ما لا نهاية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتطلب إتقان تقنية تعليب السفن ممارسة كبيرة وتعلم الدرس من كل عملية. وجد كريستاكيس وآخرون باستخدام تحليل المجموع التراكمي (CUSUM) أن الباحث يحتاج إلى ممارسة 200 فأر على مدى عام واحد قبل أن يكون مستعدا لتقييم PK للأدوية المرشحة20. ومع ذلك ، يمكن تقليل وقت التشغيل اللازم لتقليب الوريد بشكل كبير من خلال عدد الفئران التي تم إجراؤها13،20. باستخدام بروتوكولنا ، زاد معدل نجاح تعليب الوريد الوداجي بشكل فعال وجمع عينة الدم من حوالي 50٪ إلى أكثر من 80٪ (كان إجمالي الفئران التي تم إجراؤها 15) ، وتم تقليل وقت التشغيل الأولي إلى 35 دقيقة من 2 ساعة.
يتضمن عرض إنشاء نموذج الفئران JVC عدة خطوات حاسمة. أولا ، تعد منطقة الشق حول الرقبة مهمة لتحديد موقع الوريد الوداجي في البداية. إذا تم إجراء JVC الأيمن ، يتم اختيار منطقة الشق بشكل عام على الجانب العلوي من الترقوة على طول الجانب الأيمن من خط منتصف الرقبة (انظر القسم 3.2 عزل الوريد الوداجي). ثانيا ، يعتمد JVC على إعداد جزء نظيف من الوريد. عند التشريح الحاد للأنسجة الرخوة ، يكون الوريد الوداجي مرئيا ومحددا من خلال هاتين السمتين: 1) فرعان في الطرف القريب ، و 2) عقدة ليمفاوية متصلة به. ثالثا ، أثناء انزلاق القسطرة إلى الوريد الوداجي (انظر القسم 3.3 قنية الوريد الوداجي) ، فإن تقليم الطرف الأمامي للقسطرة ، ودعم الأوعية الدموية بقوة خارجية ثابتة يمكن أن يحسن بشكل كبير من معدل نجاح القنطرة. علاوة على ذلك ، يجب توفير التسكين والحرارة المناسبين لراحة الفئران ، لأن الإجهاد والألم يمكن أن يسببا تغييرات في سلوك الحيوان قد تؤثر على شفائه بعد الجراحة. أخيرا ، يمكن أن تسبب مدة التخدير وفقدان الحرارة والمضاعفات موت الفئران غير المتوقع. وبالتالي ، من المهم مراقبة الفئران عن كثب أثناء وبعد الجراحة لمدة 3 أيام على الأقل. يمكن أن يوفر تقييم المؤشرات الصحية المتعددة ، مثل زيادة وزن الجسم ، والنظام الغذائي ، وحالة الشرب ، والمكونات الدموية للفئران خلال فترة الشفاء ، معلومات يمكن مقارنتها بالقيم المرجعية التي تهم الفئران SD الصحية في قاعدة البيانات21،22،23،24 . إذا كانت الفئران تعاني من الجفاف ، يمكن حقن السوائل متساوية التوتر المعقمة بنسبة 3٪ -5٪ من وزن الجسم تحت الجلد في نهاية الجراحة للتعويض عن فقدان السوائل. تكتسب معظم الفئران وزن جسمها (على سبيل المثال ، >10 جم) بحلول اليوم 3 بعد الجراحة ، وبالتالي ، يجب أن تكون جاهزة للاستخدام. ومع ذلك ، بالنسبة للدراسات التي تنطوي على تقييم المؤشرات الحيوية للدم (على سبيل المثال ، الكريات البيض ، السيتوكينات) ، يوصى بتسجيل الفئران بحلول اليوم 4-6 بعد الجراحة ، لضمان مؤشرات الدم الطبيعية للفئران.
على الرغم من فائدته في دراسة PK ، اعتمادا على مواد القسطرة ، ليست كل الأدوية المرشحة مناسبة للقنية الواحدة. وجد غاود وآخرون أن مركبات P عالية السجل كانت مرتبطة بمادة قسطرة PE ، مما أدى إلى تغيير PK25. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتم تطبيق المسكنات (على سبيل المثال ، ميلوكسيكام) لتقليل الألم في الفئران بعد الجراحة. بالنظر إلى أن عمر النصف للتخلص من الميلوكسيكام حوالي 19-23 ساعة 26,27 ، فإن الجرعة الواحدة من الميلوكسيكام (2 ملغم / كجم) المحقونة s.q. يتم تطهيرها تقريبا من الجسم بعد24 ساعة. ومع ذلك ، يمكن أن تحدث تفاعلات دوائية محتملة في استخدام ميلوكسيكام. على سبيل المثال ، يمكن أن يتنافس ميلوكسيكام مع أدوية أخرى لاستقلاب السيتوكروم P45028,29. وبالتالي ، يجب فحص جرعة ونوع المسكنات المختارة اعتمادا على الدواء المختار لدراسة الحرائك الدوائية. إذا كان الدواء محل الاهتمام يتفاعل مع ميلوكسيكام ، يمكن استخدام مسكنات الألم الأخرى (على سبيل المثال ، البوبرينورفين).
في الختام ، أظهر هذا البروتوكول بدقة كيفية إنشاء نموذج طويل الأجل للفئران JVC لجمع الدم في بيئة المختبر والتحقيق في الحالة الفسيولوجية للفئران خلال مرحلة الشفاء بعد الجراحة. يمكن أن تكون الخطوات والخبرات الجراحية الحيوية البارزة مفيدة للباحث لتحقيق تطبيق نموذج القنية بكفاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وتدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82003692) إلى R.X. Zhang؛ أفضل منحة دراسية أكاديمية في جامعة نورث وسترن للفنون التطبيقية إلى R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
