Summary
Técnicas microcirúrgicas detalhadas são demonstradas para estabelecer um modelo de rato de cannulação vesícula ve jugular de longo prazo para coleta de sangue sequencial no mesmo animal. Parâmetros fisiológicos e hematológicos foram monitorados durante a fase de recuperação do rato. Este modelo foi aplicado para estudar farmacocinética de polifenól administrado oralmente sem induzir o estresse animal.
Abstract
A amostragem de sangue em pequenos animais de laboratório é necessária para a otimização do chumbo farmacêutico, mas pode causar grandes danos e estresse aos animais experimentais, o que pode afetar os resultados. A cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é um modelo amplamente utilizado para coleta repetida de sangue, mas requer treinamento adequado de habilidades cirúrgicas e cuidados com animais. Este artigo detalha os procedimentos microcirúrgicos para estabelecer e manter um modelo permanente de ratos JVC com foco específico na colocação e vedação da cânula jugular. A importância do monitoramento fisiológico (por exemplo, peso corporal, alimentação e ingestão de água) e parâmetros hematológicos, foi destacada com resultados apresentados durante 6 dias após a cirurgia durante a recuperação do rato. O perfil de tempo de concentração de plasma de drogas administradas oralmente ácido ellagico foi determinado no modelo de rato JVC.
Introduction
A repetida aquisição de amostras de sangue de pequenos animais de laboratório, como roedores, cobaias e coelhos, é um aspecto importante para a otimização do chumbo farmacêutico e também para a redução do número de animais utilizados na pesquisa 1,2. O pipeline para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e formulação de medicamentos (por exemplo, vacina) requer acesso a diferentes volumes de sangue, a fim de avaliar sua robustez e desempenho in vivo, como farmacocinética (PK), toxicidade e sensibilidade 3,4,5.
A abordagem laboratorial para coleta de amostras de sangue é amplamente classificada em dois tipos, cirúrgico e não cirúrgico6. A abordagem não cirúrgica é relativamente fácil de entender para o pesquisador, o que inclui técnicas comuns, como punção cardíaca, punção sinusal orbital e sangramento da veia safena e da cauda. A amostragem múltipla de sangue é possível por alguns métodos não cirúrgicos, mas o volume amostral é pequeno e pode causar ferimentos físicos e estresse psicológico aos animais1. Por outro lado, a abordagem cirúrgica é uma alternativa favorita à venipuntura repetida, e envolve a colocação de uma cânula temporária ou permanente nos vasos sanguíneos dos animais 7,8,9. O grande volume sanguíneo poderia ser repetidamente retirado através da cânula em ratos conscientes, evitando o estresse e a dor devido à técnica de manuseio, contenção e anestesia 7,8,10,11. No entanto, a implantação da cânula requer um pesquisador experiente com treinamento adequado para coletar o sangue com sucesso.
A coleta de sangue através da cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é o método mais utilizado para estudar a droga PK 6,10,12,13. No entanto, o estabelecimento do modelo jvc de ratos precisa de uma prática cuidadosa de habilidades microcirúrgicas e conhecimento de cuidados pós-cirúrgicos e manutenção. Especialmente, após a cirurgia, o rato requer administração de analgésicos e tempo de recuperação suficiente para atingir condição fisiológica estável para novos experimentos 13,14,15. Embora o ganho de peso corporal (ou seja, >10 g) seja um indicador válido e comumente aplicado para a recuperação do rato, não é incomum que os ratos tenham morte inesperada no pós-operatório devido à desidratação, infecção e inflamação, o que pode ser sutil de notar no início precoce14,15. Além disso, a obstrução do cateter no modelo JVC continua a ser um problema durante a coleta de sangue.
O presente protocolo demonstrou em detalhes os procedimentos microcirúrgicos para JVC em um rato anestesiado com foco específico na identificação, isolamento e cannulação da veia jugular. Destaca-se a importância do monitoramento fisiológico e hematológico dos ratos durante a fase de recuperação. Finalmente, amostras de sangue em série foram coletadas através do cateter venoso para estudar o PK do ácido ellagico natural administrado oralmente com baixa biodisponibilidade (ou seja, baixa concentração sistêmica) para verificar o modelo de rato JVC.
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Protocol
Os procedimentos descritos abaixo foram realizados como parte de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Politécnica do Noroeste (No. 202101117).
1. Preparação pré-operatória (um dia antes da cirurgia)
NOTA: Soluções necessárias: soro fisiológico normal (cloreto de sódio 0,9% w/v), soro fisiológico heparinizado (1% c/v heparina de sódio), solução de bloqueio de cateter, anti-inflamatório não esteroide (NSAID), como solução meloxicam (2 mg/mL).
- Preparação da solução
- Aliquot 200 μL de solução de bloqueio de cateter pré-embalado em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL.
NOTA: A solução de bloqueio de cateter é composta por soro fisiológico heparinizado (0,4% v/v de sódio heparina) misturado com glicerol (v/v,1:1). - Misture 1 g de sódio de heparina em 100 mL do soro fisiológico normal para preparar 1% de soro fisiológico heparinizado.
- Dissolva a meloxicam em soro fisiológico normal para preparar uma solução de concentração de 2 mg/mL para alívio da dor pós-operatório.
NOTA: A solução de solução de soro fisiológico heparinizado preparado e meloxicam é filtrada através de um filtro de 0,22 μm. Todas as soluções são esterilizadas e armazenadas a 4°C para uso futuro.
- Aliquot 200 μL de solução de bloqueio de cateter pré-embalado em um tubo de microcentrifuge estéril de 1,5 mL.
- Instrumentos cirúrgicos e materiais
- Embale todas as ferramentas cirúrgicas limpas em uma bolsa e grave-a com um pedaço de fita de esterilização autoclave. Consulte a Figura 1A para os instrumentos cirúrgicos específicos utilizados.
- Autoclave a bolsa cirúrgica a 121 °C por 30 min para o uso do dia seguinte.
- Preparação animal
- Antes da cirurgia, abriga todos os ratos machos Sprague-Dawley (SD) na Sala Animal padrão com temperatura controlada a 22 ± 1 °C. Alimente-os com o alimento de laboratório padrão e ad libitum de água por pelo menos 7 dias.
NOTA: Tanto os ratos machos quanto os femininos podem ser usados para o modelo JVC, e suas idades típicas e pesos corporais variam de 9-14 semanas e 294 ± 57 g, respectivamente. - Anestesiar o rato com 3%-3,5% de isoflurane misturado com oxigênio em uma câmara pré-anestesia. Determine se o rato fica inconsciente pela falta de resposta ao aperto no pé.
- Leve suavemente o rato para fora, coloque o nariz do rato em uma peça de nariz anestésico fornecendo 2%-2,5% de isoflurano.
- Na posição ventral e dorsal, remova a pele completamente ao redor do ombro direito e áreas posteriores do pescoço com creme depilatório e uma navalha de estimação. Devolva o rato para a gaiola para a cirurgia a ser realizada no dia seguinte.
- Antes da cirurgia, abriga todos os ratos machos Sprague-Dawley (SD) na Sala Animal padrão com temperatura controlada a 22 ± 1 °C. Alimente-os com o alimento de laboratório padrão e ad libitum de água por pelo menos 7 dias.
2. Antes da cirurgia no dia
- Prepare a estação de trabalho asséptica
- Pulverizar 75% de álcool médico para desinfetar a área de operação e, em seguida, colocar a almofada de aquecimento coberta com uma almofada limpa. Coloque a lâmpada LED com uma fonte de luz fria ao lado da estação de trabalho.
- Pré-aqueça as soluções necessárias (passo 1.1) à temperatura ambiente.
- Encha 0,6 mL de soro fisiológico heparinizado e 0,15 mL de solução de bloqueio de cateter em duas seringas estéreis de 1,0 mL de pontas cegas, respectivamente. Retire 2,5 mL do soro fisiológico normal usando uma seringa estéril de 5,0 mL.
- Mergulhe as bolas de algodão em 75% de álcool médico. Esprema o excesso de etanol antes de usar.
- Pese e grave o peso corporal do rato.
3. Durante a cirurgia
- Preparação cirúrgica
- Use o casaco cirúrgico, luvas estéreis e máscara facial. Em seguida, abra a bolsa cirúrgica esterilizada, deixe todas as ferramentas cirúrgicas em 75% de álcool médico e seque-as antes do uso.
- Isolamento da veia jugular
NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 10 minutos.- Anestesiar o rato pronto para a cirurgia e raspar com isoflurane de 3%-3,5% misturado com oxigênio em uma câmara de indução e determinar se o rato fica inconsciente pela falta de resposta ao aperto no pé.
- Coloque o nariz do rato na peça do nariz fornecida com isoflurane de 2%-2,5% para manter a anestesia.
- Injete subcutâneamente (s.q.) solução meloxicam a uma dose de 2 mg/kg.
NOTA: Certifique-se de selecionar analgésicos que não interagem com o composto medicamentoso de interesse no estudo farmacocinético. - Usando fita adesiva, contenha os antebraços do rato em sua posição ventral para cada lado da plataforma cirúrgica.
- Esfregue suavemente a área cirúrgica alternando entre bolas de algodão encharcadas em 75% de álcool médico e esfoliante à base de iodo por um total de três vezes.
- Levante cuidadosamente a pele perto da clavícula no lado direito da linha média do pescoço com fórceps e faça uma incisão em direção ao peito com cerca de 1,5-2,0 cm de comprimento com um par de tesouras cirúrgicas.
- Dissecar a tampa fina do tecido com uma tesoura de íris para expor a veia jugular inferior. A extremidade cefálica proximal da veia jugular externa consiste em dois ramos, que podem ser identificados visualmente.
NOTA: Dependendo da idade e sexo do rato, o tecido mole (por exemplo, glândulas salivares, nódulos linfáticos e tecidos gordurosos) que cobrem a veia jugular varia. Em comparação com os ratos jovens, os ratos antigos são mais gordos (por exemplo, BW > 300 g), e assim precisam de mais separação tecidual antes que a veia jugular seja visível. - Levante a veia jugular junto com seus tecidos membranous conjuntivos para visualizar a glândula linfática presa à veia jugular. Separe cuidadosamente a veia ao longo da direção vascular do músculo circundante, gordura e outros tecidos.
- Cutuca os fórceps sob a veia jugular sem danificar os vasos sanguíneos colaterais e passar dois pedaços de sutura 6-0 sob a veia para marcar as duas extremidades do vaso sanguíneo individualmente.
- Puxe um pedaço da sutura o mais longe possível em direção à cabeça do rato e liga a veia cranialmente com 2-3 nós usando fórceps.
- Coloque a segunda ligadura na extremidade caudal da veia com 1 nó solto.
- Cannulação da veia jugular
NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 15 minutos.- Abra o pacote contendo cateter de poliuretano (PU) de 11 cm (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Figura 1B) e conecte o cateter à seringa de ponta cega preparada preenchida com o soro fisiológico heparinizado.
- Empurre lentamente o soro fisiológico heparinizado para dentro do cateter para evitar bolhas de ar.
- Cutuque o lado plano não-ponta dos fórceps sob a veia jugular para sair do outro lado. Faça um pequeno corte em forma de V na veia perto da gravata craniana com um par de micro tesouras castroviejo e abra suavemente a incisão com a ponta dos fórceps dilatadores do vaso do cotovelo.
NOTA: Enxágüe a incisão com soro fisiológico normal pré-aquecido (37 °C) se uma pequena quantidade de sangue jorra. - Corte a abertura oblíqua da parte frontal do cateter vesculato jugular. Aperte a extremidade oblíqua do tubo com fórceps e deslize-a para a veia jugular.
NOTA: Esta etapa pode precisar de outra pessoa para facilitar o deslizamento do cateter. - Ao avançar no cateter, retire lentamente as fórceps microcirúrgicas do cotovelo e fixe a superfície externa do vaso com fórceps.
NOTA: Se o vaso sanguíneo certo for selecionado e a ponta do cateter for deslizada com sucesso para dentro do vaso sanguíneo, todo o processo de inserção do cateter não deve sentir qualquer resistência ao fluxo. - Pare de inserir o cateter ao atingir a primeira marca azul do tubo PU (Figura 1B), que tem aproximadamente 3,0 cm de comprimento.
- Fixar o cateter inserido na veia com ligaduras caudais e rostrais usando fórceps.
- Rosqueie uma sutura de 6-0 através do tecido exposto no lado direito da incisão usando uma agulha de sutura (corte curvo de 1/2, 12 mm) e amarre a ligadura com um hemostata.
- Dobre o cateter na segunda marca azul (Figura 1B) para ligar com a mesma ligadura (na etapa 3.3.8) e evitar oclundo o tubo de PU.
- Corte toda a rosca de sutura extra e feche o cateter substituindo a seringa com ponta atada por um plugue de aço inoxidável de 22 G.
- Exteriorização do cateter
NOTA: O tempo estimado de operação para esta parte é de 10 minutos.- Coloque o rato na posição dorsal e limpe suavemente a área entre a escápula com a bola de algodão encharcada em 75% de álcool médico.
- Faça uma incisão muito pequena no centro do pescoço dorsal com uma tesoura cirúrgica. Através da incisão dorsal, guie e empurre suavemente o trochar sob a pele em direção à incisão ventral no lado direito do pescoço.
- Coloque o cateter venoso no trochar e, em seguida, puxe para fora e guie o cateter venoso em direção à incisão dorsal.
- Fixar o cateter exteriorizado na camada muscular da mesma forma com a sutura (veja o procedimento nas etapas 3.3.8 e 3.3.9).
- Feche a camada de pele de incisões ventrais e dorsais com a sutura de nylon 6-0 e agulha de sutura (3/8 corte curvo, 17 mm). Cosmei todas as incisões cirúrgicas com iodophor.
NOTA: Os clipes de ferida são um método alternativo para fechar a incisão da pele. - Remova o plugue do cateter apertando o cateter com as pontas dos dedos. Coloque uma nova seringa com pontada e lentamente retire a seringa para testar o fluxo sanguíneo.
NOTA: Uma vez que o rato está na posição supina, pode-se não ser capaz de obter amostras de sangue. Amostras de sangue podem ser obtidas mudando para uma posição lateral do corpo. - Segure novamente o cateter com as pontas dos dedos e injete 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado e 0,1 mL de solução de bloqueio no cateter usando a seringa de ponta sem corte.
- Segure o cateter com as pontas dos dedos e substitua a seringa por um plugue de aço inoxidável. Desesclaria o cateter e empurre ligeiramente o plugue para garantir o aperto do cateter.
4. Cuidados pós-cirúrgicos imediatos
- Recupere o rato na posição de decúbito dorsal, reduzindo-o individualmente com a cama de corncob fresco. Muitas vezes, forneça uma almofada de aquecimento regulada pela temperatura para manter a temperatura corporal do núcleo.
NOTA: Para o bem-estar animal, deixar comida e água na cama é uma maneira eficaz de aliviar a dor causada pelos movimentos do pescoço ao comer e beber. - Regisso tempo final da cirurgia e monitore o rato em intervalos de 2h por pelo menos 4h. Forneça analgesia adicional para a recuperação se o rato mostrar sinais de dor ou angústia.
5. Monitoramento fisiológico e hematológico durante a fase de recuperação
- Monitore o peso corporal e a ingestão de alimentos e água diariamente e registe os dados.
- Para coletar um pequeno volume de sangue fresco para o teste hematológico, coloque o rato em um contidor. Abra o plugue e insira a seringa no cateter pu venoso para garantir que o cateter não esteja obstruído.
NOTA: A coleta de sangue foi realizada ao mesmo tempo diariamente por 6 dias consecutivos. - Descarte o sangue retirado inicial, que contém uma mistura de sangue, soro fisiológico heparinizado e solução de bloqueio de cateter.
- Use uma nova seringa para coletar 150 μL de amostra de sangue fresco e transferir a amostra de sangue para o tubo de 0,5 mL contendo spray K2EDTA (1,8 mg/mL de sangue) seco na parede do tubo.
NOTA: Se o cateter estiver bloqueado, 0,2 mL de soro fisiológico heparinizado podem ser injetados no cateter para lavar o cateter alguns minutos antes do próximo tempo de coleta de sangue. - Injete soro fisiológico estéril no mesmo volume para compensar o sangue retirado. Injete 150 μL de soro fisiológico normal pré-aquecido (37 °C) e infundir 0,2 mL de soro fisiológico normal heparinizado pelo cateter.
- Injete 100 μL da solução de bloqueio no cateter para garantir a vedação e a esterilidade do cateter antes da próxima coleta de amostras.
- Analise as amostras de sangue dentro de 2h de coleta usando um contador automatizado de células sanguíneas.
6. Amostragem de sangue repetida para estudos farmacocinéticos de medicamentos administrados oralmente
NOTA: Sugere-se que ratos com ganho de peso >10 g e nível hematológico estável sejam inscritos para estudo futuro. Seguindo o protocolo atual, os ratos JVC exigiram de 4 a 6 dias para se recuperarem.
- Após 4-6 dias de cirurgia, acelere o rato por 12h com livre acesso à água.
NOTA: Dependendo do objetivo experimental, o jejum do animal é opcional. - Gavage oralmente o rato jejuado com ácido bioativo de fenol natural a uma dose de 6 mg/kg com uma agulha de gavage reta16.
- Coletar 200 μL de amostras de sangue nos tubos heparinizados através da cânula venosa jugular em pontos de tempo pré-determinados acima de 24 horas de administração pós-oral. O processo de coleta de sangue segue o procedimento na etapa 5.5.
NOTA: O cateter não precisa ser fechado com a solução de bloqueio até que a coleta de sangue seja concluída. - Imediatamente centrifufique a amostra de sangue a 3000 x g a 4 °C por 10 min.
- Analise a amostra de plasma extraída por espectroscopia de massa cromatografia líquida17,18.
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Representative Results
Este protocolo demonstrou minuciosamente como estabelecer um modelo JVC de longo prazo usando habilidades microcirúrgicas para coleta de sangue serial. A Figura 1A mostra os instrumentos cirúrgicos essenciais e materiais utilizados para a realização da cirurgia. A especificação do cateter PU com três marcas azuis também é ilustrada, o que é útil para orientar o pesquisador a colocar a cânula venosa na etapa 3.3., como usar as marcas no cateter pu para guiar a cannulação (Figura 1B). Também é importante estar atento ao cronograma necessário para estabelecer o modelo de rato JVC (Figura 1C). Embora o tempo de operação para o JVC seja de aproximadamente 35 minutos, se o pesquisador for hábil, leva de 10 a 14 dias (a fase de adaptação e recuperação) para que o modelo de rato JVC esteja pronto para uso, em comparação com a abordagem não cirúrgica, como o corte da cauda ou punção sinusípica orbital, que pode ser usada imediatamente com o treinamento adequado.
Também foram investigadas as condições fisiológicas e hematológicas ao longo de 6 dias de pós-operatório (Figura 2). O ganho de peso corporal do rato, a ingestão de alimentos e água e a contagem completa de células sanguíneas foram variáveis durante a fase de recuperação (Figura 2A,B). Verificou-se que a maioria dos ratos sob a presente condição de estudo se recupera dentro de 4-6 dias após a cirurgia, como evidenciado por níveis restaurados de algumas características-chave, como ganho de peso corporal >10 g, ingestão regular de dieta e componentes sanguíneos selecionados relacionados à infecção, desidratação e inflamação, incluindo contagem de glóbulos brancos, contagem de glóbulos vermelhos, contagem de hemoglobina e plaquetas (Figura 2C-F). Vale ressaltar que a quantidade de ingestão de água em ratos foi relativamente grande no primeiro dia pós-operação, indicando desidratação.
A farmacocinética do polifenol natural, ácido elágico foi estudada no modelo de rato JVC estabelecido (Figura 3). O ácido ellagico é caracterizado com má biodisponibilidade de drogas. Quando administrado em uma dose baixa (por exemplo, 6 mg/kg), um grande volume de amostra de sangue é necessário para detectar sua concentração no plasma. A Figura 3 mostra baixa concentração de ácido ellagico de concentração plasmática em ng/mL ao longo de 24 h e sua variada absorção do trato gastro-intestinal (GIT) devido à sua má solubilidade e permeabilidade.
Figura 1: Visão geral dos principais instrumentos cirúrgicos e suprimentos utilizados para o estabelecimento modelo de rato JVC. (A) Topo: a-d é soro fisiológico normal, iodophor, plástico, garrafa de spray com 75% de álcool médico, respectivamente; Médio: e-o é seringa de 5,0 mL, seringa de 1,0 mL, seringa de ponta bruta, cânula estéril, tesoura cirúrgica, tesoura de íris, fórceps semi-curvados, fórceps balanceados dilatadores de vasos, micro tesoura castroviejo, trochar de aço inoxidável, navalha de estimação, respectivamente; fundo: p-w é cotonetes de algodão, 6-0 fio de sutura de nylon não absorvível estéril, bolas de algodão, dois tipos de agulha de sutura, plugue de aço inoxidável, hemostat curvo, fita adesiva, peça de nariz anestésico, respectivamente. (B) Especificação do cateter PU utilizado para a cannulação da veia jugular em ratos. O cateter tem 11 mm de comprimento total com O.D 0,6 mm x 0,9 mm. O cateter tem três marcas azuis para servir como ponto de ancoragem durante a cannulação; (C) Cronograma sugerido de estabelecer modelo de rato JVC. Neste estudo, o peso corporal do rato, bem como a ingestão de alimentos e água, foram registrados diariamente durante a fase de recuperação, e amostras de sangue foram coletadas uma vez por dia para monitoramento hematológico de rotina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Monitoramento fisiológico e hematológico de ratos ao longo de 6 dias pós-operatório. (A) Mudança de peso corporal; (B) A mudança na ingestão de água e alimentos; (C-F) Contagem de glóbulos brancos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e contagem de plaquetas, respectivamente. Os dados representam a média ± SEM com n = 6. Os valores numéricos em azul representam o valor médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfis de tempo de concentração de ácido ellagic plasmático de ratos acima de 24 h após gavage oral. Os dados representam a média ± SEM com n = 3. Os valores dos parâmetros PK são obtidos usando o programa add-in PKSolver em um software de planilha (por exemplo, Microsoft Excel)19. Cmax: concentração máxima, Tmax: tempo para chegar a Cmax; AUCinf: área sob a curva de tempo de concentração do plasma do tempo zero ao infinito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Dominar a técnica de cannulação de vasos requer prática significativa e aprender a lição de cada operação. Christakis et al. usando a análise da soma cumulativa (CUSUM), descobriram que um pesquisador precisa praticar 200 ratos durante um período de um ano antes de estar pronto para a avaliação pk de candidatos a medicamentos20. No entanto, o tempo de operação necessário para a cannulação venosa pode ser significativamente reduzido pelo número de ratos realizados13,20. Usando nosso protocolo, a taxa de sucesso de efetivamente cannulando a veia jugular e coletando a amostra de sangue aumentou de aproximadamente 50% para acima de 80% (o total de ratos realizados foi de 15), e o tempo inicial de operação foi reduzido para 35 minutos a partir de 2 h.
A demonstração da criação de um modelo de rato JVC envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, a área de incisão ao redor do pescoço é importante para localizar inicialmente a veia jugular. Se o JVC direito for realizado, a área de incisão é geralmente selecionada no lado superior da clavícula ao longo do lado direito da linha média do pescoço (ver seção 3.2 isolamento da veia jugular). Em segundo lugar, a JVC depende da preparação de um segmento limpo da veia. Após dissecção contundente do tecido mole, a veia jugular é visível e identificada por essas duas características: 1) dois ramos na extremidade proximal, e 2) um linfonodo ligado a ele. Em terceiro lugar, ao deslizar o cateter para a veia jugular (ver seção 3.3 cannulação vesculação jugular), aparar a extremidade frontal do cateter e apoiar o vaso sanguíneo com força externa constante poderia melhorar muito a taxa de sucesso da cannulação. Além disso, a analgesia adequada e o calor devem ser fornecidos para confortar o rato, pois o estresse e a dor podem causar alterações no comportamento do animal que podem influenciar sua recuperação pós-operatória. Por fim, a duração da anestesia, perda de calor e a complicação podem causar morte inesperada de ratos; assim, é importante monitorar de perto os ratos durante e após a cirurgia por pelo menos 3 dias. A avaliação de múltiplos indicadores de saúde, como o ganho de peso corporal, dieta e estado de consumo, e componentes hematológicos de ratos durante o período de recuperação, poderia fornecer informações que possam ser comparadas com valores de referência de interesse de ratos SD saudáveis na base de dados 21,22,23,24 . Se os ratos experimentam desidratação, fluidos isotônicos estéreis a 3%-5% do peso corporal podem ser injetados subcutâneamente no final da cirurgia para compensar a perda de fluido. A maioria dos ratos ganha seu peso corporal (por exemplo, >10 g) até o dia 3 pós-cirurgia e, portanto, deve estar pronta para uso. No entanto, para estudos envolvendo avaliação de biomarcadores sanguíneos (por exemplo, leucócito, citocinas), recomenda-se inscrever os ratos até o dia 4-6 pós-cirurgia, para garantir os índices hematológicos normais para ratos.
Apesar de sua utilidade no estudo PK, dependendo dos materiais do cateter, nem todos os candidatos a medicamentos são adequados para a cannulação única. Gaud et al. encontraram compostos P de tronco alto foram ligados ao material do cateter pe, resultando em PK25 alterado. Além disso, os analgésicos (por exemplo, meloxicam) são frequentemente aplicados para reduzir a dor no rato pós-cirurgia. Considerando a eliminação da meia-vida da meloxicam em torno de 19-23 h26,27, a dose única de meloxicam (2 mg/kg) injetada s.q. é quase retirada do corpo após 24 horas. No entanto, possíveis interações medicamentosas podem ocorrer no uso de meloxicam. Por exemplo, meloxicam pode competir com outras drogas para o metabolismo Cytochrome P45028,29. Assim, a dose e o tipo de analgésicos selecionados devem ser examinados dependendo da droga escolhida para o estudo farmacocinético. Se a droga de interesse interagir com meloxicam, outros analgésicos (por exemplo, buprenorfina) podem ser usados.
Em conclusão, este protocolo demonstrou minuciosamente como estabelecer um modelo de rato JVC de longo prazo para coleta de sangue no ambiente laboratorial e investigar o estado fisiológico dos ratos durante a fase de recuperação pós-úrgica. As etapas e experiências cirúrgicas vitais destacadas podem ser úteis para o pesquisador alcançar eficientemente a aplicação do modelo de cannulação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela National Natural Science Foundation of China (No. 82003692) para R.X. Zhang; Bolsa Acadêmica superior na Universidade Politécnica northwestern para R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
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