Summary
Detaljerte mikrokirurgiske teknikker er demonstrert for å etablere en langsiktig jugular vene kannulation rotte modell for sekvensiell blodsamling i samme dyr. Fysiologiske og hematologiske parametere har blitt overvåket under rottens utvinningsfase. Denne modellen har blitt brukt til å studere farmakokinetikk av oralt administrert polyfenol uten å indusere dyrestress.
Abstract
Blodprøvetaking hos små forsøksdyr er nødvendig for farmasøytisk blyoptimalisering, men kan forårsake stor skade og stress for eksperimentelle dyr, noe som potensielt kan påvirke resultatene. Jugular venekannasjonen (JVC) hos rotter er en mye brukt modell for gjentatt blodoppsamling, men krever tilstrekkelig opplæring av kirurgiferdigheter og dyrepleie. Denne artikkelen beskriver de mikrokirurgiske prosedyrene for å etablere og vedlikeholde en permanent JVC rottemodell med spesifikt fokus på plassering og forsegling av jugularkanylen. Betydningen av å overvåke fysiologiske (f.eks. kroppsvekt, mat og vanninntak) og hematologiske parametere, ble fremhevet med resultater presentert i 6 dager etter operasjonen under rottens gjenoppretting. Den legemiddel-plasma konsentrasjonstid profilen av oralt administrert naturlig fenol ellaginsyre ble bestemt i JVC rotte modell.
Introduction
Gjentatt oppkjøp av blodprøver fra små laboratoriedyr, som gnagere, marsvin og kaniner, er et viktig aspekt for farmasøytisk blyoptimalisering og også for å redusere antall dyr som brukes i forskning 1,2. Rørledningen for utvikling av nye diagnostiske verktøy og legemiddelformulering (f.eks. vaksine) krever tilgang til ulike mengder blod for å evaluere robustheten og ytelsen i vivo, for eksempel farmakokinetikk (PK), toksisitet og følsomhet 3,4,5.
Laboratorietilnærmingen til blodprøvetaking er bredt klassifisert i to typer, kirurgisk og ikke-kirurgisk6. Den nonsurgiske tilnærmingen er relativt lett å forstå for forskeren, som inkluderer vanlige teknikker, for eksempel hjerte punktering, orbital sinus punktering og blødning av saphenous og hale vene. Flere blodprøvetaking er mulig ved noen ikke-kirurgiske metoder, men prøvevolumet er lite og kan forårsake fysisk sår og psykologisk stress for dyrene1. På den annen side er den kirurgiske tilnærmingen et favorittalternativ til gjentatt venipunktur, og det innebærer plassering av en midlertidig eller permanent kanyle i blodkarene til dyr 7,8,9. Det store blodvolumet kan gjentatte ganger trekkes tilbake gjennom kanylen hos bevisste rotter samtidig som de unngår stress og smerte på grunn av håndteringsteknikk, restrain og anestesi 7,8,10,11. Kanyleimplantasjonen krever imidlertid en erfaren forsker med tilstrekkelig opplæring for å kunne samle blodet.
Blodoppsamling gjennom jugular venekannasjon (JVC) hos rotter er den mest brukte metoden for å studere stoffet PK 6,10,12,13. Likevel trenger etablering av JVC rottemodellen nøye praksis med mikrokirurgiske ferdigheter og kunnskap om postsurgisk omsorg og vedlikehold. Spesielt etter operasjonen krever rotten administrering av smertestillende midler og tilstrekkelig gjenopprettingstid for å nå stabil fysiologisk tilstand for videre eksperimenter 13,14,15. Selv om kroppsvektøkningen (dvs. >10 g) er en gyldig og vanlig anvendt indikator for rottens utvinning, er det ikke uvanlig at rottene har uventet død postoperativt på grunn av dehydrering, infeksjon og betennelse, noe som kan være subtilt å legge merke til ved tidligstart 14,15. I tillegg gjenstår kateterobstruksjon i JVC-modellen å være et problem under blodsamlingen.
Den nåværende protokollen har i detalj demonstrert de mikrokirurgiske prosedyrene for JVC i en bedøvet rotte med spesifikt fokus på identifisering, isolasjon og kannasjon av jugularvenen. Betydningen av fysiologisk og hematologisk overvåking av rotter under utvinningsfasen er fremhevet. Til slutt ble serielle blodprøver samlet inn gjennom venøs kateter for å studere PK i den oralt administrerte naturlige fenoleløvesyren med dårlig biotilgjengelighet (dvs. lav systemisk konsentrasjon) for å verifisere JVC-rottemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrene beskrevet nedenfor ble utført som en del av en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Northwestern Polytechnical University (nr. 202101117).
1. Preoperativ forberedelse (dagen før operasjonen)
MERK: Nødvendige løsninger: normal saltvann (0,9% m/v natriumklorid), heparinisert saltvann (1% m/v heparinnatrium), kateterlåsløsning, ikke-steroid antiinflammatorisk legemiddel (NSAID), for eksempel meloksikamoppløsning (2 mg/ml).
- Klargjøring av løsning
- Aliquot 200 μL ferdigpakket kateterlåsløsning i et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør.
MERK: Katetersperreoppløsningen består av heparinisert saltvann (0,4 % v/v heparinnatrium) blandet med glyserol (v/v,1:1). - Bland 1 g heparinnatrium i 100 ml av den normale saltvannssalten for å forberede 1% heparinisert saltvann.
- Løs opp meloksikam i normal saltvann for å forberede en 2 mg/ml konsentrasjonsløsning for postoperativ smertelindring.
MERK: Klargjort heparinisert saltvanns- og meloksikamoppløsning filtreres gjennom et filter på 0,22 μm. Alle løsningene steriliseres og lagres ved 4 °C for fremtidig bruk.
- Aliquot 200 μL ferdigpakket kateterlåsløsning i et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør.
- Kirurgiske instrumenter og materialer
- Pakk alle rene kirurgiske verktøy i en pose og tape den med et stykke autoklavsteriliseringstape. Se figur 1A for de spesifikke kirurgiske instrumentene som brukes.
- Autoklaver den kirurgiske posen ved 121 °C i 30 minutter for neste dags bruk.
- Dyreforberedelse
- Før operasjonen, hus alle mannlige Sprague-Dawley (SD) rotter i standard dyrerom med kontrollert temperatur ved 22 ± 1 °C. Fôr dem med standard laboratoriemat og vann ad libitum i minst 7 dager.
MERK: Både hann- og hunnrotter kan brukes til JVC-modellen, og deres typiske alder og kroppsvekt varierer fra henholdsvis 9-14 uker og 294 ± 57 g. - Bedøv rotten med 3%-3,5% isofluran blandet med oksygen i et pre-anestesikammer. Bestem om rotten blir bevisstløs av mangel på respons på fotklemme.
- Ta forsiktig rotten ut, legg rottens nese i et bedøvelses nesestykke som leverer 2% -2,5% isofluran.
- I ventral og dorsal posisjon, fjern pelsen grundig rundt høyre skulder og bakre områder av nakken med depilatorisk krem og en kjæledyr barberhøvel. Returner rotten til buret for kirurgi som skal utføres neste dag.
- Før operasjonen, hus alle mannlige Sprague-Dawley (SD) rotter i standard dyrerom med kontrollert temperatur ved 22 ± 1 °C. Fôr dem med standard laboratoriemat og vann ad libitum i minst 7 dager.
2. Før operasjonen på dagen
- Klargjøre den aseptiske arbeidsstasjonen
- Spray 75% medisinsk alkohol for å desinfisere operasjonsområdet, og plasser deretter varmeputen dekket med en ren pute. Still inn LED-lampen med en kald lyskilde ved siden av arbeidsstasjonen.
- Forvarm de nødvendige løsningene (trinn 1.1) til romtemperatur.
- Fyll 0,6 ml heparinisert saltvann og 0,15 ml kateterlåsoppløsning i henholdsvis to sterile 1,0 ml stumpe sprøyter. Trekk ut 2,5 ml av den normale saltvannsvæsken med en steril 5,0 ml sprøyte.
- Bløtlegg bomullsbollene i 75% medisinsk alkohol. Klem ut overflødig etanol før bruk.
- Vei og registrer rottens kroppsvekt.
3. Under operasjonen
- Kirurgisk forberedelse
- Bruk kirurgisk frakk, sterile hansker og ansiktsmaske. Åpne deretter den steriliserte kirurgiske posen, la alle kirurgiske verktøy stå i 75% medisinsk alkohol, og tørk dem før bruk.
- Jugular vene isolasjon
MERK: Beregnet driftstid for denne delen er 10 min.- Bedøv den kirurgiklare og barberte rotten med 3% -3,5% isofluran blandet med oksygen i et induksjonskammer og avgjøre om rotten blir bevisstløs av mangel på respons på fotklemme.
- Plasser rottens nese i nesestykket som følger med 2%-2,5% isofluran for å opprettholde anestesi.
- Injiser (s.q.) meloksikamoppløsning subkutant i en dose på 2 mg/kg.
MERK: Sørg for å velge smertestillende midler som ikke samhandler med legemiddelforbindelsen av interesse for farmakokinetikkstudien. - Bruk tape til å begrense rottens underarmer i sin ventrale posisjon til hver side av den kirurgiske plattformen.
- Skrubb det kirurgiske området forsiktig ved å veksle mellom bomullskuler gjennomvåt i 75% medisinsk alkohol og jodbasert skrubb i totalt tre ganger.
- Løft huden forsiktig nær kragebenet på høyre side av midtlinjen av nakken med tang og gjør et snitt mot brystet ca 1,5-2,0 cm i lengde med et par kirurgiske saks.
- Stump disseker det tynne vevsdekselet med iris saks for å eksponere den under jugulære venen. Den proksimale cephalic enden av den eksterne jugularvenen består av to grener, som kan identifiseres visuelt.
MERK: Avhengig av rottens alder og kjønn varierer bløtvevet (f.eks. spyttkjertler, lymfeknuter og fettvev) som dekker jugularvenen. Sammenlignet med de unge rottene er de gamle rottene fetere (f.eks. BW > 300 g), og trenger dermed mer vevsseparasjon før jugularvenen er synlig. - Løft jugularvenen sammen med bindevevet for å visualisere lymfekjertelen festet til jugularvenen. Separer venen forsiktig langs vaskulær retning fra omkringliggende muskel, fett og andre vev.
- Skyv tangene under jugularvenen uten å skade sikkerhetsblodkarene og passere to stykker 6-0 sutur under venen for å markere de to endene av blodkaret individuelt.
- Trekk en del av suturen så langt som mulig mot rottehodet og ligat venen kranialt med 2-3 knop ved hjelp av tang.
- Plasser den andre ligaturen på den kaudale enden av venen med 1 løs knute.
- Jugular vene kannulation
MERK: Beregnet driftstid for denne delen er 15 min.- Åpne pakken som inneholder 11 cm polyuretan (PU)-kateter (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, figur 1B) og fest kateteret til den tilberedte stumpe sprøyten fylt med den hepariniserte saltvannsvæsken.
- Skyv langsomt den hepariniserte saltvann inn i kateteret for å unngå luftbobler.
- Skyv den ikke-spisse flate siden av tangene under jugularvenen for å gå ut på den andre siden. Lag et lite v-formet kutt på venen nær kranialbåndet med et par castroviejo mikrosaks og åpne forsiktig snittet med spissen av albuefartøyets dilatator tang.
MERK: Skyll snittet med forvarmet normal saltvann (37 °C) hvis en liten mengde blod strømmer ut. - Klipp ut den skrå åpningen av den fremre enden av det jugulære venekateteret. Klem den skrå enden av røret med tang og skyv den inn i jugularvenen.
MERK: Dette trinnet kan trenge en annen person for å lette kateteret som glir. - Mens du fremmer kateteret, trekker du sakte albuemikrokirurgiske tang og klemmer den ytre overflaten av fartøyet med tang.
MERK: Hvis riktig blodkar velges og spissen av kateteret glir inn i blodkaret, skal ikke hele kateterets innsettingsprosess føle noen strømningsmotstand. - Slutt å sette inn kateteret når du treffer det første blå merket på PU-røret (figur 1B), som er ca. 3,0 cm langt.
- Fest det innsatte kateteret til venen med både kaudale og rostrale ligaturer ved hjelp av tang.
- Tre en 6-0 sutur gjennom det eksponerte vevet på høyre side av snittet ved hjelp av en suturnål (1/2 buet kutting, 12 mm) og bind ligaturen med en hemostat.
- Bøy kateteret ved det andre blå merket (figur 1B) for å binde det til samme ligatur (i trinn 3.3.8) og for å unngå å okkludere PU-slangen.
- Klipp alle de ekstra suturtrådene og lukk kateteret ved å erstatte den stumpe sprøyten med en 22 G plugg i rustfritt stål.
- Kateter eksteriør
MERK: Beregnet driftstid for denne delen er 10 min.- Plasser rotten i dorsal stilling og rengjør forsiktig området mellom scapulae med bomullskulen gjennomvåt i 75% medisinsk alkohol.
- Lag et veldig lite snitt i midten av dorsalhalsen med kirurgisk saks. Gjennom dorsal snitt, guide og forsiktig skyve trochar under huden mot ventral snitt på høyre side av nakken.
- Sett det venøse kateteret inn i trocharen og trekk deretter ut og før det venøse kateteret mot dorsal snittet.
- Fest det eksterierte kateteret i muskellaget på samme måte med suturen (se prosedyren i trinn 3.3.8 og 3.3.9).
- Lukk hudlaget av ventrale og dorsale snitt med 6-0 nylon sutur og sutur nål (3/8 buet kutting, 17 mm). Vattpinne alle kirurgiske snitt med iodofor.
MERK: Sårklemmene er en alternativ metode for å lukke hudsnittet. - Fjern kateterpluggen ved å klemme kateteret med fingertuppene. Plasser en ny stump sprøyte og trekk sprøyten langsomt tilbake for å teste blodstrømmen.
MERK: Siden rotten er i liggende stilling, kan det hende man ikke kan få blodprøver. Blodprøver kan oppnås ved å bytte til en sidekroppsposisjon. - Hold kateteret igjen med fingertupper og injiser 0,2 ml heparinisert saltvann og 0,1 ml låseoppløsning i kateteret ved hjelp av den stumpe sprøyten.
- Hold kateteret med fingertupper og bytt ut sprøyten med en plugg i rustfritt stål. Løsne kateteret og skyv støpselet litt inn for å sikre kateterets tetthet.
4. Umiddelbar postkirurgisk behandling
- Gjenopprett rotten i dorsal decubitus-posisjonen ved å samle den individuelt med fersk corncob sengetøy. Ofte gir en temperaturregulert varmepute for å opprettholde kjernetemperaturen.
MERK: For dyrevelferd er det å legge mat og vann på sengetøyet en effektiv måte å lindre smerten forårsaket av nakkebevegelser når du spiser og drikker. - Registrer sluttidspunktet for operasjonen og overvåk rotten med 2 timers intervaller i minst 4 timer. Gi ekstra smertestillende midler for utvinning hvis rotten viser tegn på smerte eller nød.
5. Fysiologisk og hematologisk overvåking under utvinningsfasen
- Overvåk kroppsvekten og mat- og vanninntaket daglig og registrer dataene.
- For å samle et lite volum friskt blod for hematologisk test, plasser rotten i en restrainer. Åpne pluggen og sett sprøyten inn i det venøse PU-kateteret for å sikre at kateteret ikke er blokkert.
MERK: Blodsamlingen ble utført samtidig daglig i 6 påfølgende dager. - Kast det første tilbaketrukne blodet, som inneholder en blanding av blod, heparinisert saltvann og kateterlåsløsning.
- Bruk en ny sprøyte til å samle 150 μL fersk blodprøve og overfør blodprøven til 0,5 ml-røret som inneholder K2EDTA (1,8 mg/ml blod) spray tørket på rørveggen.
MERK: Hvis kateteret er blokkert, kan 0,2 ml heparinisert saltvann injiseres i kateteret for å skylle kateteret noen minutter før neste blodoppsamlingstid. - Injiser steril saltvann i samme volum for å kompensere for det tilbaketrukne blodet. Injiser 150 μL forvarmet normal saltvann (37 °C) og tilsett 0,2 ml steril heparinisert normal saltvann gjennom kateteret.
- Injiser 100 μL av låseløsningen i kateteret for å sikre kateterets tetning og sterilitet før neste prøveoppsamling.
- Analyser blodprøvene innen 2 timer etter innsamling ved hjelp av en automatisert blodcelleteller.
6. Gjentatt blodprøvetaking for farmakokinetiske studier av oraladministrert legemiddel
MERK: Rotter med vektøkning >10 g og stabilt hematologisk nivå foreslås å bli inkludert for fremtidig studie. Etter den nåværende protokollen krevde JVC-rottene 4 til 6 dager for å gjenopprette.
- Etter 4-6 dagers kirurgi, rask rotte i 12 timer med fri tilgang til vann.
MERK: Avhengig av det eksperimentelle målet er fasting av dyret valgfritt. - Oralt gavage fasted rotte med naturlig fenol bioaktiv ellaginsyre i en dose på 6 mg / kg med en rett gavage nål16.
- Samle 200 μL blodprøver i de hepariniserte rørene via jugularvenekanylen på forhåndsbestemte tidspunkter over 24 timer etter oral administrering. Blodinnsamlingsprosessen følger prosedyren i trinn 5.5.
MERK: Kateteret trenger ikke å lukkes med låseoppløsningen før blodoppsamlingen er fullført. - Sentrifuger straks blodprøven ved 3000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Analyser den ekstraherte plasmaprøven ved flytende kromatografi-massespektroskopi 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har grundig demonstrert hvordan man etablerer en langsiktig JVC-modell ved hjelp av mikrokirurgiske ferdigheter for seriell blodinnsamling. Figur 1A viser de essensielle kirurgiske instrumentene og materialene som brukes til å utføre operasjonen. Spesifikasjonen av PU-kateter med tre blå merker er også illustrert, noe som er nyttig for å veilede forskeren til å plassere venekanylen i trinn 3.3., hvordan du bruker merkene på PU-kateteret til å lede kanyleringen (figur 1B). Det er også viktig å være klar over tidslinjen som kreves for å etablere JVC-rottemodellen (figur 1C). Selv om driftstiden for JVC er ca. 35 min, hvis forskeren er dyktig, tar det 10-14 dager (tilpasnings- og gjenopprettingsfasen) for JVC rottemodellen å være klar til bruk, sammenlignet med den ikke-kirurgiske tilnærmingen, for eksempel hale snipping eller orbital sinus punktering, som kan brukes umiddelbart med riktig trening.
De fysiologiske og hematologiske forholdene over 6 dager postoperativt ble også undersøkt (figur 2). Rottens kroppsvektøkning, mat- og vanninntak og fullstendig blodcelletall var variabelt i utvinningsfasen (figur 2A, B). Det ble funnet at flertallet av rotter under den nåværende studietilstanden gjenoppretter innen 4-6 dager etter operasjonen som det fremgår av gjenopprettede nivåer av noen viktige funksjoner, for eksempel kroppsvektøkning >10 g, vanlig diettinntak og utvalgte blodkomponenter relatert til infeksjon, dehydrering og betennelse, inkludert antall hvite blodlegemer, antall røde blodlegemer, hemoglobin og antall blodplater (figur 2C-F). Det er verdt å merke seg at mengden vanninntak hos rotter var relativt stor den første dagen etter operasjonen, noe som indikerer dehydrering.
Farmakokinetikken til den naturlige polyfenol, ellaginsyre ble studert i den etablerte JVC-rottemodellen (figur 3). Den ellaginsyren er preget av dårlig biotilgjengelighet av legemidler. Når det administreres i en lav dose (f.eks. 6 mg/kg), er det nødvendig med et stort volum blodprøve for å oppdage konsentrasjonen i plasma. Figur 3 viser lav plasmakonsentrasjon av ellaginsyrekonsentrasjon i ng/ml over 24 timer og den varierte gastro-tarmkanalen (GIT) absorpsjon på grunn av dårlig løselighet og permeabilitet.
Figur 1: Oversikt over de viktigste kirurgiske instrumentene og forsyningene som brukes til JVC rottemodell etablering. (A) Topp: a-d er normal saltvann, iodofor, plastutstyr, sprøyteflaske med henholdsvis 75% medisinsk alkohol; Midten: e-o er 5,0 ml sprøyte, 1,0 ml sprøyte, stump tipped sprøyte, steril kanyle, kirurgisk saks, iris saks, halvbuede tang, kardilator balansert tang, castroviejo mikrosaks, rustfritt stål trochar, kjæledyr barberhøvel, henholdsvis; bunn: p-w er bomullspinne, 6-0 steril ikke-absorberbar nylon suturtråd, bomullskuler, to typer suturnål, rustfritt stålplugg, buet hemostat, tape, bedøvelse nesestykke, henholdsvis. (B) Spesifikasjon av PU-kateteret som brukes til kannasjon av jugularvenen hos rotter. Kateteret er 11 mm i total lengde med O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. Kateteret har tre blå merker som fungerer som et ankerpunkt under kannasjonen; (C) Foreslått tidslinje for etablering av JVC rottemodell. I denne studien ble rottens kroppsvekt, samt mat- og vanninntaket, registrert daglig under utvinningsfasen, og blodprøver ble samlet en gang daglig for rutinemessig hematologisk overvåking. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fysiologisk og hematologisk overvåking av rotter over 6 dager postoperativt. (A) Kroppsvektendring; (B) Endringen i vann- og matinntaket; (C-F) Antall hvite blodlegemer, antall røde blodlegemer, hemoglobin og blodplateantall. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM med n = 6. De numeriske verdiene i blått representerer gjennomsnittsverdien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plasma ellaginsyrekonsentrasjonstidsprofiler av rotter over 24 timer etter oral gavage. Dataene representerer gjennomsnittet ± SEM med n = 3. Verdiene til PK-parametere hentes ved hjelp av tilleggsprogrammet PKSolver i en regnearkprogramvare (f.eks. Cmaks: toppkonsentrasjon, Tmaks: tid til å nå Cmaks; AUCinf: område under plasma konsentrasjonstid kurven fra tid null til uendelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mestring av teknikken for karkannasjon krever betydelig praksis og læring av leksjonen fra hver operasjon. Christakis et al. ved hjelp av kumulativ sum (CUSUM) analyse, fant at en forsker trenger å praktisere 200 rotter over en periode på ett år før han er klar for PK-evaluering av narkotikakandidater20. Likevel kan driftstiden som kreves for venekannasjonen reduseres betydelig av antall rotter utført13,20. Ved hjelp av vår protokoll økte suksessraten for effektivt å kannulere jugularvenen og samle blodprøven fra ca. 50% til over 80% (totale rotter utført var 15), og den første driftstiden ble redusert til 35 min fra 2 timer.
Demonstrasjonen av å etablere en JVC rottemodell innebærer flere kritiske trinn. For det første er snittområdet rundt nakken viktig for i utgangspunktet å finne jugularvenen. Hvis høyre JVC utføres, velges snittområdet vanligvis på oversiden av kragebenet langs høyre side av halsens midtlinje (se pkt. 3.2 jugulær veneisolasjon). For det andre er JVC avhengig av forberedelse av et rent segment av venen. Ved stump disseksjon av bløtvev er jugularvenen synlig og identifisert av disse to egenskapene: 1) to grener i den proksimale enden, og 2) en lymfeknute festet til den. For det tredje, mens du skyver kateteret inn i jugularvenen (se pkt. 3.3 jugulær venekanne), trimming av frontenden av kateteret, og støtte blodkaret med jevn ekstern kraft kan i stor grad forbedre suksessraten for kannasjon. Videre må riktig analgesi og varme gis for å trøste rotten, da stress og smerte kan forårsake endringer i dyrets oppførsel som kan påvirke deres postoperative utvinning. Til slutt kan varigheten av anestesi, varmetap og komplikasjonen forårsake uventet rottedød; Dermed er det viktig å nøye overvåke rotter under og etter operasjonen i minst 3 dager. Evaluering av flere helseindikatorer, for eksempel kroppsvektøkning, kosthold og drikkestatus, og hematologiske komponenter av rotter i gjenopprettingsperioden, kan gi informasjon som kan sammenlignes med referanseverdier av interesse for friske SD-rotter i databasen 21,22,23,24 . Hvis rotter opplever dehydrering, kan sterile isotoniske væsker på 3%-5% av kroppsvekten injiseres subkutant på slutten av operasjonen for å kompensere for væsketapet. De fleste rotter får kroppsvekten (f.eks. >10 g) ved dag 3 etter operasjonen og bør derfor være klare til bruk. Likevel, for studier som involverer evaluering av blodbiomarkører (f.eks. leukocytt, cytokiner), anbefales det å registrere rotter etter dag 4-6 etter operasjonen, for å sikre de normale hematologiske indeksene for rotter.
Til tross for nytten i PK-studien, avhengig av katetermaterialene, er ikke alle legemiddelkandidater egnet for enkeltkanylering. Gaud et al. fant at høye logg P-forbindelser var bundet til PE-katetermaterialet, noe som resulterte i endret PK25. I tillegg brukes smertestillende midler (f.eks. meloksikam) ofte for å redusere smerten ved rotte etter operasjonen. Tatt i betraktning eliminasjon halveringstiden for meloksikam er rundt 19-23 h26,27, blir enkeltdosen av meloksikam (2 mg / kg) injisert s.q. nesten ryddet ut av kroppen etter 24 timer. Likevel kan potensielle legemiddelinteraksjoner forekomme ved bruk av meloksikam. For eksempel kan meloksikam konkurrere med andre stoffer for Cytokrom P450 metabolisme28,29. Dermed bør dosen og typen smertestillende midler som velges screenes avhengig av stoffet som er valgt for den farmakokinetiske studien. Hvis stoffet av interesse samhandler med meloksikam, kan andre smertestillende midler (f.eks. buprenorfin) brukes.
Til slutt har denne protokollen grundig demonstrert hvordan man etablerer en langsiktig JVC rottemodell for blodinnsamling ved laboratoriemiljøet og for å undersøke den fysiologiske statusen til rotter under den postsurgiske utvinningsfasen. De fremhevede vitale kirurgiske trinnene og erfaringene kan være nyttige for forskeren å effektivt oppnå anvendelsen av kannasjonsmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av National Natural Science Foundation of China (nr. 82003692) til R.X. Zhang; Topp akademisk stipend ved Northwestern Polytechnical University til R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
