Summary
Продемонстрированы подробные микрохирургические методы для создания долгосрочной модели канюляции яремной вены крысы для последовательного сбора крови у одного и того же животного. Физиологические и гематологические параметры контролировались в фазе восстановления крысы. Эта модель была применена для изучения фармакокинетики перорально вводимого полифенола без индуцирования стресса у животных.
Abstract
Забор крови у мелких лабораторных животных необходим для оптимизации фармацевтического свинца, но может нанести большой вред и стресс экспериментальным животным, что потенциально может повлиять на результаты. Канюляция яремной вены (JVC) у крыс является широко используемой моделью для повторного сбора крови, но требует адекватной подготовки хирургических навыков и ухода за животными. В этой статье подробно описываются микрохирургические процедуры для создания и поддержания постоянной модели крыс JVC с особым акцентом на размещение и уплотнение яремной канюли. Важность мониторинга физиологических (например, массы тела, пищи и потребления воды) и гематологических параметров была подчеркнута результатами, представленными в течение 6 дней после операции во время выздоровления крысы. Профиль концентрации лекарственного средства в плазме перорально вводимой природной феноловой эллаговой кислоты был определен в модели крыс jVC.
Introduction
Повторное получение образцов крови у мелких лабораторных животных, таких как грызуны, морские свинки и кролики, является важным аспектом для оптимизации фармацевтического свинца, а также для сокращения числа животных, используемых в исследованиях 1,2. Конвейер для разработки новых диагностических инструментов и лекарственных препаратов (например, вакцины) требует доступа к различным объемам крови для оценки их надежности и эффективности in vivo, таких как фармакокинетика (ПК), токсичность и чувствительность 3,4,5.
Лабораторный подход к сбору образцов крови широко классифицируется на два типа: хирургический и нехирургический6. Нехирургический подход относительно прост для исследователя, который включает в себя общие методы, такие как прокол сердца, прокол орбитального синуса и кровотечение подкожной и хвостовой вены. Многократный забор крови возможен некоторыми нехирургическими методами, но объем образца невелик и может вызвать физическую рану и психологический стресс у животных1. С другой стороны, хирургический подход является излюбленной альтернативой повторному венипунктуре, и он предполагает размещение временной или постоянной канюли в кровеносных сосудах животных 7,8,9. Большой объем крови может быть многократно выведен через канюлю у сознательных крыс, избегая при этом стресса и боли из-за техники обработки, сдерживания и анестезии 7,8,10,11. Однако имплантация канюли требует опытного исследователя с адекватной подготовкой, чтобы успешно собрать кровь.
Забор крови через канюляцию яремных вен (JVC) у крыс является наиболее широко используемым методом изучения препарата PK 6,10,12,13. Тем не менее, создание модели крыс JVC требует тщательной практики микрохирургических навыков и знаний о послеоперационном уходе и обслуживании. Тем более, что после операции крысе требуется введение анальгетиков и достаточное время восстановления для достижения стабильного физиологического состояния для дальнейших экспериментов 13,14,15. Хотя увеличение массы тела (т.е. >10 г) является действительным и часто применяемым показателем выздоровления крысы, нередко крысы имеют неожиданную смерть после операции из-за обезвоживания, инфекции и воспаления, которые можно заметить при раннем начале14,15. Кроме того, катетерная обструкция в модели JVC остается проблемой во время сбора крови.
Настоящий протокол подробно продемонстрировал микрохирургические процедуры для JVC у анестезированной крысы с особым акцентом на идентификацию, изоляцию и канюляцию яремной вены. Подчеркивается важность физиологического и гематологического мониторинга крыс в фазе восстановления. Наконец, серийные образцы крови были собраны через венозный катетер для изучения PK перорально вводимой природной фенольной эллаговой кислоты с плохой биодоступностью (то есть низкой системной концентрацией) для проверки модели крыс JVC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, описанные ниже, были выполнены в рамках протокола, утвержденного Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Северо-Западного политехнического университета (No 202101117).
1. Предоперационная подготовка (за день до операции)
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимые растворы: обычный физиологический раствор (0,9% мас./об.хлорида натрия), гепаринизированный физиологический раствор (1% мас./в гепарина натрия), раствор для блокировки катетера, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), такой как раствор мелоксикама (2 мг/мл).
- Приготовление раствора
- Aliquot 200 мкл предварительно упакованного раствора для блокировки катетера в стерильной микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для блокировки катетера состоит из гепаринизированного физиологического раствора (0,4% v/v гепарина натрия), смешанного с глицерином (v/v,1:1). - Смешайте 1 г гепарина натрия в 100 мл обычного физиологического раствора для приготовления 1% гепаринизированного физиологического раствора.
- Растворите мелоксикам в обычном физиологическом растворе для приготовления раствора с концентрацией 2 мг/мл для послеоперационного обезболивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовленный гепаринизированный физиологический раствор и раствор мелоксикама фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Все растворы стерилизуются и хранятся при температуре 4°C для дальнейшего использования.
- Aliquot 200 мкл предварительно упакованного раствора для блокировки катетера в стерильной микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл.
- Хирургические инструменты и материалы
- Упакуйте все чистые хирургические инструменты в мешочек и заклейте его куском автоклавной стерилизационной ленты. Обратитесь к рисунку 1А для конкретных используемых хирургических инструментов.
- Автоклав хирургического мешочка при 121 °C в течение 30 мин для использования на следующий день.
- Подготовка животных
- Перед операцией поместите всех самцов крыс Sprague-Dawley (SD) в стандартную комнату для животных с контролируемой температурой 22 ± 1 °C. Кормите их стандартным лабораторным питанием и водой ad libitum не менее 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для модели JVC могут использоваться как самцы, так и самки крыс, и их типичный возраст и масса тела варьируются от 9-14 недель и 294 ± 57 г соответственно. - Обезболить крысу 3%-3,5% изофлураном, смешанным с кислородом в преданестезионной камере. Определите, становится ли крыса бессознательной из-за отсутствия реакции на ущемление ноги.
- Осторожно выньте крысу, поместите нос крысы в анестезирующую носу, содержащую 2-2,5% изофлурана.
- В вентральном и дорсальном положении тщательно удалите мех вокруг правого плеча и задней части шеи с помощью крема для депиляции и бритвы для домашних животных. Верните крысу в клетку для операции, которая будет выполнена на следующий день.
- Перед операцией поместите всех самцов крыс Sprague-Dawley (SD) в стандартную комнату для животных с контролируемой температурой 22 ± 1 °C. Кормите их стандартным лабораторным питанием и водой ad libitum не менее 7 дней.
2. Перед операцией в день
- Подготовка асептической рабочей станции
- Распылите 75% медицинского спирта для дезинфекции рабочей зоны, а затем поместите грелку, покрытую чистой подушкой. Установите светодиодную лампу с холодным источником света рядом с рабочей станцией.
- Предварительно прогрейте необходимые растворы (этап 1.1) до комнатной температуры.
- Заполните 0,6 мл гепаринизированного физиологического раствора и 0,15 мл раствора катетера в два стерильных 1,0 мл тупых наконечников шприцев соответственно. Извлеките 2,5 мл обычного физиологического раствора с помощью стерильного шприца объемом 5,0 мл.
- Замочите ватные шарики в 75% медицинском спирте. Выдавите избыток этанола перед использованием.
- Взвесьте и запишите вес тела крысы.
3. Во время операции
- Хирургическая подготовка
- Наденьте хирургическое пальто, стерильные перчатки и маску для лица. Затем откройте стерилизованный хирургический мешочек, оставьте все хирургические инструменты в 75% медицинском спирте и высушите их перед использованием.
- Изоляция яремной вены
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы данной детали составляет 10 минут.- Обезболить готовую к операции и выбритую крысу 3%-3,5% изофлураном, смешанным с кислородом в индукционной камере, и определить, становится ли крыса бессознательной из-за отсутствия реакции на ущемление ноги.
- Поместите нос крысы в носовую часть, содержащую 2%-2,5% изофлурана для поддержания анестезии.
- Подкожно вводят (s.q.) раствор мелоксикама в дозе 2 мг/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выбирайте анальгетики, которые не взаимодействуют с лекарственным соединением, представляющим интерес в исследовании фармакокинетики. - Используя клейкую ленту, удерживайте предплечья крысы в их вентральном положении с каждой стороны хирургической платформы.
- Аккуратно очистите хирургическую область, чередуя ватные шарики, пропитанные 75% медицинским спиртом, и скраб на основе йода в общей сложности три раза.
- Осторожно поднимите кожу возле ключицы с правой стороны средней линии шеи щипцами и сделайте разрез в сторону груди длиной около 1,5-2,0 см с помощью хирургических ножниц.
- Тупом рассекните тонкий тканевый покров ножницами радужной оболочки, чтобы обнажить нижнюю яремную вену. Проксимальный цефальный конец наружной яремной вены состоит из двух ветвей, которые можно визуально идентифицировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от возраста и пола крысы мягкие ткани (например, слюнные железы, лимфатические узлы и жировые ткани), покрывающие яремную вену, различаются. По сравнению с молодыми крысами, старые крысы толще (например, BW > 300 г) и, следовательно, нуждаются в большем разделении тканей, прежде чем яремная вена будет видна. - Поднимите яремную вену вместе с ее соединительными мембранозными тканями, чтобы визуализировать лимфатическую железу, прикрепленную к яремной вене. Тщательно отделите вену вдоль сосудистого направления от окружающих мышц, жира и других тканей.
- Подтолкните щипцы под яремную вену, не повреждая коллатеральные кровеносные сосуды, и проведите два куска шва по 6-0 под вену, чтобы пометить два конца кровеносного сосуда по отдельности.
- Потяните один кусок шва как можно дальше к голове крысы и с помощью щипцов с помощью щипцов завяжите вену.
- Поместите вторую лигатуру на каудальный конец вены с 1 рыхлым узлом.
- Канюляция яремной вены
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы данной детали составляет 15 минут.- Откройте упаковку, содержащую 11 см полиуретановый (PU) катетер (I.D. 0,6 мм x O.D. 0,9 мм, рисунок 1B) и прикрепите катетер к подготовленному шприцу с тупым наконечником, заполненному гепаринизированным физиологическим раствором.
- Медленно протолкните гепаринизированный физиологический раствор в катетер, чтобы избежать пузырьков воздуха.
- Подтолкните плоскую сторону щипцов под яремную вену, чтобы выйти с другой стороны. Сделайте небольшой V-образный разрез на вене возле черепного галстука парой микроножек кастровьехо и аккуратно откройте разрез кончиком локтевого сосуда расширительными щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте разрез предварительно подогретым нормальным физиологическим раствором (37 °C), если наружу вытекает небольшое количество крови. - Вырежьте косое отверстие переднего конца катетера яремной вены. Зажмите косой конец трубки щипцами и вставьте его в яремную вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе может потребоваться другой человек, чтобы облегчить скольжение катетера. - Во время продвижения катетера медленно вынимайте локтевые микрохирургические щипцы и зажимайте наружную поверхность сосуда щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбран правильный кровеносный сосуд и кончик катетера успешно скользит в кровеносный сосуд, весь процесс введения катетера не должен ощущать никакого сопротивления потока. - Прекратите вставлять катетер при попадании в первую синюю метку пуевой трубки (рисунок 1B), которая составляет примерно 3,0 см в длину.
- Закрепите вставленный катетер на вене с помощью каудальных и ростральных лигатур с помощью щипцов.
- Проденьте шов 6-0 через открытую ткань с правой стороны разреза с помощью шовной иглы (1/2 изогнутого разреза, 12 мм) и свяжите лигатуру гемостатом.
- Согните катетер на второй синей отметке (рисунок 1B), чтобы связаться с той же лигатурой (на этапе 3.3.8) и избежать закупорки PU-трубки.
- Отрежьте всю дополнительную шовную нить и закройте катетер, заменив тупой наконечник шприца заглушкой из нержавеющей стали весом 22 г.
- Экстериоризация катетера
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетное время работы данной детали составляет 10 минут.- Поместите крысу в спинное положение и аккуратно очистите область между лопатками ватным тампоном, пропитанным 75% медицинским спиртом.
- Сделайте очень маленький разрез в центре спинной шейки хирургическими ножницами. Через спинной разрез направьте и осторожно протолкните трохар под кожей к вентральному разрезу на правой стороне шеи.
- Поместите венозный катетер в трохар, а затем вытащите и направьте венозный катетер к дорсальному разрезу.
- Закрепите экстериоризованный катетер в мышечном слое таким же образом, как и шов (см. процедуру в шагах 3.3.8 и 3.3.9).
- Закройте слой кожи вентральными и дорсальными разрезами 6-0 нейлоновым швом и шовной иглой (3/8 изогнутого разреза, 17 мм). Мазайте все хирургические разрезы с помощью йодофора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раневые зажимы являются альтернативным методом закрытия разреза кожи. - Извлеките пробку катетера, обхватив катетер кончиками пальцев. Поместите новый тупой шприц с наконечником и медленно отведите шприц назад, чтобы проверить кровоток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку крыса находится в положении лежа на спине, можно не получить образцы крови. Образцы крови могут быть получены путем изменения положения бокового тела. - Снова удерживайте катетер кончиками пальцев и введите 0,2 мл гепаринизированного физиологического раствора и 0,1 мл стопорного раствора в катетер с помощью тупого шприца.
- Держите катетер кончиками пальцев и замените шприц заглушкой из нержавеющей стали. Отсоедините катетер и слегка прижмите пробку, чтобы обеспечить герметичность катетера.
4. Немедленная послеоперационная помощь
- Восстановите крысу в дорсальном пролежнем положении, заковав ее по отдельности в клетку со свежей подстилкой из кукурузного початка. Часто предоставляют регулируемую температуру грелку для поддержания температуры тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для благополучия животных оставление пищи и воды на подстилке является эффективным способом облегчить боль, вызванную движениями шеи при еде и питье. - Запишите время окончания операции и наблюдайте за крысой с интервалом в 2 ч в течение не менее 4 ч. Обеспечьте дополнительную анальгезию для восстановления, если крыса проявляет признаки боли или дистресса.
5. Физиологический и гематологический мониторинг в фазе восстановления
- Ежедневно контролируйте массу тела и потребление пищи и воды и записывайте данные.
- Чтобы собрать небольшой объем свежей крови для гематологического теста, поместите крысу в ограничитель. Откройте пробку и вставьте шприц в венозный катетер PU, чтобы убедиться, что катетер не заблокирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Забор крови проводился в одно и то же время ежедневно в течение 6 дней подряд. - Отбросьте первоначально изъятую кровь, которая содержит смесь крови, гепаринизированного физиологического раствора и раствора для блокировки катетера.
- Используйте новый шприц для сбора 150 мкл свежего образца крови и переноса образца крови в пробирку объемом 0,5 мл, содержащую K2EDTA (1,8 мг / мл крови), высушенную на стенке трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если катетер заблокирован, 0,2 мл гепаринизированного физиологического раствора может быть введено в катетер для промывки катетера за несколько минут до следующего времени сбора крови. - Вводят стерильный физиологический раствор в том же объеме, чтобы компенсировать изъятую кровь. Вводят 150 мкл предварительно подогретого нормального физиологического раствора (37 °C) и вводят 0,2 мл стерильного гепаринизированного нормального физиологического раствора через катетер.
- Введите 100 мкл стопорного раствора в катетер, чтобы обеспечить герметизацию и стерильность катетера перед следующим сбором пробы.
- Проанализируйте образцы крови в течение 2 часов после сбора с помощью автоматизированного счетчика клеток крови.
6. Повторный забор крови для фармакокинетических исследований перорального препарата
ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс с прибавкой в весе >10 г и стабильным гематологическим уровнем предлагается записать для дальнейшего исследования. Следуя текущему протоколу, крысам JVC потребовалось от 4 до 6 дней для восстановления.
- После 4-6 дней операции голодайте крысу в течение 12 ч со свободным доступом к воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели эксперимента, голодание животного является необязательным. - Перорально обжигайте голодающую крысу натуральной фенольной биоактивной эллаговой кислотой в дозе 6 мг/кг прямой иглой16.
- Соберите 200 мкл образцов крови в гепаринизированных пробирках через канюлю яремной вены в заранее определенных временных точках в течение 24 ч после перорального введения. Процесс забора крови следует процедуре на шаге 5.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Катетер не нужно закрывать стопорным раствором до тех пор, пока не будет завершен забор крови. - Немедленно центрифугируют образец крови при 3000 х г при 4 °C в течение 10 мин.
- Анализ извлеченного образца плазмы методом жидкостной хроматографии-масс-спектроскопии17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол тщательно продемонстрировал, как создать долгосрочную модель JVC с использованием микрохирургических навыков для серийного сбора крови. На рисунке 1А показаны основные хирургические инструменты и материалы, используемые для проведения операции. Также проиллюстрирована спецификация катетера PU с тремя синими метками, что полезно для руководства исследователем по размещению венозной канюли на шаге 3.3., как использовать метки на катетере PU для направления канюляции (рисунок 1B). Также важно знать о сроках, необходимых для создания модели крыс JVC (рисунок 1C). Хотя время работы JVC составляет примерно 35 минут, если исследователь умеет, требуется 10-14 дней (фаза адаптации и восстановления), чтобы модель крысы JVC была готова к использованию, по сравнению с нехирургическим подходом, таким как обрезание хвоста или пункция орбитального синуса, которые могут быть использованы немедленно при надлежащей подготовке.
Также исследовались физиологические и гематологические состояния в течение 6 дней после операции (рисунок 2). Увеличение массы тела крысы, потребление пищи и воды, а также общее количество клеток крови были переменными во время фазы восстановления (рисунок 2A, B). Было обнаружено, что большинство крыс в условиях настоящего исследования восстанавливаются в течение 4-6 дней после операции, о чем свидетельствуют восстановленные уровни некоторых ключевых признаков, таких как увеличение массы тела >10 г, регулярное потребление пищи и отдельные компоненты крови, связанные с инфекцией, обезвоживанием и воспалением, включая количество лейкоцитов, количество эритроцитов, количество гемоглобина и тромбоцитов (рисунок 2C-F). Стоит отметить, что количество потребляемой воды у крыс было относительно большим в первые сутки после операции, что свидетельствует об обезвоживании.
Фармакокинетика природного полифенола, эллаговой кислоты была изучена в установленной модели крыс JVC (рисунок 3). Эллаговая кислота характеризуется плохой биодоступностью препарата. При введении в низкой дозе (например, 6 мг/кг) для выявления его концентрации в плазме требуется большой объем образца крови. На рисунке 3 показана низкая концентрация эллаговой кислоты в плазме крови в нг/мл в течение 24 ч и ее варьируемая абсорбция желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) из-за ее плохой растворимости и проницаемости.
Рисунок 1: Обзор основных хирургических инструментов и расходных материалов, используемых для создания модели крыс JVC. (A) Вверху: a-d - обычный физиологический раствор, йодофор, пластиковая посуда, баллончик с распылителем с 75% медицинским спиртом, соответственно; Средняя: шприц e-o - шприц 5,0 мл, шприц 1,0 мл, шприц с тупым наконечником, стерильная канюля, хирургические ножницы, ножницы для радужной оболочки глаза, полугидрированные щипцы, сбалансированные щипцы расширителя сосудов, микронарезатели castroviejo, трочар из нержавеющей стали, бритва для домашних животных, соответственно; дно: p-w - это ватные тампоны, 6-0 стерильная нерассасывающаяся нейлоновая шовная нить, ватные шарики, два типа шовной иглы, заглушка из нержавеющей стали, изогнутый гемостат, клейкая лента, анестезирующий носовой элемент соответственно. (B) Спецификация катетера PU, используемого для канюляции яремной вены у крыс. Катетер имеет общую длину 11 мм при O.D 0,6 мм x I.D 0,9 мм. Катетер имеет три синие метки, которые служат опорной точкой во время каннуляции; (C) Предлагаемые сроки создания модели крыс JVC. В этом исследовании масса тела крысы, а также потребление пищи и воды регистрировались ежедневно во время фазы восстановления, а образцы крови собирались один раз в день для рутинного гематологического мониторинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Физиологический и гематологический мониторинг крыс в течение 6 дней после операции. (А) Изменение массы тела; B) изменение потребления воды и пищи; (С-Ф) Количество лейкоцитов, количество эритроцитов, гемоглобина и тромбоцитов соответственно. Данные представляют собой среднее ± SEM с n = 6. Числовые значения, выделенные синим цветом, представляют среднее значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Плазменные профили концентрации эллаговой кислоты у крыс в течение 24 ч после перорального приема. Данные представляют собой среднее ± SEM с n = 3. Значения параметров PK получаются с помощью надстройки PKSolver в программном обеспечении для работы с электронными таблицами (например, Microsoft Excel)19. Cmax: пиковаяконцентрация, Tmax: время достиженияCmax; AUCinf: площадь под кривой концентрация-время плазмы от нуля до бесконечности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Освоение техники канюляции сосудов требует значительной практики и усвоения урока от каждой операции. Christakis et al., используя анализ кумулятивной суммы (CUSUM), обнаружили, что исследователю необходимо практиковать 200 крыс в течение одного года, прежде чем быть готовым к оценке PK кандидатов на лекарства20. Тем не менее, время работы, необходимое для канюляции вен, может быть значительно уменьшено на количество крыс, выполненных13,20. Используя наш протокол, показатель успеха эффективного каннюляции яремной вены и сбора образца крови увеличился примерно с 50% до более чем 80% (общее количество крыс составило 15), а начальное время работы было сокращено до 35 мин с 2 ч.
Демонстрация создания модели крыс JVC включает в себя несколько критических шагов. Во-первых, область разреза вокруг шеи важна для первоначального расположения яремной вены. Если выполняется правильный JVC, область разреза обычно выбирается на верхней стороне ключицы вдоль правой стороны средней линии шеи (см. раздел 3.2 Изоляция яремной вены). Во-вторых, JVC зависит от подготовки чистого сегмента вены. При тупом рассечении мягких тканей яремная вена видна и идентифицируется по этим двум признакам: 1) две ветви на проксимальном конце и 2) прикрепленный к ней лимфатический узел. В-третьих, при скольжении катетера в яремную вену (см. раздел 3.3 Канюляция яремной вены), обрезание переднего конца катетера и поддержка кровеносного сосуда устойчивой внешней силой могут значительно улучшить скорость успеха каннуляции. Кроме того, для утешения крысы должна быть обеспечена надлежащая анальгезия и тепло, так как стресс и боль могут вызвать изменения в поведении животных, которые могут повлиять на их послеоперационное восстановление. Наконец, продолжительность анестезии, потеря тепла и осложнение могут привести к неожиданной смерти крысы; таким образом, важно внимательно следить за крысами во время и после операции в течение не менее 3 дней. Оценка нескольких показателей здоровья, таких как увеличение массы тела, рацион питания и питьевой статус, а также гематологические компоненты крыс в период восстановления, может предоставить информацию, которую можно сравнить с референсными значениями, представляющими интерес для здоровых крыс SD в базе данных 21,22,23,24 . Если крысы испытывают обезвоживание, стерильные изотонические жидкости на 3-5% от массы тела могут быть введены подкожно в конце операции, чтобы компенсировать потерю жидкости. Большинство крыс набирают массу тела (например, >10 г) к 3-му дню после операции и, таким образом, должны быть готовы к использованию. Тем не менее, для исследований, включающих оценку биомаркеров крови (например, лейкоцитов, цитокинов), рекомендуется регистрировать крыс к 4-6 дню после операции, чтобы обеспечить нормальные гематологические показатели для крыс.
Несмотря на его полезность в исследовании ПК, в зависимости от материалов катетера, не все препараты-кандидаты подходят для однократной канюляции. Gaud et al. обнаружили, что соединения с высоким бревном P были связаны с материалом полиэтиленового катетера, что привело к изменению PK25. Кроме того, анальгетики (например, мелоксикам) часто применяют для уменьшения боли у крыс после операции. Учитывая, что период полувыведения мелоксикама составляет около 19-23 ч 26,27, разовая доза мелоксикама (2 мг/кг), введенная s.q., почти выводится из организма через 24 ч. Тем не менее, потенциальные лекарственно-лекарственные взаимодействия могут возникать при использовании мелоксикама. Например, мелоксикам может конкурировать с другими препаратами за метаболизм цитохрома Р45028,29. Таким образом, доза и тип выбранных анальгетиков должны быть проверены в зависимости от препарата, выбранного для фармакокинетического исследования. Если интересующий препарат взаимодействует с мелоксикамом, могут быть использованы другие болеутоляющие средства (например, бупренорфин).
В заключение, этот протокол тщательно продемонстрировал, как установить долгосрочную модель JVC крыс для сбора крови в лабораторных условиях и исследовать физиологический статус крыс во время послеоперационной фазы восстановления. Выделенные жизненно важные хирургические шаги и опыт могут быть полезны для исследователя для эффективного достижения применения модели канюляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (No 82003692) Р.Х. Чжану; Высшая академическая стипендия Северо-Западного политехнического университета Р. Мяо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
