Summary
Detaljerade mikrokirurgiska tekniker demonstreras för att etablera en långsiktig jugular venkanyleringsråttmodell för sekventiell bloduppsamling i samma djur. Fysiologiska och hematologiska parametrar har övervakats under råttans återhämtningsfas. Denna modell har tillämpats för att studera farmakokinetiken för oralt administrerad polyfenol utan att inducera djurstress.
Abstract
Blodprovtagning hos små försöksdjur är nödvändig för farmaceutisk blyoptimering men kan orsaka stor skada och stress för försöksdjur, vilket potentiellt kan påverka resultaten. Halsvenkanyreringen (JVC) hos råttor är en allmänt använd modell för upprepad blodinsamling men kräver adekvat utbildning av kirurgiska färdigheter och djurvård. Denna artikel beskriver de mikrokirurgiska förfarandena för att upprätta och upprätthålla en permanent JVC-råttmodell med särskilt fokus på placering och tätning av halskanylen. Vikten av att övervaka fysiologiska (t.ex. kroppsvikt, mat och vattenintag) och hematologiska parametrar, belystes med resultat som presenterades i 6 dagar efter operationen under råttans återhämtning. Läkemedels-plasmakoncentration-tidsprofilen för oralt administrerad naturlig fenolelaginsyra bestämdes i JVC-råttmodellen.
Introduction
Upprepad insamling av blodprover från små försöksdjur, såsom gnagare, marsvin och kaniner, är en viktig aspekt för farmaceutisk blyoptimering och även för att minska antalet djur som används i forskning 1,2. Pipelinen för att utveckla nya diagnostiska verktyg och läkemedelsformulering (t.ex. vaccin) kräver tillgång till olika volymer blod för att utvärdera deras robusthet och prestanda in vivo, såsom farmakokinetik (PK), toxicitet och känslighet 3,4,5.
Laboratoriemetoden för blodprovsinsamling klassificeras i stort sett i två typer, kirurgisk och icke-kirurgisk6. Det icke-kirurgiska tillvägagångssättet är relativt lätt att förstå för forskaren, vilket inkluderar vanliga tekniker, såsom hjärtpunktering, orbital sinuspunktur och blödning av saphenös och svansven. Flera blodprovtagningar är möjliga med vissa icke-kirurgiska metoder, men provvolymen är liten och kan orsaka fysisk sår och psykisk stress hos djuren1. Å andra sidan är det kirurgiska tillvägagångssättet ett favoritalternativ till upprepad venipunktur, och det innebär placering av en tillfällig eller permanent kanyl i blodkärlen hos djur 7,8,9. Den stora blodvolymen kan upprepade gånger dras tillbaka genom kanylen hos medvetna råttor samtidigt som man undviker stress och smärta på grund av hanteringstekniken, återhållsamhet och anestesi 7,8,10,11. Kanylimplantationen kräver emellertid en erfaren forskare med adekvat utbildning för att framgångsrikt samla blodet.
Bloduppsamling genom halsvenkanylering (JVC) hos råttor är den mest använda metoden för att studera läkemedlet PK 6,10,12,13. Ändå kräver etablering av JVC-råttmodellen noggrann övning av mikrokirurgiska färdigheter och kunskap om postkirurgisk vård och underhåll. Speciellt efter operationen kräver råttan administrering av smärtstillande medel och tillräcklig återhämtningstid för att nå stabilt fysiologiskt tillstånd för ytterligare experiment 13,14,15. Även om kroppsviktökningen (dvs. >10 g) är en giltig och vanligt tillämpad indikator för råttans återhämtning, är det inte ovanligt att råttorna har oväntad död postoperativt på grund av uttorkning, infektion och inflammation, vilket kan vara subtilt att märka vid tidig debut14,15. Dessutom är kateterobstruktion i JVC-modellen fortfarande ett problem under blodinsamlingen.
Det nuvarande protokollet har i detalj visat de mikrokirurgiska förfarandena för JVC hos en sövd råtta med specifikt fokus på identifiering, isolering och kanylering av halsvenen. Vikten av fysiologisk och hematologisk övervakning av råttorna under återhämtningsfasen betonas. Slutligen samlades seriella blodprover in genom venkatetern för att studera PK för den oralt administrerade naturliga fenolelsyran med dålig biotillgänglighet (dvs. låg systemisk koncentration) för att verifiera JVC-råttmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som beskrivs nedan utfördes som en del av ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Northwestern Polytechnical University (nr 202101117).
1. Preoperativ beredning (dagen före operationen)
OBS: Erforderliga lösningar: normal saltlösning (0,9% w / v natriumklorid), hepariniserad saltlösning (1% w / v heparinnatrium), kateterlåslösning, icke-steroid antiinflammatoriskt läkemedel (NSAID), såsom meloxikamlösning (2 mg / ml).
- Förberedelse av lösning
- Alikvot 200 μL färdigförpackad kateterlåslösning i ett 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör.
OBS: Kateterlåslösningen består av hepariniserad saltlösning (0,4% v/v heparinnatrium) blandat med glycerol (v/v,1:1). - Blanda 1 g heparinnatrium i 100 ml av normal saltlösning för att bereda 1% hepariniserad saltlösning.
- Lös meloxikam i normal saltlösning för att bereda en koncentrationslösning på 2 mg/ml för postoperativ smärtlindring.
OBS: Beredd hepariniserad saltlösning och meloxikamlösning filtreras genom ett 0,22 μm filter. Alla lösningar steriliseras och lagras vid 4 ° C för framtida bruk.
- Alikvot 200 μL färdigförpackad kateterlåslösning i ett 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör.
- Kirurgiska instrument och material
- Packa alla rena kirurgiska verktyg i en påse och tejpa den med en bit autoklavsteriliseringstejp. Se figur 1A för de specifika kirurgiska instrument som används.
- Autoklavera den kirurgiska påsen vid 121 ° C i 30 minuter för användning nästa dag.
- Djurberedning
- Före operationen, hysa alla manliga Sprague-Dawley (SD) råttor i standard Animal Room med kontrollerad temperatur vid 22 ± 1 ° C. Foder dem med standard laboratoriemat och vatten ad libitum i minst 7 dagar.
OBS: Både han- och honråttor kan användas för JVC-modellen, och deras typiska åldrar och kroppsvikt varierar från 9-14 veckor respektive 294 ± 57 g. - Bedöva råttan med 3% -3,5% isofluran blandat med syre i en pre-anestesikammare. Bestäm om råttan blir medvetslös av bristen på svar på fotklämman.
- Ta försiktigt ut råttan, placera råttans näsa i ett bedövningsmedel nässtycke som levererar 2% -2,5% isofluran.
- I ventralt och dorsalt läge, ta bort pälsen noggrant runt sin högra axel och bakre delar av nacken med hårborttagningskräm och en rakhyvel för husdjur. Sätt tillbaka råttan till buret för operation som ska utföras nästa dag.
- Före operationen, hysa alla manliga Sprague-Dawley (SD) råttor i standard Animal Room med kontrollerad temperatur vid 22 ± 1 ° C. Foder dem med standard laboratoriemat och vatten ad libitum i minst 7 dagar.
2. Före operationen på dagen
- Förbered den aseptiska arbetsstationen
- Spraya 75% medicinsk alkohol för att desinficera operationsområdet och placera sedan värmedynan täckt med en ren kudde. Ställ LED-lampan med en kall ljuskälla bredvid arbetsstationen.
- Förvärm de önskade lösningarna (steg 1.1) till rumstemperatur.
- Fyll 0,6 ml hepariniserad saltlösning respektive 0,15 ml kateterlåslösning i två sterila 1,0 ml trubbiga spetssprutor. Dra ut 2,5 ml av den normala saltlösningen med en steril 5,0 ml spruta.
- Blötlägg bomullstussarna i 75% medicinsk alkohol. Pressa ut överskott av etanol före användning.
- Väg och registrera råttans kroppsvikt.
3. Under operationen
- Kirurgisk förberedelse
- Bär den kirurgiska kappan, sterila handskar och ansiktsmask. Öppna sedan den steriliserade kirurgiska påsen, lämna alla kirurgiska verktyg i 75% medicinsk alkohol och torka dem före användning.
- Isolering av halsvenen
OBS: Den beräknade driftstiden för denna del är 10 min.- Bedöva den operationsfärdiga och rakade råttan med 3% -3,5% isofluran blandat med syre i en induktionskammare och bestäm om råttan blir medvetslös av bristen på svar på fotklämman.
- Placera råttans näsa i nässtycket som levereras med 2% -2,5% isofluran för att bibehålla anestesin.
- Subkutant injicera (s.q.) meloxikamlösning i en dos av 2 mg/kg.
OBS: Se till att välja smärtstillande medel som inte interagerar med läkemedelsföreningen av intresse i farmakokinetikstudien. - Håll fast råttans underarmar i sitt ventrala läge på vardera sidan av den kirurgiska plattformen med tejp.
- Skrubba försiktigt det kirurgiska området genom att växla mellan bomullstussar som blötläggs i 75% medicinsk alkohol och jodbaserad skrubba i totalt tre gånger.
- Lyft försiktigt huden nära nyckelbenet på höger sida av halsens mittlinje med pincett och gör ett snitt mot bröstet ca 1,5-2,0 cm i längd med en par kirurgiska saxar.
- Blunt dissekerar det tunna vävnadskåpan med irissax för att exponera den under halsvenen. Den proximala cefaliska änden av den yttre halsvenen består av två grenar, som visuellt kan identifieras.
OBS: Beroende på råttans ålder och kön varierar mjukvävnaden (t.ex. spottkörtlar, lymfkörtlar och fettvävnader) som täcker halsvenen. Jämfört med de unga råttorna är de gamla råttorna fetare (t.ex. BW > 300 g) och behöver därför mer vävnadsseparation innan halsvenen är synlig. - Lyft halsvenen tillsammans med dess bindvävsmembranvävnader för att visualisera lymfkörteln fäst vid halsvenen. Separera försiktigt venen längs kärlriktningen från omgivande muskler, fett och andra vävnader.
- Knuffa tången under halsvenen utan att skada de kollaturala blodkärlen och passera två stycken 6-0 sutur under venen för att markera de två ändarna av blodkärlet individuellt.
- Dra en bit av suturen så långt som möjligt mot råtthuvudet och ligera venen kraniellt med 2-3 knop med pincett.
- Placera den andra ligaturen på den kaudala änden av venen med 1 lös knut.
- Halsvenkanylering
OBS: Den beräknade driftstiden för denna del är 15 min.- Öppna förpackningen som innehåller 11 cm polyuretankateter (PU) (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, figur 1B) och fäst katetern på den beredda trubbiga sprutan fylld med den hepariniserade saltlösningen.
- Tryck långsamt in den hepariniserade saltlösningen i katetern för att undvika luftbubblor.
- Knuffa den icke-spetsiga platta sidan av tången under halsvenen för att gå ut på andra sidan. Gör ett litet v-format snitt på venen nära kranialbandet med ett par castroviejo mikrosaxar och öppna försiktigt snittet med spetsen på armbågskärlets dilatatortång.
OBS: Skölj snittet med förvärmd normal saltlösning (37 ° C) om en liten mängd blod forsar ut. - Klipp ut den sneda öppningen på den främre änden av halsvenkatetern. Kläm fast den sneda änden av röret med pincett och skjut den in i halsvenen.
OBS: Detta steg kan behöva en annan person för att underlätta kateterglidningen. - Medan du avancerar katetern, dra långsamt tillbaka armbågens mikrokirurgiska pincett och kläm fast kärlets yttre yta med pincett.
OBS: Om rätt blodkärl väljs och kateterns spets framgångsrikt glider in i blodkärlet, bör hela kateterinsättningsprocessen inte känna något flödesmotstånd. - Sluta sätta in katetern när du träffar det första blå märket på PU-röret (figur 1B), som är cirka 3,0 cm långt.
- Fäst den införda katetern i venen med både kaudala och rostrala ligaturer med pincett.
- Trä en 6-0 sutur genom den exponerade vävnaden på höger sida av snittet med en suturnål (1/2 krökt skärning, 12 mm) och bind ligaturen med en hemostat.
- Böj katetern vid det andra blå märket (figur 1B) för att binda med samma ligatur (i steg 3.3.8) och för att undvika att PU-slangen täppas till.
- Klipp av all extra suturgänga och stäng katetern genom att byta ut den trubbiga sprutan med en 22 G rostfritt stålplugg.
- Utvändning av kateter
OBS: Den beräknade driftstiden för denna del är 10 min.- Placera råttan i ryggläge och rengör försiktigt området mellan skulderbladet med bomullstussen blöt i 75% medicinsk alkohol.
- Gör ett mycket litet snitt i mitten av rygghalsen med kirurgisk sax. Genom det dorsala snittet, styr och tryck försiktigt trochar under huden mot det ventrala snittet på höger sida av nacken.
- Sätt venkatetern i trochar och dra sedan ut och styr venkatetern mot dorsalsnittet.
- Fäst den exteriöriserade katetern i muskelskiktet på samma sätt med suturen (se proceduren i steg 3.3.8 och 3.3.9).
- Stäng hudskiktet av ventrala och dorsala snitt med 6-0 nylonsutur och suturnål (3/8 krökt skärning, 17 mm). Svabba alla kirurgiska snitt med jodofor.
OBS: Sårklämmorna är en alternativ metod för att stänga hudsnittet. - Ta bort kateterpluggen genom att klämma fast katetern med fingertopparna. Placera en ny trubbig spetsad spruta och dra långsamt tillbaka sprutan för att testa blodflödet.
OBS: Eftersom råttan är i ryggläge kanske man inte kan få blodprover. Blodprover kan erhållas genom att byta till en sidokroppsposition. - Håll katetern igen med fingertopparna och injicera 0,2 ml hepariniserad saltlösning och 0,1 ml låslösning i katetern med hjälp av den trubbiga sprutan.
- Håll katetern med fingertopparna och byt ut sprutan mot en plugg i rostfritt stål. Lossa katetern och tryck in pluggen något för att säkerställa kateterns täthet.
4. Omedelbar postkirurgisk vård
- Återställ råttan i dorsal decubituspositionen genom att bura den individuellt med färskt majskobbströ. Ofta ger du en temperaturreglerad värmedyna för att bibehålla kärnkroppstemperaturen.
OBS: För djurens välbefinnande är att lämna mat och vatten på sängkläderna ett effektivt sätt att lindra smärtan som orsakas av nackrörelser när man äter och dricker. - Registrera sluttiden för operationen och övervaka råttan med 2 timmars mellanrum i minst 4 timmar. Ge ytterligare analgesi för återhämtningen om råttan visar tecken på smärta eller nöd.
5. Fysiologisk och hematologisk övervakning under återhämtningsfasen
- Övervaka kroppsvikten och mat- och vattenintaget dagligen och registrera data.
- För att samla en liten volym färskt blod för hematologiskt test, placera råttan i en restrainer. Öppna kontakten och sätt in sprutan i den venösa PU-katetern för att säkerställa att katetern inte hindras.
OBS: Blodinsamlingen utfördes samtidigt dagligen i 6 på varandra följande dagar. - Kassera det initiala uttagna blodet, som innehåller en blandning av blod, hepariniserad saltlösning och kateterlåslösning.
- Använd en ny spruta för att samla 150 μL färskt blodprov och överföra blodprovet till 0,5 ml röret som innehåller K2EDTA (1,8 mg / ml blod) spray torkat på rörväggen.
OBS: Om katetern är blockerad kan 0,2 ml hepariniserad saltlösning injiceras i katetern för att spola katetern några minuter före nästa bloduppsamlingstid. - Injicera steril saltlösning i samma volym för att kompensera för det uttagna blodet. Injicera 150 μL förvärmd normal saltlösning (37 °C) och infusera 0,2 ml steril hepariniserad normal saltlösning genom katetern.
- Injicera 100 μL av låslösningen i katetern för att säkerställa kateterns tätning och sterilitet före nästa provtagning.
- Analysera blodproverna inom 2 timmar efter insamling med hjälp av en automatiserad blodcellsräknare.
6. Upprepad blodprovtagning för farmakokinetiska studier av oralt administrerat läkemedel
OBS: Råttor med viktökning >10 g och stabil hematologisk nivå föreslås vara inskrivna för framtida studier. Efter det nuvarande protokollet krävde JVC-råttorna 4 till 6 dagar för att återhämta sig.
- Efter 4-6 dagars operation, fasta råttan i 12 timmar med fri tillgång till vatten.
OBS: Beroende på det experimentella målet är det valfritt att fasta djuret. - Oralt gavage den fastande råttan med naturlig fenol bioaktiv ellaginsyra i en dos av 6 mg / kg med en rak gavage nål16.
- Samla in 200 μL blodprover i de hepariniserade rören via halsvenkanylen vid förutbestämda tidpunkter över 24 timmar efter oral administrering. Blodinsamlingsprocessen följer proceduren i steg 5.5.
OBS: Katetern behöver inte stängas med låslösningen förrän bloduppsamlingen är klar. - Centrifugera omedelbart blodprovet vid 3000 x g vid 4 °C i 10 min.
- Analysera det extraherade plasmaprovet med vätskekromatografi-masspektroskopi17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har grundligt visat hur man etablerar en långsiktig JVC-modell med hjälp av mikrokirurgiska färdigheter för seriell blodinsamling. Figur 1A visar de väsentliga kirurgiska instrument och material som används för att genomföra operationen. Specifikationen av PU-kateter med tre blå märken illustreras också, vilket är till hjälp för att vägleda forskaren att placera venkanyeln i steg 3.3., hur man använder märkena på PU-katetern för att styra kanylen (Figur 1B). Det är också viktigt att vara medveten om den tidslinje som krävs för att fastställa JVC-råttmodellen (figur 1C). Även om driftstiden för JVC är cirka 35 minuter, om forskaren är skicklig, tar det 10-14 dagar (anpassnings- och återhämtningsfasen) för JVC-råttmodellen att vara klar för användning, jämfört med det icke-kirurgiska tillvägagångssättet, såsom svansklippning eller orbital sinuspunktion, som kan användas omedelbart med korrekt träning.
De fysiologiska och hematologiska tillstånden under 6 dagar postoperativt undersöktes också (figur 2). Råttans kroppsviktökning, mat- och vattenintag och fullständigt antal blodkroppar var varierande under återhämtningsfasen (figur 2A,B). Det visade sig att majoriteten av råttorna under det nuvarande studietillståndet återhämtar sig inom 4-6 dagar efter operationen, vilket framgår av återställda nivåer av vissa viktiga funktioner, såsom kroppsviktökning >10 g, regelbundet dietintag och utvalda blodkomponenter relaterade till infektion, uttorkning och inflammation, inklusive antal vita blodkroppar, antal röda blodkroppar, hemoglobin och trombocytantal (figur 2C-F). Det är värt att notera att mängden vattenintag hos råttor var relativt stor den första dagen efter operationen, vilket indikerar uttorkning.
Farmakokinetiken för den naturliga polyfenolen, ellaginsyran studerades i den etablerade JVC-råttmodellen (figur 3). Ellaginsyran kännetecknas av dålig läkemedelsbiotillgänglighet. Vid administrering i en låg dos (t.ex. 6 mg/kg) krävs en stor volym blodprov för att detektera dess koncentration i plasma. Figur 3 visar låg plasmakoncentration av ellaginsyra i ng/ml under 24 timmar och dess varierade absorption i mag-tarmkanalen (GIT) på grund av dess dåliga löslighet och permeabilitet.
Figur 1: Översikt över de viktigaste kirurgiska instrumenten och förnödenheterna som används för JVC-råttmodelletablering. (A) Överst: a-d är normal saltlösning, jodofor, plastvaror, sprayflaska med 75% medicinsk alkohol, respektive; Mitten: e-o är 5,0 ml spruta, 1,0 ml spruta, trubbig spetsad spruta, steril kanyl, kirurgisk sax, irissax, halvkrökt pincett, kärldilatator balanserade pincett, castroviejo mikrosax, rostfritt stål trochar, husdjur rakhyvel, respektive; botten: p-w är bomullspinne, 6-0 steril icke-absorberbar nylonsuturtråd, bomullsbollar, två typer av suturnål, plugg i rostfritt stål, krökt hemostat, tejp, bedövningsmedel nässtycke, respektive. (B) Specifikation av puderkatetern som används för kanylering av halsven hos råttor. Katetern är 11 mm i total längd med O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. Katetern har tre blå märken för att fungera som en ankarpunkt under kanyleringen; (C) Föreslagen tidsplan för inrättandet av JVC-råttmodellen. I denna studie registrerades råttans kroppsvikt, liksom mat- och vattenintaget, dagligen under återhämtningsfasen och blodprover samlades in en gång dagligen för rutinmässig hematologisk övervakning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Fysiologisk och hematologisk övervakning av råttor under 6 dagar postoperativt. (A) Förändring av kroppsvikt; B) Förändringen i vatten- och livsmedelsintaget. (C-F) Antal vita blodkroppar, antal röda blodkroppar, hemoglobin respektive trombocyttal. Uppgifterna representerar medelvärdet ± SEM med n = 6. De numeriska värdena i blått representerar medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Plasmakoncentrationsprofiler för ellaginsyra hos råttor under 24 timmar efter oral gavage. Uppgifterna representerar medelvärdet ± SEM med n = 3. Värdena för PK-parametrar erhålls med hjälp av tilläggsprogrammet PKSolver i ett kalkylprogram (t.ex. Microsoft Excel)19. Cmax: toppkoncentration, Tmax: tid för att nå Cmax; AUCinf: arean under plasmakoncentrations-tidskurvan från tid noll till oändlighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mastering av tekniken för fartygsburkulering kräver betydande övning och lärdom av varje operation. Christakis et al. med hjälp av kumulativ summa (CUSUM) analys, fann att en forskare behöver öva 200 råttor under en period av ett år innan han är redo för PK-utvärdering av läkemedelskandidater20. Ändå kan den driftstid som krävs för venens kanylering minskas avsevärt med antalet råttor som utförs 13,20. Med hjälp av vårt protokoll ökade framgångsgraden för att effektivt kanylera halsvenen och samla blodprovet från cirka 50% till över 80% (totalt antal råttor som utfördes var 15), och den initiala driftstiden reducerades till 35 min från 2 timmar.
Demonstrationen av att etablera en JVC-råttmodell innebär flera kritiska steg. För det första är snittområdet runt halsen viktigt för att initialt lokalisera halsvenen. Om rätt JVC utförs väljs snittområdet i allmänhet på nyckelbenets övre sida längs höger sida av halsens mittlinje (se avsnitt 3.2 halsvenisolering). För det andra beror JVC på beredning av ett rent segment av venen. Vid trubbig dissektion av mjukvävnad är halsvenen synlig och identifierad av dessa två egenskaper: 1) två grenar vid den proximala änden och 2) en lymfkörtel fäst vid den. För det tredje, medan katetern skjuts in i halsvenen (se avsnitt 3.3 halsvenkanylering), kan trimning av kateterns främre ände och stöd av blodkärlet med stadig yttre kraft avsevärt förbättra framgångsgraden för kanylering. Dessutom måste korrekt analgesi och värme tillhandahållas för att trösta råttan, eftersom stress och smärta kan orsaka förändringar i djurets beteende som kan påverka deras postoperativa återhämtning. Slutligen kan varaktigheten av anestesi, värmeförlust och komplikationen orsaka oväntad råttdöd; Därför är det viktigt att noggrant övervaka råttorna under och efter operationen i minst 3 dagar. Utvärdering av flera hälsoindikatorer, såsom kroppsviktökning, kost och dricksstatus och hematologiska komponenter hos råttor under återhämtningsperioden, kan ge information som kan jämföras med referensvärden av intresse för friska SD-råttor i databasen 21,22,23,24 . Om råttor upplever uttorkning kan sterila isotoniska vätskor vid 3% -5% av kroppsvikten injiceras subkutant i slutet av operationen för att kompensera för vätskeförlusten. De flesta råttor får sin kroppsvikt (t.ex. >10 g) vid dag 3 efter operationen och bör därför vara redo att användas. Men för studier som involverar utvärdering av blodbiomarkörer (t.ex. leukocyt, cytokiner) rekommenderas det att registrera råttorna vid dag 4-6 efter operationen för att säkerställa normala hematologiska index för råttor.
Trots dess användbarhet i PK-studien, beroende på katetermaterialen, är inte alla läkemedelskandidater lämpliga för den enda kanyleringen. Gaud et al. fann att höga log P-föreningar var bundna till PE-katetermaterialet, vilket resulterade i förändrad PK25. Dessutom appliceras smärtstillande medel (t.ex. meloxikam) ofta för att minska smärtan hos råtta efter operationen. Med tanke på att halveringstiden för eliminering av meloxikam är cirka 19-23 timmar 26,27, rensas engångsdosen meloxicam (2 mg/kg) injicerad s.q. nästan ur kroppen efter 24 timmar. Ändå kan potentiella läkemedelsinteraktioner uppstå vid användning av meloxikam. Meloxicam kan till exempel konkurrera med andra läkemedel för cytokrom P450 metabolism28,29. Således bör den valda dosen och typen av smärtstillande medel screenas beroende på vilket läkemedel som valts för den farmakokinetiska studien. Om läkemedlet av intresse interagerar med meloxikam kan andra smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin) användas.
Sammanfattningsvis har detta protokoll grundligt visat hur man etablerar en långsiktig JVC-råttmodell för bloduppsamling vid laboratorieinställningen och att undersöka råttornas fysiologiska status under den postkirurgiska återhämtningsfasen. De markerade viktiga kirurgiska stegen och erfarenheterna kan vara till hjälp för forskaren att effektivt uppnå tillämpningen av kanyleringsmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (nr 82003692) till R.X. Zhang; Topp akademiskt stipendium vid Northwestern Polytechnical University till R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Sadler, A. M., Bailey, S. J. Validation of a refined technique for taking repeated blood samples from juvenile and adult mice. Laboratory Animals. 47 (4), 316-319 (2013).
- Zhang, R. X., et al. Coordinating biointeraction and bioreaction of a nanocarrier material and an anticancer drug to overcome membrane rigidity and target mitochondria in multidrug-resistant cancer cells. Advanced Functional Materials. 27 (39), 12 (2017).
- Zhang, R. X., et al. Polymer-lipid hybrid nanoparticles synchronize pharmacokinetics of co-encapsulated doxorubicin-mitomycin C and enable their spatiotemporal co-delivery and local bioavailability in breast tumor. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
- Zhang, R. X., et al. Sample extraction and simultaneous chromatographic quantitation of doxorubicin and mitomycin C following drug combination delivery in nanoparticles to tumor-bearing mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e11 (2017).
- Bakar, S. K., Niazi, S. Simple reliable method for chronic cannulation of the jugular vein for pharmacokinetic studies in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 72 (9), 1027-1029 (1983).
- Harms, P. G., Ojeda, S. R. A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. Journal of Applied Physiology. 36 (3), 391-392 (1974).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Research Protocols. 10 (2), 84-94 (2002).
- Weeks, J. R., Davis, J. D. Chronic intravenous cannulas for rats. Journal of Applied Physiology. 19 (3), 540-541 (1964).
- Goldkuhl, R., et al. Plasma concentrations of corticosterone and buprenorphine in rats subjected to jugular vein catheterization. Laboratory Animals. 44 (4), 337-343 (2010).
- Steffens, A. B. A method for frequent sampling of blood and continuous infusion of fluids in the rat without disturbing the animal. Physiology & Behavior. 4 (5), 833-836 (1969).
- Terao, N., Shen, D. D. Alterations in serum protein binding and pharmacokinetics of l-propranolol in the rat elicited by the presence of an indwelling venous catheter. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 227 (2), 369-375 (1983).
- Feng, J., et al. Catheterization of the carotid artery and jugular vein to perform hemodynamic measures, infusions and blood sampling in a conscious rat model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e51881 (2015).
- Karim, N., Ali, S. Jugular vein cannulation in rats - A mini review. Canadian Journal of Pure and Applied Sciences. 3, 929-935 (2009).
- Ling, S., Jamali, F. Effect of cannulation surgery and restraint stress on the plasma corticosterone concentration in the rat: application of an improved corticosterone HPLC assay. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 6 (2), (2003).
- Lei, F., et al. Pharmacokinetic study of ellagic acid in rat after oral administration of pomegranate leaf extract. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 796 (1), 189-194 (2003).
- Yan, L. L., et al. Method development and validation for pharmacokinetic and tissue distributions of ellagic acid using Ultrahigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS). Molecules. 19 (11), 18923-18935 (2014).
- Long, J. F., et al. Bioavailability and bioactivity of free ellagic acid compared to pomegranate juice. Food & Function. 10 (10), 6582-6588 (2019).
- Zhang, Y., et al. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 99 (3), 306-314 (2010).
- Christakis, I., et al. Learning curve of vessel cannulation in rats using cumulative sum analysis. Journal of Surgical Research. 193 (1), 69-76 (2015).
- Nm, S., Oduola, A. Haematological profile shows that Inbred Sprague Dawley rats have exceptional promise for use in biomedical and pharmacological studies. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences. 4 (37), 33-37 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- He, Q. L., et al. Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method. PLoS One. 12 (12), 18 (2017).
- EPA. Recommendations for and Documentation of Biological Values for Use in Risk Assessment. U.S. Environmental Protection Agency. , EPA/600/6-87/008 (NTIS PB88179874) (1988).
- Gaud, N., et al. Single jugular vein cannulated rats may not be suitable for intravenous pharmacokinetic screening of high logP compounds. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 99, 272-278 (2017).
- Turck, D., et al.
- Aghazadeh-Habashi, A., Jamali, F. Pharmacokinetics of meloxicam administered as regular and fast dissolving formulations to the rat: Influence of gastrointestinal dysfunction on the relative bioavailability of two formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 70 (3), 889-894 (2008).
- Ludwig, E., et al. Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).
- Zhang, R. X., et al. Nanoparticulate drug delivery strategies to address intestinal cytochrome P450 CYP3A4 metabolism towards personalized medicine. Pharmaceutics. 13 (8), (2021).
