Summary
Detaillierte mikrochirurgische Techniken werden demonstriert, um ein längerfristiges Jugularvenen-Kanülvenen-Rattenmodell für die sequentielle Blutentnahme im selben Tier zu etablieren. Physiologische und hämatologische Parameter wurden während der Erholungsphase der Ratte überwacht. Dieses Modell wurde angewendet, um die Pharmakokinetik von oral verabreichtem Polyphenol zu untersuchen, ohne Tierstress zu induzieren.
Abstract
Die Blutentnahme bei kleinen Labortieren ist für die pharmazeutische Leitlinienoptimierung notwendig, kann aber Versuchstieren großen Schaden und Stress zufügen, was sich möglicherweise auf die Ergebnisse auswirken könnte. Die Jugularvenenkanülierung (JVC) bei Ratten ist ein weit verbreitetes Modell für die wiederholte Blutentnahme, erfordert jedoch eine angemessene Ausbildung der chirurgischen Fähigkeiten und der Tierpflege. Dieser Artikel beschreibt die mikrochirurgischen Verfahren zur Etablierung und Aufrechterhaltung eines permanenten JVC-Rattenmodells mit besonderem Schwerpunkt auf der Platzierung und Versiegelung der Jugularkanüle. Die Bedeutung der Überwachung physiologischer (z. B. Körpergewicht, Nahrung und Wasseraufnahme) und hämatologische Parameter wurde mit Ergebnissen hervorgehoben, die 6 Tage nach der Operation während der Genesung der Ratte präsentiert wurden. Das Wirkstoff-Plasma-Konzentrations-Zeit-Profil der oral verabreichten natürlichen Phenol-Ellagsäure wurde im JVC-Rattenmodell bestimmt.
Introduction
Die wiederholte Erfassung von Blutproben von kleinen Labortieren wie Nagetieren, Meerschweinchen und Kaninchen ist ein wichtiger Aspekt für die pharmazeutische Bleioptimierung und auch für die Reduzierung der Anzahl der in der Forschung verwendeten Tiere 1,2. Die Pipeline für die Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente und Arzneimittelformulierungen (z. B. Impfstoff) erfordert Zugang zu verschiedenen Blutmengen, um ihre Robustheit und Leistung in vivo zu bewerten, wie Pharmakokinetik (PK), Toxizität und Empfindlichkeit 3,4,5.
Der Laboransatz zur Blutprobenentnahme wird grob in zwei Arten eingeteilt, chirurgische und nicht-chirurgische6. Der nicht-chirurgische Ansatz ist für den Forscher relativ leicht zu verstehen, der gängige Techniken wie Herzpunktion, Orbitalinuspunktion und Blutung der Samphenus- und Schwanzvene umfasst. Eine mehrfache Blutentnahme ist durch einige nicht-chirurgische Methoden möglich, aber das Probenvolumen ist klein und kann zu körperlichen Wunden und psychischen Belastungen für die Tiere führen1. Auf der anderen Seite ist der chirurgische Ansatz eine beliebte Alternative zur wiederholten Venenpunktion und beinhaltet das Einsetzen einer temporären oder permanenten Kanüle in die Blutgefäße von Tieren 7,8,9. Das große Blutvolumen konnte bei bewussten Ratten wiederholt durch die Kanüle entnommen werden, wobei Stress und Schmerzen aufgrund der Handhabungstechnik, der Zurückhaltung und der Anästhesie vermiedenwurden 7,8,10,11. Die Kanülenimplantation erfordert jedoch einen erfahrenen Forscher mit ausreichender Ausbildung, um das Blut erfolgreich zu sammeln.
Die Blutentnahme durch Jugularvenenkanülierung (JVC) bei Ratten ist die am weitesten verbreitete Methode zur Untersuchung des Arzneimittels PK 6,10,12,13. Die Etablierung des JVC-Rattenmodells erfordert jedoch eine sorgfältige Praxis mikrochirurgischer Fähigkeiten und Kenntnisse der postoperativen Versorgung und Wartung. Insbesondere nach der Operation benötigt die Ratte die Verabreichung von Analgetika und eine ausreichende Erholungszeit, um einen stabilen physiologischen Zustand für weitere Experimente zu erreichen13,14,15. Obwohl die Körpergewichtszunahme (d.h. >10 g) ein gültiger und häufig angewendeter Indikator für die Genesung der Ratte ist, ist es nicht ungewöhnlich, dass die Ratten postoperativ aufgrund von Dehydrierung, Infektion und Entzündung einen unerwarteten Tod haben, was zu Beginn subtil sein könnte14,15. Darüber hinaus bleibt die Katheterobstruktion im JVC-Modell ein Problem während der Blutentnahme.
Das vorliegende Protokoll hat detailliert die mikrochirurgischen Verfahren für JVC bei einer anästhesierten Ratte mit besonderem Schwerpunkt auf der Identifizierung, Isolierung und Kanülierung der Vena jugularis demonstriert. Die Bedeutung der physiologischen und hämatologischen Überwachung der Ratten während der Erholungsphase wird hervorgehoben. Schließlich wurden serielle Blutproben durch den Venenkatheter entnommen, um die PK der oral verabreichten natürlichen Phenolelagsäure mit schlechter Bioverfügbarkeit (d. h. niedriger systemischer Konzentration) zu untersuchen, um das JVC-Rattenmodell zu überprüfen.
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Protocol
Die unten beschriebenen Verfahren wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northwestern Polytechnical University (Nr. 202101117) genehmigt wurde.
1. Präoperative Vorbereitung (am Tag vor der Operation)
HINWEIS: Erforderliche Lösungen: normale Kochsalzlösung (0,9% w / v Natriumchlorid), heparinisierte Kochsalzlösung (1% w / v Heparin-Natrium), Katheterverschlusslösung, nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID), wie Meloxicam-Lösung (2 mg / ml).
- Lösungsvorbereitung
- Aliquot 200 μL vorverpackte Katheterverschlusslösung in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Die Katheterverschlusslösung besteht aus heparinisierter Kochsalzlösung (0,4% v / v Heparin-Natrium), gemischt mit Glycerin (v / v, 1: 1). - Mischen Sie 1 g Heparin-Natrium in 100 ml der normalen Kochsalzlösung, um 1% heparinisierte Kochsalzlösung zuzubereiten.
- Meloxicam in normaler Kochsalzlösung auflösen, um eine 2 mg / ml Konzentrationslösung zur postoperativen Schmerzlinderung vorzubereiten.
HINWEIS: Vorbereitete heparinisierte Kochsalzlösung und Meloxicam-Lösung werden durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Alle Lösungen werden sterilisiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 ° C gelagert.
- Aliquot 200 μL vorverpackte Katheterverschlusslösung in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Chirurgische Instrumente und Materialien
- Packen Sie alle sauberen chirurgischen Werkzeuge in einen Beutel und kleben Sie ihn mit einem Stück Autoklav-Sterilisationsband ab. In Abbildung 1A finden Sie die spezifischen verwendeten chirurgischen Instrumente.
- Autoklavieren Sie den OP-Beutel bei 121 °C für 30 min für den nächsten Tag.
- Tierzubereitung
- Halten Sie vor der Operation alle männlichen Sprague-Dawley (SD) -Ratten im Standard-Tierraum mit kontrollierter Temperatur bei 22 ± 1 ° C unter. Füttern Sie sie mindestens 7 Tage lang mit dem Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum .
HINWEIS: Sowohl männliche als auch weibliche Ratten können für das JVC-Modell verwendet werden, und ihr typisches Alter und Körpergewicht variieren von 9-14 Wochen bzw. 294 ± 57 g. - Anästhesieren Sie die Ratte mit 3% -3,5% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff in einer Voranästhesiekammer. Stellen Sie fest, ob die Ratte durch die fehlende Reaktion auf Fußnot bewusstlos wird.
- Nehmen Sie die Ratte vorsichtig heraus und legen Sie die Nase der Ratte in einen Anästhesie-Nasenhalter, der 2% -2,5% Isofluran liefert.
- Entfernen Sie das Fell in Bauch- und Rückenlage gründlich um die rechte Schulter und den hinteren Nackenbereich mit Enthaarungscreme und einem Tierrasierer. Bringen Sie die Ratte in den Käfig zurück, damit sie am nächsten Tag operiert werden soll.
- Halten Sie vor der Operation alle männlichen Sprague-Dawley (SD) -Ratten im Standard-Tierraum mit kontrollierter Temperatur bei 22 ± 1 ° C unter. Füttern Sie sie mindestens 7 Tage lang mit dem Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum .
2. Vor der Operation am Tag
- Vorbereiten des aseptischen Arbeitsplatzes
- Sprühen Sie 75% medizinischen Alkohol ein, um den Operationsbereich zu desinfizieren, und legen Sie dann das Heizkissen mit einem sauberen Kissen bedeckt. Stellen Sie die LED-Lampe mit einer Kaltlichtquelle neben dem Arbeitsplatz ein.
- Die benötigten Lösungen (Schritt 1.1) auf Raumtemperatur vorwärmen.
- Füllen Sie 0,6 ml heparinisierte Kochsalzlösung und 0,15 ml Katheterverschlusslösung in zwei sterile 1,0 ml stumpf bestückte Spritzen. Entnehmen Sie 2,5 ml der normalen Kochsalzlösung mit einer sterilen 5,0 ml Spritze.
- Weichen Sie die Wattebällchen in 75% medizinischem Alkohol ein. Drücken Sie überschüssiges Ethanol vor dem Gebrauch aus.
- Wiegen und notieren Sie das Körpergewicht der Ratte.
3. Während der Operation
- Chirurgische Vorbereitung
- Tragen Sie den OP-Mantel, sterile Handschuhe und Gesichtsmaske. Öffnen Sie dann den sterilisierten chirurgischen Beutel, lassen Sie alle chirurgischen Werkzeuge in 75% medizinischem Alkohol und trocknen Sie sie vor dem Gebrauch.
- Jugularvenen-Isolierung
HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 10 min.- Anästhesieren Sie die operationsbereite und rasierte Ratte mit 3% -3,5% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff in einer Induktionskammer, und stellen Sie fest, ob die Ratte durch die fehlende Reaktion auf Fußnot bewusstlos wird.
- Legen Sie die Nase der Ratte in den mit 2% -2,5% Isofluran gelieferten Rechenstück, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Subkutan injizieren (s.q.) Meloxicam Lösung in einer Dosis von 2 mg/kg.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Analgetika auswählen, die nicht mit der interessierenden Arzneimittelverbindung in der pharmakokinetischen Studie interagieren. - Halten Sie mit Klebeband die Unterarme der Ratte in ihrer Bauchlage zu jeder Seite der chirurgischen Plattform fest.
- Schrubben Sie den Operationsbereich vorsichtig, indem Sie zwischen Wattebällchen, die mit 75% medizinischem Alkohol getränkt sind, und Jod-basiertem Peeling für insgesamt drei Mal wechseln.
- Heben Sie die Haut vorsichtig in der Nähe des Schlüsselbeins auf der rechten Seite der Mittellinie des Halses mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in Richtung Brust von etwa 1,5-2,0 cm Länge.
- Sezieren Sie die dünne Gewebehülle stumpf mit einer Irisschere, um die darunter liegende Halsvene freizulegen. Das proximale cephalische Ende der Vena jugularis external besteht aus zwei Ästen, die visuell identifiziert werden können.
HINWEIS: Je nach Alter und Geschlecht der Ratte variiert das Weichgewebe (z. B. Speicheldrüsen, Lymphknoten und Fettgewebe), das die Halsvene bedeckt. Im Vergleich zu den jungen Ratten sind die alten Ratten dicker (z.B. BW > 300 g) und benötigen daher mehr Gewebetrennung, bevor die Halsvene sichtbar wird. - Heben Sie die Vena jugularis zusammen mit ihrem Bindemembrangewebe an, um die Lymphdrüse zu visualisieren, die an der Vena jugularis befestigt ist. Trennen Sie die Vene vorsichtig entlang der Gefäßrichtung von den umliegenden Muskeln, Fett und anderen Geweben.
- Stoßen Sie die Pinzette unter die Vena jugularis, ohne die Kollateralblutgefäße zu beschädigen, und führen Sie zwei Stücke 6-0-Naht unter die Vene, um die beiden Enden des Blutgefäßes einzeln zu markieren.
- Ziehen Sie ein Stück der Naht so weit wie möglich in Richtung Rattenkopf und ligiieren Sie die Vene mit 2-3 Knoten mit einer Pinzette schädelnd.
- Legen Sie die zweite Ligatur auf das kaudale Ende der Vene mit 1 losen Knoten.
- Jugularvenen-Kanülierung
HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 15 min.- Öffnen Sie die Packung mit dem 11 cm Polyurethan (PU)-Katheter (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Abbildung 1B) und befestigen Sie den Katheter an der vorbereiteten stumpf bestückten Spritze, die mit der heparinisierten Kochsalzlösung gefüllt ist.
- Drücken Sie die heparinisierte Kochsalzlösung langsam in den Katheter, um Luftblasen zu vermeiden.
- Stoßen Sie die flache Seite der Pinzette ohne Spitze unter die Vena jugularis an, um auf der anderen Seite auszutreten. Machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt auf der Vene in der Nähe der Schädelbindung mit einer Castroviejo-Mikroschere und öffnen Sie den Schnitt vorsichtig mit der Spitze der Ellenbogengefäß-Dilatatorzange.
HINWEIS: Spülen Sie den Schnitt mit vorgewärmter normaler Kochsalzlösung (37 ° C) ab, wenn eine kleine Menge Blut austritt. - Schneiden Sie die schräge Öffnung des vorderen Endes des Halsvenenkatheters aus. Klemmen Sie das schräge Ende des Rohres mit einer Pinzette ein und schieben Sie es in die Halsvene.
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert möglicherweise eine andere Person, um das Schieben des Katheters zu erleichtern. - Während Sie den Katheter vorrücken, ziehen Sie langsam die mikrochirurgische Zange des Ellenbogens zurück und klemmen Sie die Außenfläche des Gefäßes mit einer Pinzette ein.
HINWEIS: Wenn das richtige Blutgefäß ausgewählt und die Spitze des Katheters erfolgreich in das Blutgefäß geschoben wird, sollte der gesamte Kathetereinführungsprozess keinen Strömungswiderstand spüren. - Beenden Sie das Einsetzen des Katheters, wenn Sie die erste blaue Markierung des PU-Röhrchens treffen (Abbildung 1B), das etwa 3,0 cm lang ist.
- Befestigen Sie den eingeführten Katheter mit einer Pinzette sowohl mit kaudalen als auch mit rostralen Ligaturen an der Vene.
- Eine 6-0-Naht mit einer Nahtnadel (1/2 gebogener Schnitt, 12 mm) durch das freiliegende Gewebe auf der rechten Seite des Schnitts fädeln und die Ligatur mit einem Hämostat binden.
- Biegen Sie den Katheter an der zweiten blauen Markierung (Abbildung 1B), um mit der gleichen Ligatur zu binden (in Schritt 3.3.8) und um zu vermeiden, dass der PU-Schlauch verdeckt wird.
- Schneiden Sie den gesamten zusätzlichen Nahtfaden ab und schließen Sie den Katheter, indem Sie die stumpfe Spritze mit Spitze durch einen 22-G-Edelstahlstopfen ersetzen.
- Katheter-Exteriorisation
HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 10 min.- Legen Sie die Ratte in die Rückenposition und reinigen Sie den Bereich zwischen den Schulterblättern vorsichtig mit dem Wattebausch, der mit 75% medizinischem Alkohol getränkt ist.
- Machen Sie einen sehr kleinen Schnitt in der Mitte des Rückenhalses mit einer chirurgischen Schere. Durch den dorsalen Schnitt führen und drücken Sie den Trochar unter der Haut sanft in Richtung des ventralen Schnitts auf der rechten Seite des Halses.
- Setzen Sie den Venenkatheter in den Trochar und ziehen Sie ihn dann heraus und führen Sie den Venenkatheter zum dorsalen Schnitt.
- Befestigen Sie den äußeren Katheter auf die gleiche Weise wie die Naht in die Muskelschicht (siehe Verfahren in den Schritten 3.3.8 und 3.3.9).
- Schließen Sie die Hautschicht von ventralen und dorsalen Schnitten mit der 6-0 Nylonnaht und Nahtnadel (3/8 gebogener Schnitt, 17 mm). Alle chirurgischen Schnitte mit Iodophor abtupfen.
HINWEIS: Die Wundclips sind eine alternative Methode, um den Hautschnitt zu schließen. - Entfernen Sie den Katheterstopfen, indem Sie den Katheter mit den Fingerspitzen umklammern. Legen Sie eine neue stumpfe Spritze und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um den Blutfluss zu testen.
HINWEIS: Da sich die Ratte in Rückenlage befindet, kann es sein, dass man keine Blutproben erhalten kann. Blutproben konnten durch Wechsel in eine seitliche Körperposition gewonnen werden. - Halten Sie den Katheter erneut mit den Fingerspitzen und injizieren Sie 0,2 ml heparinisierte Kochsalzlösung und 0,1 ml Sperrlösung mit der stumpfen Spritze in den Katheter.
- Halten Sie den Katheter mit den Fingerspitzen fest und ersetzen Sie die Spritze durch einen Edelstahlstecker. Lösen Sie den Katheter und drücken Sie den Stecker leicht hinein, um die Dichtigkeit des Katheters zu gewährleisten.
4. Sofortige postoperative Versorgung
- Holen Sie die Ratte in der Position des dorsalen Dekubitus zurück, indem Sie sie einzeln mit frischer Maiskolbeneinstreu einsperren. Stellen Sie häufig ein temperaturgeregeltes Heizkissen zur Verfügung, um die Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Für das Tierwohl ist das Belassen von Nahrung und Wasser auf der Bettwäsche ein wirksamer Weg, um die Schmerzen zu lindern, die durch Nackenbewegungen beim Essen und Trinken verursacht werden. - Zeichnen Sie die Endzeit der Operation auf und überwachen Sie die Ratte in 2-Stunden-Intervallen für mindestens 4 Stunden. Sorgen Sie für zusätzliche Analgesie für die Genesung, wenn die Ratte Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zeigt.
5. Physiologische und hämatologische Überwachung während der Erholungsphase
- Überwachen Sie täglich das Körpergewicht und die Nahrungs- und Wasseraufnahme und zeichnen Sie die Daten auf.
- Um eine kleine Menge frisches Blut für den hämatologischen Test zu sammeln, legen Sie die Ratte in einen Rückhaltegurt. Öffnen Sie den Stecker und führen Sie die Spritze in den venösen PU-Katheter ein, um sicherzustellen, dass der Katheter nicht verstopft wird.
HINWEIS: Die Blutentnahme wurde täglich zur gleichen Zeit an 6 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. - Entsorgen Sie das anfänglich entnommene Blut, das eine Mischung aus Blut, heparinisierter Kochsalzlösung und Katheterverschlusslösung enthält.
- Verwenden Sie eine neue Spritze, um 150 μL frische Blutprobe zu sammeln und die Blutprobe in das 0,5 ml Röhrchen zu übertragen, das K2EDTA (1,8 mg / ml Blut) enthält, das an der Röhrenwand getrocknet ist.
HINWEIS: Wenn der Katheter blockiert ist, können 0,2 ml heparinisierte Kochsalzlösung in den Katheter injiziert werden, um den Katheter einige Minuten vor der nächsten Blutentnahmezeit zu spülen. - Injizieren Sie sterile Kochsalzlösung im gleichen Volumen, um das entnommene Blut auszugleichen. Injizieren Sie 150 μL vorgewärmte normale Kochsalzlösung (37 °C) und infundieren Sie 0,2 ml sterile heparinisierte normale Kochsalzlösung durch den Katheter.
- Injizieren Sie 100 μL der Verschlusslösung in den Katheter, um die Versiegelung und Sterilität des Katheters vor der nächsten Probenentnahme sicherzustellen.
- Analysieren Sie die Blutproben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme mit einem automatisierten Blutzellzähler.
6. Wiederholte Blutentnahme für pharmakokinetische Studien des oral verabreichten Arzneimittels
HINWEIS: Es wird empfohlen, Ratten mit einer Gewichtszunahme >10 g und einem stabilen hämatologischen Niveau für zukünftige Studien aufzunehmen. Nach dem aktuellen Protokoll benötigten die JVC-Ratten 4 bis 6 Tage, um sich zu erholen.
- Nach 4-6 Tagen der Operation fasten Sie die Ratte für 12 h mit freiem Zugang zu Wasser.
HINWEIS: Je nach Versuchsziel ist das Fasten des Tieres optional. - Oral wird die gefastete Ratte mit natürlichem Phenol bioaktiver Ellagsäure in einer Dosis von 6 mg/kg mit einer geraden Gavage-Nadel16 untersucht.
- Sammeln Sie 200 μL Blutproben in den heparinisierten Röhrchen über die Venenkanüle jugularis zu vorbestimmten Zeitpunkten über 24 h postorale Verabreichung. Der Blutentnahmeprozess folgt dem Verfahren in Schritt 5.5.
HINWEIS: Der Katheter muss nicht mit der Verriegelungslösung verschlossen werden, bis die Blutentnahme abgeschlossen ist. - Zentrifugieren Sie die Blutprobe sofort bei 3000 x g bei 4 °C für 10 min.
- Analysieren Sie die extrahierte Plasmaprobe mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie17,18.
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Representative Results
Dieses Protokoll hat gründlich gezeigt, wie man ein langfristiges JVC-Modell unter Verwendung mikrochirurgischer Fähigkeiten für die serielle Blutentnahme etabliert. Abbildung 1A zeigt die wesentlichen chirurgischen Instrumente und Materialien, die für die Durchführung der Operation verwendet werden. Die Spezifikation des PU-Katheters mit drei blauen Markierungen wird ebenfalls veranschaulicht, was hilfreich ist, um den Forscher in Schritt 3.3 zu führen, wie die Markierungen auf dem PU-Katheter zur Führung der Kanüle verwendet werden (Abbildung 1B). Es ist auch wichtig, sich des Zeitplans bewusst zu sein, der für die Etablierung des JVC-Rattenmodells erforderlich ist (Abbildung 1C). Obwohl die Operationszeit für das JVC ungefähr 35 Minuten beträgt, dauert es, wenn der Forscher geschickt ist, 10-14 Tage (die Anpassungs- und Erholungsphase), bis das JVC-Rattenmodell einsatzbereit ist, verglichen mit dem nicht-chirurgischen Ansatz, wie dem Schwanzschneiden oder der Punktion der Orbitalhöhle, die sofort mit dem richtigen Training verwendet werden kann.
Die physiologischen und hämatologischen Bedingungen über 6 Tage postoperativ wurden ebenfalls untersucht (Abbildung 2). Die Körpergewichtszunahme der Ratte, die Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie die vollständige Anzahl der Blutzellen waren während der Erholungsphase variabel (Abbildung 2A, B). Es wurde festgestellt, dass sich die Mehrheit der Ratten unter der vorliegenden Studienbedingung innerhalb von 4-6 Tagen nach der Operation erholt, was durch wiederhergestellte Spiegel einiger Schlüsselmerkmale wie Körpergewichtszunahme >10 g, regelmäßige Nahrungsaufnahme und ausgewählte Blutbestandteile in Bezug auf Infektionen, Dehydrierung und Entzündungen, einschließlich der Anzahl der weißen Blutkörperchen, der Anzahl der roten Blutkörperchen, Hämoglobin- und Thrombozytenzahl (Abbildung 2C-F). Es ist erwähnenswert, dass die Wasseraufnahme bei Ratten am ersten Tag nach der Operation relativ groß war, was auf eine Austrocknung hindeutet.
Die Pharmakokinetik des natürlichen Polyphenols Ellagsäure wurde im etablierten JVC-Rattenmodell untersucht (Abbildung 3). Die Ellagsäure zeichnet sich durch eine schlechte Bioverfügbarkeit des Arzneimittels aus. Bei Verabreichung in einer niedrigen Dosis (z. B. 6 mg/kg) ist eine große Menge Blutprobe erforderlich, um ihre Konzentration im Plasma nachzuweisen. Abbildung 3 zeigt eine niedrige Plasmakonzentrations-Ellagsäurekonzentration in ng/ml über 24 h und ihre abwechslungsreiche Absorption im Magen-Darm-Trakt (GIT) aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und Permeabilität.
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien, die für die Etablierung von JVC-Rattenmodellen verwendet werden. (A) Oben: A-D ist normale Kochsalzlösung, Jodoffhor, Kunststoffwaren, Sprühflasche mit 75% medizinischem Alkohol; Mitte: e-o ist 5,0 ml Spritze, 1,0 ml Spritze, stumpf bestückte Spritze, sterile Kanüle, chirurgische Schere, Irisschere, halb gekrümmte Pinzette, Gefäßdilatator ausgewogene Pinzette, Castroviejo Mikroschere, Edelstahl Trochar, Haustierrasierer, jeweils; Boden: P-W besteht aus Wattestäbchen, 6-0 sterilem, nicht resorbierbarem Nylon-Nahtfaden, Wattebällchen, zwei Arten von Nahtnadeln, Edelstahlstopfen, gebogenem Hämostat, Klebeband, Anästhesie-Nasenstück. (B) Spezifikation des PU-Katheters, der zur Kanülierung der Vena jugularis bei Ratten verwendet wird. Der Katheter ist 11 mm in der Gesamtlänge mit O.D 0,6 mm x I.D 0,9 mm. Der Katheter hat drei blaue Markierungen, die während der Kanülierung als Ankerpunkt dienen; (C) Vorgeschlagener Zeitplan für die Einrichtung des JVC-Rattenmodells. In dieser Studie wurden das Körpergewicht der Ratte sowie die Nahrungs- und Wasseraufnahme während der Erholungsphase täglich aufgezeichnet, und Blutproben wurden einmal täglich zur routinemäßigen hämatologischen Überwachung gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Physiologische und hämatologische Überwachung von Ratten über 6 Tage postoperativ. (A) Veränderung des Körpergewichts; b) die Veränderung der Wasser- und Nahrungsaufnahme; (C-F) Anzahl der weißen Blutkörperchen, Anzahl der roten Blutkörperchen, Hämoglobin und Thrombozytenzahl. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM mit n = 6 dar. Die numerischen Werte in blau stellen den Mittelwert dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Plasma-Ellagsäure-Konzentrations-Zeit-Profile von Ratten über 24 h nach oraler Gavage. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM mit n = 3 dar. Die Werte der PK-Parameter werden mit dem Zusatzprogramm PKSolver in einer Tabellenkalkulationssoftware (z.B. Microsoft Excel)19 ermittelt. C max: Spitzenkonzentration, T max: Zeit bis zum Erreichen von Cmax; AUCinf: Bereich unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve von Zeit Null bis Unendlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Beherrschung der Technik der Schiffskanülierung erfordert erhebliche Übung und das Lernen der Lektion aus jeder Operation. Christakis et al. fanden unter Verwendung der kumulativen Summenanalyse (CUSUM) heraus, dass ein Forscher 200 Ratten über einen Zeitraum von einem Jahr üben muss, bevor er für die PK-Bewertung von Arzneimittelkandidatenbereit ist 20. Die für die Venenkanülierung erforderliche Betriebszeit kann jedoch durch die Anzahl der durchgeführten Rattenum 13,20 deutlich reduziert werden. Unter Verwendung unseres Protokolls stieg die Erfolgsrate der effektiven Kanülvene und der Entnahme der Blutprobe von etwa 50% auf über 80% (insgesamt wurden 15 Ratten durchgeführt), und die anfängliche Betriebszeit wurde von 2 h auf 35 min reduziert.
Die Demonstration der Etablierung eines JVC-Rattenmodells umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist der Inzisionsbereich um den Hals wichtig, um die Halsvene zunächst zu lokalisieren. Wenn die rechte JVC durchgeführt wird, wird der Schnittbereich im Allgemeinen auf der Oberseite des Schlüsselbeins entlang der rechten Seite der Halsmittellinie ausgewählt (siehe Abschnitt 3.2 Jugularvenenisolation). Zweitens hängt JVC von der Vorbereitung eines sauberen Segments der Vene ab. Bei stumpfer Dissektion von Weichgewebe ist die Halsvene sichtbar und durch diese beiden Merkmale identifiziert: 1) zwei Zweige am proximalen Ende und 2) ein Lymphknoten, der daran befestigt ist. Drittens könnte beim Schieben des Katheters in die Vena jugularis (siehe Abschnitt 3.3 Venenkanülierung), das Beschneiden des vorderen Endes des Katheters und das Stützen des Blutgefäßes mit stetiger äußerer Kraft die Erfolgsrate der Kanülierung erheblich verbessern. Darüber hinaus muss eine angemessene Analgesie und Wärme zur Verfügung gestellt werden, um die Ratte zu trösten, da Stress und Schmerzen Veränderungen im Verhalten der Tiere verursachen können, die ihre postoperative Genesung beeinflussen können. Schließlich können die Dauer der Anästhesie, der Wärmeverlust und die Komplikation zu einem unerwarteten Tod der Ratte führen. Daher ist es wichtig, die Ratten während und nach der Operation für mindestens 3 Tage genau zu überwachen. Die Bewertung mehrerer Gesundheitsindikatoren, wie die Körpergewichtszunahme, die Ernährung und der Trinkstatus sowie die hämatologischen Komponenten von Ratten während der Erholungsphase, könnte Informationen liefern, die mit den Referenzwerten für gesunde SD-Ratten in der Datenbank21,22,23,24 verglichen werden können. . Wenn bei Ratten eine Dehydrierung auftritt, können am Ende der Operation sterile isotonische Flüssigkeiten mit 3% -5% des Körpergewichts subkutan injiziert werden, um den Flüssigkeitsverlust auszugleichen. Die meisten Ratten nehmen ihr Körpergewicht (z. B. >10 g) bis zum 3. Tag nach der Operation zu und sollten daher einsatzbereit sein. Für Studien mit der Bewertung von Blutbiomarkern (z. B. Leukozyten, Zytokine) wird jedoch empfohlen, die Ratten bis zum Tag 4-6 nach der Operation einzuschreiben, um die normalen hämatologischen Indizes für Ratten sicherzustellen.
Trotz seiner Nützlichkeit in der PK-Studie, abhängig von den Kathetermaterialien, sind nicht alle Arzneimittelkandidaten für die einzelne Kanülierung geeignet. Gaud et al. fanden heraus, dass hohe log P-Verbindungen an das PE-Kathetermaterial gebunden waren, was zu einer veränderten PK25 führte. Darüber hinaus werden die Analgetika (z. B. Meloxicam) häufig angewendet, um die Schmerzen bei Ratten nach der Operation zu lindern. Wenn man bedenkt, dass die Eliminationshalbwertszeit von Meloxicam etwa 19-23 h26,27 beträgt, wird die Einzeldosis von Meloxicam (2 mg/kg), die s.q. injiziert wird, nach 24 h fast aus dem Körper entfernt. Dennoch können potenzielle Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Medikamenten bei der Verwendung von Meloxicam auftreten. Zum Beispiel kann Meloxicam mit anderen Medikamenten für Cytochrom P450 Stoffwechsel28,29 konkurrieren. Daher sollten die Dosis und die Art der ausgewählten Analgetika in Abhängigkeit von dem für die pharmakokinetische Studie ausgewählten Arzneimittel untersucht werden. Wenn das Medikament von Interesse mit Meloxicam interagiert, können andere Schmerzmittel (z. B. Buprenorphin) verwendet werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll gründlich gezeigt hat, wie ein Langzeit-JVC-Rattenmodell für die Blutentnahme im Labor etabliert und der physiologische Status von Ratten während der postoperativen Erholungsphase untersucht werden kann. Die hervorgehobenen wichtigen chirurgischen Schritte und Erfahrungen könnten für den Forscher hilfreich sein, um die Anwendung des Kanülierungsmodells effizient zu erreichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82003692) an R.X. Zhang unterstützt; Top-Stipendium an der Northwestern Polytechnical University für R. Miao.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant | Xinkang | N/A | collecting blood samples for hematology test |
| 0.5*20 mm 1.0-mL syringe | KLMEDICAL | N/A | washing or replacing the fluid with saline |
| 0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe | HD | N/A | Subcutaneous injection |
| 1.0-mL Blunt tipped syringe (22G) | skillsmodel | S4-PKT22G | Inject the saline and collect blood samples through catheter |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | blood collection |
| 1/2 circle cutting 5*12 mm suture needle | skillsmodel | S4-FHZ | Thread the muscle layer to fix the catheter |
| 3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle | skillsmodel | S5-FHZ | Suture the incision of rat cortex |
| 6-0 sterile non-absorbable silk suture thread | JUNSHENG | N/A | ligature |
| 75% medical alcohol | HONGSONG | N/A | Disinfection |
| Adhensive tape | LIUTAI | N/A | positioning the rat |
| Autoclave sterilization tape | Biosharp | BS-QT-028 | Mark sterilized items |
| Automated blood cell counter | Sysmex | XN-550 | Hematology test |
| Castroviejo micro scissors | skillsmodel | WA1010 | Cut the opening in the blood vessel |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002402 | Plasma preparation |
| Clean cushion | Qingjie | N/A | Prepare the operation area |
| Cotton balls | HC | N/A | Wound disinfection and sterilization |
| Cotton swabs | BEITAGOGO | N/A | Disinfection |
| Curved hemostat | skillsmodel | N/A | ligature |
| DN50 Stainless-steel rat restrainer | skillsmodel | S4-RGDQ1 | Restrict the movement of rats for easy operation |
| Ellagic acid | Aladdin | E102710-25g | natural phenol for oral administration |
| Half-curved forceps | skillsmodel | 53072 | Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture |
| Heating pad | Warm mate | N/A | preventing heat loss of animal |
| Heparin sodium | Solarbio | H8060 | anticoagulant |
| Iodophor | Xidebao | N/A | Clean the wound |
| Iris scissors | skillsmodel | 54002 | Bluent separation the muscle layer |
| Isoflurane | RWD | R510-22-16 | anaesthesia |
| LED lamp | EMPERORFEEL | N/A | sugery |
| Liquid chromatography-mass spectroscopy | Thermo Fisher Scientific | VQF01-20001/ TSQ02-10002 | detection of drug concentration in plasma |
| Meloxicam | Hongqiang | N/A | Analgesic |
| Normal saline | KL | N/A | Prepara the solution and protect blood vessels from drying out |
| Pet razor | Codos | 3180 | Shaving the fur |
| Phosphate-buffered saline | ZHHC | PW012 | Preparation of Ellagic acid solution |
| PU catheter | skillsmodel | RJVC-PU | Jugular vein cannulation |
| Small animal operation anesthesia console | RWD | 68620 | Operation workstation |
| Spray bottle | Other | N/A | aseptic workstation |
| Stainless steel plug (22G) | skillsmodel | S4-PKD22G | Plug the catheter to ensure its sealing |
| Stainless steel trochar | skillsmodel | S$-PKDGZ | Guide the catheter exteriorization |
| Sterile lock solution | skillsmodel | SK-FB | lock the catheter to ensure its sterility |
| Straight feeding needle | skillsmodel | N/A | Oral gavage |
| Surgical pouch | BKMAM | N/A | container for sterilization of surgical instruments |
| Surgical scissors | skillsmodel | J21070 | Cut incision on rat skin |
| Vessel dilator balanced forceps | skillsmodel | WA3020 | Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in |
| ZS-MV Small animal anesthesia machine | ZSLab | 1057003 | inducing and maintaining anaesthesia |
References
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