Summary
Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.
Abstract
Eine Vielzahl von genetischen Programmen wird während der Embryonalentwicklung aktiviert, die die Zelldifferenzierung orchestrieren, um eine erstaunliche Vielfalt an somatischen Zellen, Geweben und Organen zu erzeugen. Die präzise Aktivierung dieser genetischen Programme wird durch Morphogene reguliert, diffusible Moleküle, die das Zellschicksal an verschiedenen Schwellenwerten lenken. Um zu verstehen, wie die genetische Aktivierung die Morphogenese koordiniert, müssen lokale Wechselwirkungen untersucht werden, die während der Entwicklung durch Morphogene ausgelöst werden. Die Verwendung von Perlen, die mit Proteinen getränkt sind, oder von Medikamenten, die in verschiedene Regionen des Embryos implantiert werden, ermöglicht es, die Rolle bestimmter Moleküle bei der Etablierung von Ziffern und anderen Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Diese experimentelle Technik liefert Informationen über die Kontrolle der Zellinduktion, des Zellschicksals und der Musterbildung. Somit ist dieser durchnässte Perlen-Assay ein äußerst leistungsfähiges und wertvolles experimentelles Werkzeug, das auf andere embryonale Modelle anwendbar ist.
Introduction
Durchbrüche in den molekularen Mechanismen, die die Genexpression während der Embryonalentwicklung steuern, haben es uns ermöglicht zu verstehen, wie das Schicksal der Zellen bestimmt wird. Die Bindung an verschiedene Zelllinien erfolgt, sobald die Zellen mit der molekularen Expression von Transkriptionsfaktoren1 beginnen. Dieses Expressionsmuster ist räumlich und zeitlich hochgradig koordiniert und steuert dadurch die Formgebung, Positionierung und Musterung von Zellen, Geweben und Organen 1,2,3,4,5. Die embryonale Induktion ist der Prozess, bei dem Zellen an bestimmte Linien gebunden werden, indem sie Hierarchien aufbauen, die die Potentialität der Zellen einschränken, die sogar die Generierung des grundlegenden Körperplans umfassen, wie es beim Spemann-Organizer 6,7 der Fall ist. Die blastopore dorsale Lippe induziert eine zweite embryonale Achse in einem Wirtsembryo 8,9. Heute ist mit Hilfe von Pfropfung und anderen klassischen Experimenten in Kombination mit molekularen Ansätzen bekannt, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren die embryonale Induktion im Spemann-Organizer10 steuern. Daher ist die experimentelle Manipulation ein wichtiges Werkzeug, um Zelldifferenzierungs-, Morphogenese- und Musterungsprozesse während der Embryogenese zu verstehen.
Interessanterweise werden in embryonalen Systemen, in denen die Gewebetransplantation schwierig ist oder die Induktoren bereits bekannt sind, Träger verwendet, um Moleküle (z. B. Proteine, Chemikalien, Toxine usw.) zu liefern, um die Zelldifferenzierung, die Morphogenese und sogar die Strukturierung zu regulieren. Ein solches Trägersystem beinhaltet die Implantation von Perlen, die in einem bestimmten Molekül getränkt sind, in einen experimentellen Modellorganismus zu einem beliebigen Entwicklungszeitpunkt, um die Wirkung des genannten Reagenzes zu bestimmen oder die Differenzierung des genannten Modells zu steuern. Zum Beispiel zeigten Cheryl Tickle et al. (1985) durch die Implantation von Retinsäure (RA)-getränkten Perlen in die Hühnerflügel-Gliedmaßenknospe, dass RA die Expression von Schalligel in der Zone der Polarisationsaktivität (ZPA) induziert1,12. Die gleiche experimentelle Strategie wurde verwendet, um herauszufinden, dass RA die Asymmetrie von Somiten und den Zelltod in der Gliedmaßenknospe während der Ziffernentwicklung und in anderen embryonalen Gliedmaßenregionen kontrolliert13,14,15. Andere Faktoren, hauptsächlich Proteine (z. B. Fibroblastenwachstumsfaktoren [FGF], transformierender Wachstumsfaktor-beta [TGF-ß]), wurden verwendet, um Gliedmaßen in frühen Embryonenflanken und neue Ziffern in der interdigitalen Region zu induzieren, bzw. 16,17,18,19,20,21 . Diese Experimente belegen die Leistungsfähigkeit und den Nutzen dieser Technik zur Bestimmung des Expositionsstadiums oder der Kompetenz von Geweben oder Zellgruppen, die den Molekülen ausgesetzt sind.
In diesem Protokoll diente das Kükenglied im Stadium der Ziffernbildung als experimentelles Modell, um Schritt für Schritt darzustellen, wie die getränkten Perlen vorbereitet und implantiert werden können. Dieses experimentelle Werkzeug ist jedoch nicht auf diese Anwendung beschränkt, sondern kann in jedem experimentellen Tiermodell und zu jedem Zeitpunkt in vitro und in vivo genutzt werden, um Induktion, Differenzierung, Zelltod und Strukturierung zu untersuchen.
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Protocol
Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt.
1. Eizellinkubation und Embryo-Staging
HINWEIS: Befruchtete Hühnereier können von lokalen Bauernhöfen bezogen werden. Befruchtete Hühnereier aus weißem Leghorn werden am häufigsten verwendet. Lagern Sie die frisch befruchteten Hühnereier bis zu 1 Woche vor der Inkubation bei 15 °C.
- Die befruchteten Hühnereier vertikal mit der spitzen Seite nach unten in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit ausbrüten, bis sie die Stufe 28 HH erreichen (ca. 5,5 Tage nach Hamilton und Hamburger, 1951)22. Drehen Sie die Eier während der Inkubation, um zu verhindern, dass der Embryo an der Schalenmembran haftet.
HINWEIS: Die Wahl des Entwicklungsstadiums wird durch die experimentellen Ziele beeinflusst. In diesem Fall ist das 28 HH-Stadium optimal für die interdigitäre Perlenimplantation, um eine ektopische Ziffer zu induzieren oder den Zelltod zu fördern. - Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, tupfen Sie sie mit 70% Ethanol ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich, Mikroskope und Instrumente mit 70% Ethanol.
- Kerzen Sie das Ei, um Blutgefäße zu identifizieren und den Embryo zu lokalisieren. Verwerfen Sie Eier, die keinen Embryo haben.
- Öffnen Sie mit dem Ende einer nicht gezahnten Pinzette ein Fenster in etwa fünf Eiern, indem Sie auf das stumpfe Ende eines Eies tippen, und entfernen Sie einen 1 cm2 großen Abschnitt der Schale mit der Pinzette.
- Geben Sie das Ei in einen Karton oder Plastikhalter und legen Sie es unter das Stereomikroskop. Entfernen Sie die Luftmembran, indem Sie sie durchstechen und mit einer feinen chirurgischen Pinzette herausziehen. Entfernen Sie jedes kleine Stück Eierschale, das den Embryo berühren könnte.
HINWEIS: Die Luftmembran ist die weiße, undurchsichtige Membran, die unmittelbar nach dem Fenstern des Eies beobachtet wird. - Beobachten Sie unter dem Mikroskop, während Sie die Fruchtblase leicht öffnen und mit der feinen chirurgischen Pinzette reißen. Achten Sie darauf, das Gefäßsystem der chorioallantoischen Membran nicht zu beschädigen.
HINWEIS: Das Amnion ist die transparente Membran, die den Embryo eng umgibt und ihn in Fruchtwasser einkapselt. - Stadium die Embryonen in Ovo , um festzustellen, ob sie sich im gewünschten Stadium befinden. Embryonen in früheren Stadien können in den Inkubator zurückgebracht werden, nachdem das Eierschalenfenster mit Klebeband versiegelt wurde.
2. Perlenzubereitung
HINWEIS: Je nach Versuchsziel und Behandlung können alternative Perlentypen (z. B. Affi-Gel, AG1-X2, Heparin) besser geeignet sein. Affi-Gel-Perlen sind optimal für Proteine (z. B. TGF-ß1), während Heparin-Perlen ideal für Wachstumsfaktoren (z. B. FGFs, WNT) und AG1-X2-Perlen für Chemikalien sind, die in organischen Lösungsmitteln (z. B. DMSO) gelöst sind.
- Affi-Gel und Heparin Perlenzubereitung
- Schneiden Sie ein Quadrat aus Parafilm für eine 45-mm-Petrischale aus. Legen Sie den Parafilm über den Boden der Petrischale, um ihn abzudecken, und befestigen Sie ihn am Boden der Petrischale, indem Sie jeden Scheitelpunkt mit dem Ende der nicht gezahnten Pinzette drücken. Verwerfen.
- Übertragen Sie die Perlen mit einer Pipette oder einem Spatel in ein Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie zweimal in 1x PBS durch Absetzen und Pipettieren.
- Übertragen Sie ~ 40-50 Perlen mit einer Mikropipette in die Mitte der parafilmierten Petrischale aus Schritt 1.
- Wählen Sie mit dem Mikroskop ~ 30 Affi-Gel- oder Heparin-Perlen mit einem Durchmesser von ~ 100 μm für die Verwendung aus. Verwenden Sie ein Mikroskop-Okularabsehen, um die Perlen zu messen, oder verwenden Sie die dritte Ziffer eines HH 28-Embryos als Referenz; Die Perle muss kleiner als die Zwischenziffer sein.
- Entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich von dem überschüssigen PBS, das die Perlen umgibt, und tränken Sie sie in 2-5 μL der Behandlungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Lösung Perlen vollständig abdeckt.
- Bereiten Sie parallel Kontrollperlen vor, indem Sie in einer Lösung einweichen, die die gleiche Menge an Vehikel enthält wie in der experimentellen Behandlungslösung.
HINWEIS: Die Konzentrationen müssen für jede Behandlung gemäß dem Experiment berechnet werden. Verwenden Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung, wenn Sie mit potenziell schädlichen Reagenzien umgehen. - Inkubieren Sie die Perlen in der Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Um zu verhindern, dass die Perlen während der Inkubation austrocknen, pipettieren Sie ein paar Tropfen 1x PBS oder Wasser um die Perlen, um die lokale Atmosphäre zu befeuchten, und bedecken Sie die Schale mit Parafilm, um die Verdunstung zu verlangsamen.
- Legen Sie die Petrischale auf Eis und implantieren Sie die Perlen noch am selben Tag.
- AG 1-X2 Perlenzubereitung
- Schneiden Sie ein Quadrat aus Parafilm für eine 45-mm-Petrischale aus. Decken Sie den Boden der Petrischale mit Parafilm ab und befestigen Sie ihn, indem Sie jeden Scheitelpunkt mit dem Ende der nicht gezahnten Pinzette drücken. Verwerfen.
- Verwenden Sie einen Spatel, um die AG 1-X2-Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. 30-50 μL der Behandlungslösung in der gewünschten Endkonzentration hinzufügen.
- Inkubieren Sie parallel die Kontrollperlen in einer Lösung mit dem Vehikel allein, die ohne die interessierende experimentelle Chemikalie oder das interessierende Protein hergestellt wird.
- Inkubieren Sie die Perlen für 20 Minuten, während Sie bei Raumtemperatur langsam schütteln. Umwickeln Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Folie, um sie während der gesamten Inkubation vor Licht zu schützen, da viele dieser Moleküle lichtempfindlich sind
- Entfernen Sie so viel wie möglich von der Lösung mit einer Pipette und färben Sie mit 2% Phenolrot, gelöst in Wasser bei Raumtemperatur für 2 Minuten mit leichtem Rühren in einem Wirbel.
HINWEIS: Das Färben der transparenten AG 1-X2-Perlen erleichtert deren Implantation in den Embryo. - Entfernen Sie das 2% ige Phenolrot und waschen Sie die Perlen zweimal in 1x PBS, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
- Mit einer Mikropipettenspitze ~40-50 AG 1-X2 Perlen in die Mitte der in Schritt 1 zubereiteten parafilmbedeckten Petrischale geben und diese in 5 μL von 1x PBS einweichen. Wählen Sie unter dem Mikroskop etwa 30 Perlen mit einem Durchmesser von ~ 100 μm aus. Entsorgen Sie die unbenutzten Perlen.
- Perlen sind bereit für die Implantation. Stellen Sie sicher, dass die Perlen während der gesamten Implantation in das PBS eingetaucht sind, indem Sie ein paar Tropfen 1x PBS oder Wasser um die Perlen pipettieren, um die lokale Atmosphäre zu befeuchten und / oder die Schale mit Parafilm zu bedecken, um die Verdunstung zu verlangsamen.
3. Embryonenmanipulation und interdige Implantation
- Bevor Sie die Embryonen manipulieren, ordnen Sie zwei Stereomikroskope nebeneinander auf einer Tischplatte an. Einer ist für die Embryonenmanipulation und Perlenimplantation und der andere ist für die Aufrechterhaltung der behandelten Perlen, die bereit sind, sich in den Embryo einzunisten.
- Erstellen Sie mit einer ungezähnten Pinzette ein Fenster in den verbleibenden Eiern, wie im Abschnitt Eierinkubation und Staging des Embryos beschrieben.
- Öffnen Sie unter dem Mikroskop den Fruchtsack, indem Sie die Amnionmembran mit einer feinen chirurgischen Pinzette in der Nähe des rechten Hinterbeins nur um die Menge reißen, die für die Durchführung des Eingriffs erforderlich ist (dh so wenig wie möglich).
- Halten Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette an der Fruchtblase, um das rechte Hinterbein freizulegen. Machen Sie mit einer feinen Wolframnadel ein Loch, das in der distalen Mehrheit der dritten Ziffer des Hinterbeins zentriert ist.
- Ohne den Embryo und das freiliegende Hinterbein freizusetzen, nehmen Sie eine behandelte Perle aus dem anderen Mikroskop mit einer der Spitzen der Pinzette. Die Pinzette muss sich in der offenen Position befinden, damit eine Perle an der Zangenspitze haften kann.
- Übertragen Sie die Perle in den Kükenembryo in der Nähe des Hinterglieds und positionieren Sie sie oben auf dem Ziffernloch.
- Schließen Sie die Pinzette, um Druck auf die Perle auszuüben, bis sie in das Loch eintritt.
- Lassen Sie den Embryo los und verschließen Sie das Eierschalenfenster mit Klebeband.
- Geben Sie die Eier in den Inkubator zurück, bis sie das erforderliche Stadium erreicht haben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die erforderliche Anzahl manipulierter Embryonen erreicht ist. Es muss unbedingt sichergestellt werden, dass die Perlen zu keinem Zeitpunkt austrocknen.
HINWEIS: Um einen vollständigen ektopischen Finger zu beobachten, inkubieren Sie für ~ 72 h nach der Perlenimplantation. Im Gegensatz dazu werden frühe Differenzierungsgene (z.B. Sox9) ~30 min nach der Implantation einer TGF-ß1-getränkten Perle exprimiert.
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Representative Results
Verwendung von getränkten Perlen zur Beurteilung des Zellverhaltens im embryonalen Kükenglied
Um die Wirksamkeit dieses Assays zu gewährleisten, muss die Perle konsistent und präzise an der richtigen Stelle platziert werden; in diesem Fall der distale Most der dritten Ziffer unterhalb des apikalen ektodermalen Rückens AER (Abbildung 1A). Diese Positionierung ermöglicht es dem betreffenden Molekül, sich gleichmäßig im Interdigitalgewebe auszubreiten. Darüber hinaus enthält die Zone unter dem AER undifferenzierte Zellen, die leicht auf die Behandlung ansprechen. Um die Auswirkungen auf die Zelldifferenzierung zu bewerten, können die Embryonen mit Alcianblau und Alizarinrot gefärbt werden, um die Bildung von Skelettelementen nachzuweisen (Abbildung 1B). Der Sicked-Bead-Assay eignet sich auch gut zur Beurteilung des Zelltods mit neutralem Rot (Abbildung 1C) und der Genregulation durch In-situ-Hybridisierung (Abbildung 1D). Die Skalenleiste ist auf 250 μm eingestellt.
Abbildung 1: Perlenimplantation in das Interdigitalgewebe der Kükengliedmaße.( A) Die richtige Position für die durchnässte Perle unter dem AER in einem 28 HH Hinterbein. (B) Alcianblau und Alizarin rote Skelettfärbungen belegen die Bildung einer ektopischen Ziffer, die 4 Tage nach der Implantation einer TGF-ß1-getränkten Perle induziert wurde. (C) Neutrale rote Färbung markiert die Zelltodinduktion (Pfeilspitze) 24 h nach der Implantation einer RA-getränkten Perle in das Interdigitalgewebe im Stadium 28 HH. (D) Sox9 in situ Hybridisierung 4 h nach der Implantation einer TGF-ß1-getränkten Perle. Die Skalenleiste ist auf 250 μm eingestellt. Die in B und C gezeigten Bilder stammen aus Díaz-Hernández et al.23,24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Der Hauptvorteil des in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Werkzeugs besteht darin, dass es in der Lage ist, den Zeitpunkt und den Ort der Exposition gegenüber Perlen zu kontrollieren, die in einem bestimmten experimentellen Molekül getränkt sind. Die Kombination der richtigen Positionierung mit präzisem Entwicklungstiming bietet enorme Möglichkeiten, Zelldifferenzierungsprozesse zu untersuchen. Die Durchführung dieser Experimente in undifferenziertem Gewebe ermöglicht die Untersuchung der ersten entscheidenden Ereignisse in der zellulären Abstammung. Zum Beispiel führt das Platzieren einer TGFß-getränkten Perle in das Interdigitalgewebe der embryonalen Gliedmaßen 28 HH zur Bildung einer ektopischen Ziffer, in der eine molekulare Kaskade ausgelöst wird, die die genetische Expression des Mastergens Sox925 induziert. Bemerkenswerterweise organisiert sich das induzierte Knorpelgewebe auch in einer Ziffer mit Phalanxbildung.
Interessanterweise löst RA den Zelltod in derselben interdigitalen Region aus, indem sie die Genexpression von morphogenetischen Knochenproteinen reguliert, die das Zellschicksal undifferenzierter Zellen in Richtung Zelltod lenken10. Daher können Zelldifferenzierung, Zelltod, Morphogenese und Strukturierung gleichzeitig in derselben Region eines Embryos untersucht und auf jede Region und jeden genetischen Weg von Interesse zugeschnittenwerden 8,9.
Zu den Elementen, die für den Erfolg dieses Protokolls entscheidend sind, gehört es, die durchnässten Perlen niemals austrocknen zu lassen (d.h. sie müssen immer nass bleiben). Auch die Auswahl der geeigneten Perlen ist wichtig: Affi-Gel- und Heparin-Perlen sind für Proteine, während AG1-X2 für Chemikalien bestimmt ist, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Konzentration des Moleküls, das in der Lösung enthalten ist, die zum Einweichen der Kügelchen verwendet wird, die normalerweise 1000-mal konzentrierter ist als bei In-vitro-Studien. Eine Unannehmlichkeit dieser Methode besteht jedoch darin, dass die endgültige Konzentration der aus den durchnässten Perlen freigesetzten Moleküle sowie die Freisetzungsgeschwindigkeit unbekannt sind. Im Protokoll wird erwähnt, dass Perlen-100 μm Durchmesser bequemer für die Verwendung ist. Betrachten Sie dies, wenn Gliedmaßen manipuliert werden. Am wichtigsten ist, dass der Durchmesser der Perlen entsprechend der Implantationszone ausgewählt und in jedem Embryo konsequent beibehalten werden muss. Eine leichte Variation der Perlengröße zwischen den Experimenten wird die Ergebnisse jedoch wahrscheinlich nicht beeinflussen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Potenzial des hier skizzierten Soaked-Bead-Assays nur von der Vorstellungskraft des Forschers abhängt. Dieses Protokoll kann auf jedes experimentelle Tier-, Zellkultur- oder organotypische Kulturmodell, einschließlich Organoide, angewendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll ein hilfreiches, unkompliziertes pädagogisches Werkzeug, um den Schülern grundlegende entwicklungsbiologische Konzepte und technische Fähigkeiten beizubringen, indem diese experimentelle Manipulation im Entwicklungsbiologieunterricht geübt wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [Fördernummern IN211117 und IN213314] und Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [Fördernummer 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] unterstützt, die JC-M verliehen wurden. JC M-L erhielt ein Postdoc-Stipendium vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Die Autoren schätzen die Hilfe von Lic. Lucia Brito vom Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM in der Vorbereitung der Referenzen dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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