Summary
浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。
Abstract
胚発生中に多数の遺伝子プログラムが活性化され、細胞分化を調整して、驚くほど多様な体細胞、組織、臓器を生み出します。これらの遺伝子プログラムの正確な活性化は、異なる閾値で細胞の運命を導く拡散性分子である形態原体によって調節される。遺伝的活性化が形態形成をどのように調整するかを理解するには、発生中に形態素によって引き起こされる局所相互作用の研究が必要である。胚の異なる領域に移植されたタンパク質または薬物に浸したビーズを使用することで、数字の確立および他の発生過程における特定の分子の役割を研究することができる。この実験技術は、細胞誘導、細胞運命、およびパターン形成の制御に関する情報を提供する。したがって、この浸漬ビーズアッセイは、他の胚モデルに適用可能な非常に強力で貴重な実験ツールです。
Introduction
胚発生中の遺伝子発現を制御する分子メカニズムのブレークスルーにより、細胞の運命がどのように決定されるかを理解することができました。異なる細胞系譜へのコミットメントは、細胞が転写因子の分子発現を開始すると起こる1。この発現パターンは、空間および時間において高度に協調的であり、それによって、細胞、組織、および器官の整形、位置決め、およびパターニングを指示する1、2、3、4、5。胚性誘導は、細胞の潜在能力を制限する階層を確立することによって細胞が特定の系統にコミットされるプロセスであり、Spemannオーガナイザー6,7で起こるような基本的なボディプランの生成も含まれる。この胚盤胞背唇は、宿主胚8、9において第2胚軸を誘導する。今日、移植および分子アプローチと組み合わせた他の古典的な実験の助けを借りて、異なる転写因子および成長因子がSpemannオーガナイザー10において胚誘導を指示するように機能することが知られている。したがって、実験的操作は、胚発生中の細胞分化、形態形成、およびパターニングプロセスを理解するための重要なツールである。
興味深いことに、組織移植が困難な胚系、またはインデューサーがすでによく知られている場合、担体は、細胞分化、形態形成、さらにはパターニングを調節する分子(例えば、タンパク質、化学物質、毒素など)を送達するために使用される。そのような担体システムの1つは、任意の発生時点で任意の実験モデル生物に特定の分子に浸したビーズを移植して、前記試薬の効果を決定するか、または前記モデルの分化を指示することを含む。例えば、レチノイン酸(RA)を浸したビーズを鶏の翅肢の芽に移植することによって、Cheryl Tickle et al. (1985)は、RAが偏光活性ゾーン(ZPA)における音波ハリネズミの発現を誘導することを実証した11,12。同じ実験戦略を用いて、RAが、数字発生中の四肢芽および他の胚性四肢領域におけるソマイトおよび細胞死の非対称性を制御することを発見した13、14、15。他の因子、主にタンパク質(例えば、線維芽細胞増殖因子[FGF]、形質転換増殖因子ベータ[TGF−ß])は、初期胚の脇腹およびデジタル間領域における新しい桁の四肢を誘導するために用いられており、それぞれ16、17、18、19、20、21.これらの実験は、分子に曝露された組織または細胞群のコミットメントまたは能力の段階を決定するためのこの技術の力および有用性を証明している。
このプロトコルでは、数字形成の段階でのひよこ四肢が実験モデルとなり、浸したビーズを調製および移植する方法を段階的に提示した。しかしながら、この実験ツールは、この用途に限定されるものではなく、誘導、分化、細胞死、およびパターニングを研究するために、 インビトロ および インビボで 任意の実験動物モデルおよび任意の時点において利用することができる。
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Protocol
この研究は、メキシコ国立オートノーマ大学(UNAM、メキシコ、メキシコ)の実験動物の世話と使用のための治験審査委員会によってレビューされ、承認されました。
1. 卵子の孵化と胚の病期分類
注:受精鶏の卵は地元の農場から入手することができます。受精ホワイトレグホーン鶏の卵が最も一般的に使用されています。受精したばかりの鶏卵を15°Cで孵化前に最大1週間保管してください。
- 受精した鶏の卵を、38°C、相対湿度70%の加湿インキュベーターで、28HH段階に達するまで尖った面を下にして垂直に孵化させる(Hamilton and Hamburger、1951によると約5.5日)22。孵卵中に卵子を回転させて、胚が卵殻膜に付着するのを防ぎます。
注:発達段階の選択は、実験目的によって知らされる。この場合、28HHステージは、異所性桁を誘導するか、または細胞死を促進するための桁間ビーズ移植に最適です。 - インキュベーターから卵を取り出し、70%エタノールで拭き取り、風乾させます。作業領域、顕微鏡、器具を70%エタノールで消毒します。
- 卵をキャンドルで固定して血管を識別し、胚を見つけます。胚を持たない卵子を捨てる。
- 歯のない鉗子の端を使って、卵の鈍い端を叩いて約5個の卵で窓を開け、鉗子で殻の1cm2 の部分を取り除きます。
- 卵をカートンまたはプラスチックホルダーに移し、実体顕微鏡の下に置きます。空気膜を穿刺し、細かい外科用鉗子で引き抜いて取り除きます。胚に接触する可能性のある卵殻の小さな部分を取り除きます。
注:空気膜は、卵を窓を開けた直後に観察される白色の不透明な膜です。 - 羊膜嚢をわずかに開き、細かい外科用鉗子を使って引き裂きながら顕微鏡下で観察する。絨毛膜の血管系を傷つけないように注意してください。
注:羊膜は、羊水を内包する胚を密接に囲む透明な膜です。 - 胚を 卵子で段階 的にして、それらが所望の段階にあるかどうかを決定する。初期段階の胚は、卵殻窓をテープで密封した後、インキュベーターに戻すことができる。
2. ビーズの準備
注:問題の実験目的および治療に応じて、代替ビーズタイプ(例えば、アフィゲル、AG1−X2、ヘパリン)がより適している可能性がある。アフィゲルビーズはタンパク質(TGF-ß1など)に最適で、ヘパリンビーズは成長因子(FGF、WNT)や有機溶媒に可溶化された化学物質(DMSOなど)に最適なAG1-X2ビーズに最適です。
- アフィゲルおよびヘパリンビーズ調製
- 45mmのペトリ皿に合うようにパラフィルムの正方形をカットします。パラフィルムをシャーレの底に横切って覆い、歯のない鉗子の端部を使用して各頂点を押してペトリ皿の底に固定します。扠置く。
- ピペットまたはヘラを使用して、ビーズを微量遠心チューブに移し、沈降およびピによって1x PBSで2回洗浄する。
- ステップ1からパラフィルム化したシャーレの中心にマイクロピペットで〜40〜50個のビーズを移す。
- 顕微鏡を使用して、直径約100μmのアフィゲルまたはヘパリンビーズを30個選択して使用します。顕微鏡接眼レンズレチクルを使用してビーズのサイズを変更するか、HH 28胚の3桁目間を基準として使用する。ビードは桁間よりも小さくなければなりません。
- ビーズを囲む余分なPBSをできるだけ慎重に取り除き、2〜5μLの処理液に浸します。溶液がビーズを完全に覆っていることを確認してください。
- 並行して、実験処理溶液で使用したのと同じ量のビヒクルを含む溶液に浸漬することによって対照ビーズを調製する。
注:濃度は、実験に従って各処理について計算する必要がある。潜在的に有害な試薬を取り扱うときは、適切な個人用保護具を使用してください。 - ビーズを溶液中で室温で30分間インキュベートする。インキュベーション中にビーズが乾燥するのを防ぐために、ビーズの周りに数滴の1x PBSまたは水をピペットでピペットして局所雰囲気を加湿し、蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆います。
- ペトリ皿を氷の上に置き、同じ日以内にビーズを埋め込む。
- AG 1-X2 ビーズの準備
- 45mmのペトリ皿に合うようにパラフィルムの正方形をカットします。ペトリ皿の底をパラフィルムで覆い、歯のない鉗子の端を使って各頂点を押して貼り付けます。扠置く。
- ヘラを使用して、AG 1-X2ビーズを微量遠心チューブに移します。30〜50μLの処理溶液を所望の最終濃度で加える。
- 並行して、対照ビーズをビヒクル単独の溶液中でインキュベートし、目的の実験用化学物質またはタンパク質を伴わずに調製する。
- ビーズを室温でゆっくりと振盪しながら20分間インキュベートする。これらの分子の多くが光に敏感であることを考えると、すべてのインキュベーション中に光から保護するために、微量遠心チューブをホイルで包みます
- ピペットを使用してできるだけ多くの溶液を取り出し、2%フェノールレッドを水に溶解し、室温で2分間、渦中で穏やかな攪拌で染色する。
注:透明なAG 1-X2ビーズを染色すると、胚への移植が容易になります。 - 2%フェノールレッドを除去し、ビーズを1x PBSで2回洗浄して、余分な色素を除去した。
- マイクロピペットチップで、ステップ1で調製したパラフィルムで覆われたシャーレの中心に約40〜50AG 1-X2ビーズを移し、これらを5μLの1x PBSに浸します。顕微鏡下で、直径約100μmの大きさのビーズを約30個選択します。未使用のビーズを廃棄します。
- ビーズは移植する準備ができています。ビーズの周りに数滴の1x PBSまたは水をピして局所的な雰囲気を加湿し、および/または蒸発を遅らせるためにパラフィルムで皿を覆うことによって、ビーズが移植を通してPBSに沈んでいることを確認する。
3. 胚操作と桁間移植
- 胚を操作する前に、2つの実体顕微鏡をベンチトップに隣り合わせに配置します。1つは胚操作およびビーズ移植用であり、もう1つは処理済みビーズを胚に移植する準備を整えるためのものである。
- 歯のない鉗子を使用して、卵子の孵化と胚のステージングのセクションの説明に従って、残りの卵に窓を作成します。
- 顕微鏡下で、右後肢付近の微細な外科用鉗子で羊膜を引き裂くことによって羊膜を、処置を達成するために必要な量だけ(すなわち、できるだけ少なく)だけ引き裂くことによって羊膜を開く。
- 微細な鉗子を用いて、胚を羊膜で保持し、右後肢を露出させる。細かいタングステン針を使って、後肢の3桁目の桁間の大部分の遠位部を中心として穴を開けます。
- 胚および露出した後肢を放出することなく、鉗子の先端の1つを用いて他方の顕微鏡から一方の処理ビーズを採取する。1つのビーズが鉗子先端に付着するためには、鉗子が開いた位置になければなりません。
- ビーズを後肢の近くのひよこの胚に移し、桁間穴の上に置きます。
- 鉗子を閉じて、ビーズが穴に入るまでビードに圧力をかけます。
- 胚を解放し、卵殻窓をテープで密封する。
- 卵が必要な段階に達するまで卵をインキュベーターに戻します。操作された胚の必要数に達するまで、この手順を繰り返します。ビーズがどの時点でも乾燥しないようにすることが不可欠です。
注:完全な異所性指を観察するには、ビーズ移植後約72時間インキュベートします。対照的に、早期分化遺伝子(例えば 、Sox9)は、TGF−ß1浸漬ビーズの移植後〜30分後に発現される。
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Representative Results
浸したビーズを使用して、胚性のひよこの四肢の細胞挙動を評価する
このアッセイの有効性を保証するために、ビーズは一貫して正確に正しい位置に配置されなければならない。この場合、頂端外胚葉隆起の下にある第3桁間部の遠位最遠位がAER(図1A)となる。この位置決めにより、問題の分子はデジタル間組織全体に均等に広がることができます。さらに、AERの下のゾーンには、治療に容易に応答する未分化細胞が含まれています。細胞分化への影響を評価するために、胚をアルシアンブルーおよびアリザリンレッドで染色して、骨格要素の形成を証明できる(図1B)。浸漬ビーズアッセイは、ニュートラルレッドによる細胞死(図1C)および in situ ハイブリダイゼーションによる遺伝子調節(図1D)の評価にも適しています。スケールバーは250μmに設定されています。
図1:ひよこの四肢のデジタル間組織へのビーズ移植(A)28HHの後肢のAERの下に浸したビーズの正しい位置。(B)アルシアンブルーおよびアリザリンレッドの骨格染色は、TGF−ß1浸漬ビーズを移植してから4日後に誘発された異所性桁の形成を証拠とする。(c)細胞死誘導(矢じり)28HH段階でRA浸漬ビーズをデジタル間組織に移植してから24時間後のニュートラルレッド染色痕。(d)TGF−ß1浸漬ビーズを移植した4時間後にSox9in situハイブリダイゼーション。スケールバーは250μmに設定されています。BとCに示されている画像は、Díaz-Hernández et al.23,24から撮影されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコールで詳述されている実験ツールの主な利点は、所与の実験分子に浸されたビーズへの曝露の時間と位置を制御できることである。正しい位置決めと正確な発生タイミングを組み合わせることで、細胞分化過程を研究する大きな可能性を秘めています。これらの実験を未分化組織で行うことで、細胞系譜における最初の重要な事象を調査することができます。例えば、TGFß浸漬ビーズを胚性四肢28HHのデジタル間組織に配置すると、マスター遺伝子 Sox925の遺伝子発現を誘導する分子カスケードがトリガーされる異所性桁の形成をもたらす。驚くべきことに、誘導された軟骨組織はまた、指骨形成を伴う数字に組織化される。
興味深いことに、RAは、未分化細胞の細胞運命を細胞死に向けて導く骨形成タンパク質の遺伝子発現を調節することによって、同じデジタル間領域における細胞死を誘発する10。したがって、細胞分化、細胞死、形態形成、およびパターニングは、胚の同じ領域において同時に調査することができ、関心のある任意の領域および遺伝的経路に合わせることができる8,9。
このプロトコルの成功に不可欠な要素には、浸したビーズを決して乾燥させない(すなわち、常に濡れたままでなければならない)ことが含まれる。また、適切なビーズを選択することも不可欠です:アフィゲルとヘパリンビーズはタンパク質用ですが、AG1-X2は有機溶媒に溶解した化学物質用です。もう1つの臨界点は、ビーズを浸すために使用される溶液に含まれる分子の濃度であり、これは通常、 インビトロ 研究に使用されるよりも1000倍濃縮される。それにもかかわらず、この方法の不便さは、浸されたビーズから放出される分子の最終濃度、ならびに放出速度が不明であることである。プロトコルでは、直径100μmのビーズがより使いやすいことが言及されています。手足が操作されるとき、これを考慮してください。最も重要なのは、ビーズの直径は、着床ゾーンに従って選択され、各胚において一貫して維持されなければならない。ただし、実験間でビーズサイズがわずかに変動しても、結果に影響を与える可能性は低いです。
結論として、ここで概説した浸漬ビーズアッセイの可能性は、研究者の想像力にのみ依存する。このプロトコールは、オルガノイドを含む任意の実験動物、細胞培養、またはオルガノタイプ培養モデルに適用することができる。さらに、このプロトコルは、発生生物学のクラスでこの実験操作を実践することによって、学生に基本的な発生生物学の概念と技術スキルを教えるための有用で簡単な教育ツールです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、JC-Mに授与されたメキシコ国立自治大学(DGAPA)と、JC-Mに授与されたConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [助成金番号1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]によって支援されました。JC M-Lは、Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)からポスドクフェローシップを受けました。著者らはリックの助けに感謝している。Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAMのLucia Britoは、この原稿の準備参考文献に記載しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
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