Summary
침지된 비드 분석은 세포 분화 및 형태형성의 조절을 연구하기 위해 임의의 발달 시점에서 시험 시약의 표적화된 전달을 포함한다. 세 가지 다른 유형의 침지 된 구슬을 준비하고 닭 배아의 교차 숫자에 이식하기위한 모든 실험 동물 모델에 적용 가능한 상세한 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
배아 발달 중에 다수의 유전 프로그램이 활성화되어 세포 분화를 조율하여 체세포, 조직 및 장기의 놀라운 다양성을 생성합니다. 이러한 유전 프로그램의 정확한 활성화는 다른 역치에서 세포 운명을 지시하는 모르포겐, 확산성 분자에 의해 조절됩니다. 유전자 활성화가 형태 형성을 어떻게 조정하는지 이해하려면 개발 중에 모르포겐에 의해 유발 된 지역 상호 작용에 대한 연구가 필요합니다. 배아의 뚜렷한 영역에 이식 된 단백질 또는 약물에 담근 구슬을 사용하면 숫자 및 기타 발달 과정의 확립에서 특정 분자의 역할을 연구 할 수 있습니다. 이 실험 기술은 세포 유도, 세포 운명 및 패턴 형성의 제어에 대한 정보를 제공합니다. 따라서,이 흠뻑 젖은 비드 분석은 다른 배아 모델에 적용 할 수있는 매우 강력하고 가치있는 실험 도구입니다.
Introduction
배아 발달 동안 유전자 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 돌파구는 우리가 세포 운명이 어떻게 결정되는지 이해할 수있게 해주었습니다. 상이한 세포 계보에 대한 헌신은 일단 세포가 전사 인자1의 분자 발현을 시작하면, 발생한다. 이러한 발현 패턴은 공간과 시간에서 고도로 조정되고, 따라서 세포, 조직 및 기관 1,2,3,4,5의 형성, 포지셔닝 및 패터닝을 지시한다. 배아 유도는 세포의 잠재력을 제한하는 계층 구조를 확립함으로써 세포가 특정 혈통에 전념하는 과정이며, 이는 심지어 Spemann 주최자 6,7에서 발생하는 기본 신체 계획의 생성을 포함합니다. 배반포어 등쪽 입술은 숙주 배아 8,9에서 두 번째 배아 축을 유도한다. 오늘날, 그래프팅 및 분자 접근법과 결합된 다른 고전적 실험의 도움으로, 상이한 전사 인자 및 성장 인자가 Spemann 조직자10에서 배아 유도를 지시하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 실험 조작은 배아 발생 동안 세포 분화, 형태 형성 및 패터닝 과정을 이해하는 데 중요한 도구입니다.
흥미롭게도, 조직 이식이 어렵거나 유도제가 이미 잘 알려진 배아 시스템에서, 운반체는 세포 분화, 형태형성 및 심지어 패터닝을 조절하기 위해 분자 (예를 들어, 단백질, 화학물질, 독소 등)를 전달하는데 사용된다. 하나의 그러한 운반체 시스템은 상기 시약의 효과를 결정하거나 상기 모델의 분화를 지시하기 위해 임의의 발달 시점에서 임의의 실험 모델 유기체에 특정 분자에 담근 비드를 이식하는 것을 포함한다. 예를 들어, 닭 날개 사지 새싹에 레티노산 (RA)-담근 비드를 이식함으로써, Cheryl Tickle et al. (1985)는 RA가 편광 활성 (ZPA) 11,12의 영역에서 음파 고슴도치의 발현을 유도한다는 것을 입증했다. 동일한 실험 전략이 RA가 디지트 발달 동안 사지 새싹 및 다른 배아 사지 영역 13,14,15에서 소마이트 및 세포 사멸의 비대칭성을 조절한다는 것을 발견하기 위해 사용되었다. 다른 인자, 주로 단백질 (예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 [FGF], 형질전환 성장 인자-베타 [TGF-ß])은 초기 배아의 옆구리에서 사지를 유도하고 인터디지털 영역에서 새로운 자릿수를 유도하는데 사용되어 왔으며, 각각16,17,18,19,20,21 . 이들 실험은 분자에 노출된 조직 또는 세포 그룹의 헌신 또는 능력의 단계를 결정하기 위한 이 기술의 힘과 유용성을 입증한다.
이 프로토콜에서, 자리 형성의 단계에서 병아리 사지는 침지된 비드를 제조하고 이식하는 방법을 단계적으로 제시하는 실험 모델로서 작용하였다. 그러나, 이러한 실험 도구는 본 출원에 한정되지 않지만, 유도, 분화, 세포 사멸 및 패터닝을 연구하기 위해 임의의 실험 동물 모델 및 시험관 내 및 생체내 임의의 시점들에서 이용될 수 있다.
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Protocol
이 연구는 Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico)의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 기관 검토위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 계란 배양 및 배아 준비
참고 : 수정 된 암탉 알은 지역 농장에서 얻을 수 있습니다. 수정 된 화이트 레그혼 닭고기 알이 가장 일반적으로 사용됩니다. 갓 수정한 닭고기 알을 배양하기 전에 최대 1주 동안 15°C에서 보관하십시오.
- 수정한 닭 알을 28 HH 단계에 도달할 때까지 38°C 및 70% 상대 습도의 가습 인큐베이터에서 뾰족한 면을 아래로 아래로 수직으로 인큐베이션한다(해밀턴 및 햄버거에 따르면 약 5.5일, 1951)22. 배양 중에 난자를 회전시켜 배아가 껍질 막에 부착되는 것을 방지하십시오.
참고 : 발달 단계의 선택은 실험 목표에 의해 통보됩니다. 이 경우, 28 HH 단계는 자궁외 숫자를 유도하거나 세포 사멸을 촉진하기 위해 인터디지트 비드 이식에 최적이다. - 인큐베이터에서 알을 제거하고 70 % 에탄올로 면봉하고 공기 건조시킵니다. 작업 영역, 현미경 및 장비를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 계란을 촛불로 만들어 혈관을 확인하고 배아를 찾으십시오. 배아가없는 난자는 버리십시오.
- 치아가없는 집게의 끝을 사용하여 달걀의 무딘 끝을 두드려 약 다섯 개의 알에 창문을 열고 포셉으로 껍질의 1cm2 부분을 제거하십시오.
- 계란을 판지 또는 플라스틱 홀더에 옮겨 입체 현미경 아래에 놓습니다. 구멍을 뚫고 미세한 수술 포셉으로 공기 막을 당겨 제거하십시오. 배아에 닿을 수있는 작은 달걀 껍질 조각을 제거하십시오.
참고 : 공기 막은 달걀을 창으로 만든 직후에 관찰 된 흰색의 불투명 한 막입니다. - 양수 낭을 약간 열고 미세한 수술 포셉을 사용하여 찢어 놓으면서 현미경으로 관찰하십시오. chorioallantoic 막의 혈관 구조를 손상시키지 않도록주의하십시오.
참고 : 양수는 양수에 캡슐화하는 배아를 밀접하게 둘러싸고있는 투명한 막입니다. - 배아를 ovo 에 단계화하여 원하는 단계에 있는지 여부를 결정합니다. 초기 단계의 배아는 달걀 껍질 창을 테이프로 밀봉 한 후 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다.
2. 비드 준비
참고: 문제의 실험 목표 및 치료에 따라, 대체 비드 유형(예: Affi-Gel, AG1-X2, 헤파린)이 더 적합할 수 있습니다. Affi-Gel 비드는 단백질 (예 : TGF-ß1)에 최적이며, 헤파린 비드는 성장 인자 (예 : FGFs, WNT) 및 유기 용매 (예 : DMSO)에 가용화 된 화학 물질을위한 AG1-X2 비드에 이상적입니다.
- Affi-Gel 및 헤파린 비드 준비
- 45mm 페트리 접시에 맞게 파라 필름 사각형을 자릅니다. 페트리 접시의 바닥에 파라 필름을 놓고 덮고 치아가없는 포셉의 끝을 사용하여 각 꼭짓점을 밀어 페트리 접시의 바닥에 고정시킵니다. 곁.
- 피펫 또는 주걱을 사용하여 비드를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 침전 및 피펫팅하여 1x PBS로 두 번 세척합니다.
- 마이크로 피펫으로 ~ 40-50 개의 비드를 1 단계에서 파라 필름 된 페트리 접시의 중앙으로 옮깁니다.
- 현미경을 사용하여 직경 ~ 100 μm의 Affi-Gel 또는 헤파린 비드를 ~ 30 ~ 30 μm로 선택하십시오. 현미경 접안 렌즈 레티클을 사용하여 비드의 크기를 조정하거나 HH 28 배아의 세 번째 자릿수를 참조로 사용하십시오. 비드는 중간 숫자보다 작아야 합니다.
- 비드를 둘러싸고 있는 과량의 PBS를 가능한 한 많이 조심스럽게 제거하고 이를 처리 용액의 2-5 μL에 담그십시오. 용액이 구슬을 완전히 덮고 있는지 확인하십시오.
- 병행하여, 실험 처리 용액에 사용된 것과 동일한 양의 비히클을 함유하는 용액에 담가 대조군 비드를 준비한다.
참고 : 농도는 실험에 따라 각 치료에 대해 계산해야합니다. 잠재적으로 유해한 시약을 취급 할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오. - 비드를 실온에서 30분 동안 용액 중에 인큐베이션한다. 인큐베이션 중에 비드가 건조되는 것을 방지하기 위해, 비드 주위에 1x PBS 또는 물 몇 방울을 피펫팅하여 국소 대기를 가습하고 접시를 파라필름으로 덮어 증발을 늦춘다.
- 페트리 접시를 얼음 위에 놓고 같은 날 안에 구슬을 이식하십시오.
- AG 1-X2 비드 준비
- 45mm 페트리 접시에 맞게 파라 필름 사각형을 자릅니다. 페트리 접시의 바닥을 파라 필름으로 덮고 치아가없는 집게의 끝을 사용하여 각 꼭짓점을 밀어 붙입니다. 곁.
- 주걱을 사용하여 AG 1-X2 비드를 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 30-50 μL의 처리 용액을 원하는 최종 농도로 첨가한다.
- 병행하여, 대조군 비드를 비히클 단독과 함께 용액에서 인큐베이션하고, 실험적 화학적 또는 관심있는 단백질 없이 제조한다.
- 실온에서 천천히 진탕하면서 비드를 20분 동안 인큐베이션한다. 미세 원심분리 튜브를 호일로 감싸서 모든 인큐베이션 중에 빛으로부터 보호하십시오.이 분자 중 많은 부분이 빛에 민감하다는 점을 감안할 때
- 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 용액을 제거하고 소용돌이에서 가벼운 교반으로 2 분 동안 실온에서 물에 용해 된 2 % 페놀 레드로 염색하십시오.
참고: 투명한 AG 1-X2 비드를 염색하면 배아에 쉽게 이식할 수 있습니다. - 2% 페놀 레드를 제거하고 비드를 1x PBS로 2회 세척하여 과량의 염료를 제거하였다.
- 마이크로피펫 팁으로, 단계 1에서 제조된 파라필름 피복된 페트리 디쉬의 중앙에 ∼40-50 AG 1-X2 비드를 옮기고 이들을 1x PBS의 5 μL에 담그십시오. 현미경으로 직경이 ~ 100 μm 인 약 30 개의 비드를 선택하십시오. 사용하지 않은 구슬은 버리십시오.
- 구슬은 이식 할 준비가되었습니다. 비드 주위에 1x PBS 또는 물 몇 방울을 피펫팅하여 이식 전반에 걸쳐 비드가 PBS에 잠겨 있는지 확인하여 국소 분위기를 가습시키고 / 또는 파라 필름으로 접시를 덮어 증발을 늦추십시오.
3. 배아 조작 및 인터디지트 이식
- 배아를 조작하기 전에 벤치 탑에서 서로 옆에 두 개의 입체 현미경을 배치하십시오. 하나는 배아 조작 및 비드 이식을 위한 것이고, 다른 하나는 처리된 비드를 배아 내로 이식할 준비가 된 상태로 유지하기 위한 것이다.
- 치아가 없는 포셉을 사용하여 난자 배양 및 배아 스테이징 섹션에 설명된 대로 나머지 난자에 창을 만듭니다.
- 현미경으로 오른쪽 뒷다리 근처의 미세한 수술 포셉으로 양막을 찢어서 양수 낭을 열어 절차를 수행하는 데 필요한 양 (즉, 가능한 한 적음)으로 만 엽니 다.
- 미세한 포셉을 사용하여 양막으로 배아를 잡고 오른쪽 뒷다리를 노출시킵니다. 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 뒷다리의 세 번째 자릿수의 원위 대부분을 중심으로 구멍을 뚫습니다.
- 배아와 노출 된 뒷다리를 방출하지 않고 포셉의 팁 중 하나를 사용하여 다른 현미경에서 하나의 처리 된 비드를 가져 가십시오. 포셉은 하나의 비드가 포셉 팁에 부착 될 수 있도록 열린 위치에 있어야합니다.
- 구슬을 뒷다리 근처의 병아리 배아로 옮기고 중간 구멍 위에 놓습니다.
- 포셉을 닫아 비드가 구멍에 들어갈 때까지 압력을 가합니다.
- 배아를 풀고 달걀 껍질 창을 테이프로 밀봉하십시오.
- 계란이 필요한 단계에 도달 할 때까지 인큐베이터로 돌려 보내십시오. 필요한 수의 조작 된 배아에 도달 할 때까지 절차를 반복하십시오. 구슬이 어느 시점에서도 마르지 않도록하는 것이 필수적입니다.
참고 : 완전한 자궁외 손가락을 관찰하려면 비드 이식 후 ~ 72 시간 동안 배양하십시오. 대조적으로, 초기 분화 유전자 (예를 들어, Sox9)는 TGF-ß1-침지 비드의 이식 후 ∼30분 후에 발현된다.
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Representative Results
젖은 구슬을 사용하여 배아 병아리 사지의 세포 거동 평가
이 분석의 효능을 보장하기 위해, 비드는 일관되고 정확하게 정확한 위치에 배치되어야 한다; 이 경우, 원위-정점 외배엽 능선 AER 아래의 세 번째 자릿수의 대부분이다(그림 1A). 이 포지셔닝은 문제의 분자가 인터디지털 조직 전체에 동등하게 확산 될 수있게합니다. 또한, AER 아래의 구역에는 치료에 쉽게 반응하는 미분화 세포가 포함되어 있습니다. 세포 분화에 대한 효과를 평가하기 위해, 배아는 골격 요소의 형성을 증거하기 위해 알시안 블루 및 알리자린 레드로 염색될 수 있다(도 1B). 침지된 비드 분석은 또한 중성 적색(도 1C)을 사용한 세포 사멸 및 계내 혼성화에 의한 유전자 조절(도 1D)을 평가하는 데 매우 적합하다. 스케일 바는 250 μm로 설정된다.
그림 1: 병아리 사지의 인터디지털 조직에 비드 이식.( A) 28 HH 뒷다리에서 AER 아래에 담근 구슬의 올바른 위치. (b) 알시안 블루 및 알리자린 레드 골격 염색은 TGF-ß1-soaked 비드를 이식한 후 4일 후에 유도된 자궁외 디지트의 형성을 증거한다. (c) 중성 적색 염색은 28 HH 단계에서 인터디지털 조직 내로 RA 침지 비드를 주입한 후 24 h 후 세포사멸 유도(화살촉)를 표시한다. (d) Sox9를 계내 혼성화 4시간 후에 TGF-ß1-침지된 비드에 이식하였다. 스케일 바는 250 μm로 설정된다. B 및 C에 표시된 이미지는 Díaz-Hernández et al.23,24에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 자세히 설명된 실험 도구의 주요 장점은 주어진 실험 분자에 담근 비드에 대한 노출의 시간 및 위치를 제어할 수 있다는 것입니다. 정확한 포지셔닝과 정확한 발달 타이밍을 결합하면 세포 분화 과정을 연구 할 수있는 엄청난 가능성을 제공합니다. 미분화 조직에서 이러한 실험을 수행하면 세포 계보에서 첫 번째 중요한 사건을 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, TGFß-담근 비드를 배아 사지 28 HH의 인터디지털 조직에 배치하면 마스터 Gen Sox925의 유전적 발현을 유도하는 분자 캐스케이드가 촉발되는 자궁외 디지트의 형성이 초래된다. 놀랍게도, 유도 된 연골 조직은 또한 지골 형성과 함께 숫자로 조직됩니다.
흥미롭게도, RA는 미분화된 세포의 세포 운명을 세포 사멸(10)로 향하게 하는 골형성 단백질의 유전자 발현을 조절함으로써 동일한 인터디지털 영역에서 세포 사멸을 촉발시킨다. 따라서, 세포 분화, 세포 사멸, 형태형성 및 패터닝은 배아의 동일한 영역에서 동시에 조사될 수 있고, 관심있는 임의의 영역 및 유전 경로(8,9)에 맞추어질 수 있다.
이 프로토콜의 성공에 중요한 요소는 흠뻑 젖은 구슬을 건조시키지 않도록하는 것입니다 (즉, 항상 젖은 상태로 유지되어야합니다). 또한 적절한 비드를 선택하는 것이 필수적입니다 : Affi-Gel과 헤파린 비드는 단백질을위한 반면, AG1-X2는 유기 용매에 용해 된 화학 물질을위한 것입니다. 또 다른 중요한 점은 비드를 담그기 위해 사용되는 용액에 포함 된 분자의 농도이며, 이는 일반적으로 시험관 내 연구에 사용되는 것보다 1000 배 더 농축됩니다. 그럼에도 불구하고,이 방법의 불편 함은 침지 된 비드에서 방출 된 분자의 최종 농도는 방출 속도뿐만 아니라 알려지지 않았다는 것입니다. 프로토콜에서 비드-100 μm 직경이 사용하기에 더 편리하다는 것이 언급되어 있다. 팔다리가 조작 될 때 이것을 고려하십시오. 가장 중요한 것은, 비드의 직경은 이식 영역에 따라 선택되어야 하고 각 배아에서 일관되게 유지되어야 한다. 그러나, 실험 사이에 비드 크기의 약간의 변화는 결과에 영향을 미치지 않을 것이다.
결론적으로, 여기에 설명 된 담근 비드 분석의 잠재력은 연구자의 상상력에만 달려 있습니다. 이 프로토콜은 오가노이드를 포함한 임의의 실험 동물, 세포 배양 또는 유기형 배양 모델에 적용될 수 있다. 또한,이 프로토콜은 발달 생물학 수업에서이 실험 조작을 연습하여 학생들에게 기본적인 발달 생물학 개념과 기술 기술을 가르치기위한 유용하고 직접적인 교육 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [보조금 번호 IN211117 및 IN213314] 및 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [보조금 번호 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia]가 JC-M에 수여했습니다. JC M-L은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887)로부터 박사후 펠로우십을 받았다. 저자는 Lic의 도움을 주셔서 감사합니다. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM의 Lucia Brito는이 원고의 준비 참조.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affi-Gel Blue Gel beads | Bio-Rad | 153-7302 | |
| AG1-X2 beads | Bio-Rad | 1400123 | |
| Egg incubator | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fine surgical forceps | Fine Science Tools | 9115-10 | |
| Heparine Sepharose beads | Abcam | ab193268 | |
| Petri dish | Nest | 705001 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Tape | NA | NA | |
| Tungsten needle | GoodFellow | E74-15096/01 |
References
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