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Developmental Biology

सेल भेदभाव का विश्लेषण, Morphogenesis, और चिकन Embryogenesis के दौरान पैटर्निंग भिगोया मनका परख का उपयोग कर

Published: January 12, 2022 doi: 10.3791/63187
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Medicina Genómica y Toxicología Ambiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

Summary

भिगोया मनका परख किसी भी विकास के समय बिंदु पर परीक्षण अभिकर्मक के लक्षित वितरण शामिल करने के लिए सेल भेदभाव और morphogenesis के विनियमन का अध्ययन करने के लिए. एक विस्तृत प्रोटोकॉल, किसी भी प्रयोगात्मक पशु मॉडल पर लागू होता है, तीन अलग-अलग प्रकार के भिगोए हुए मोतियों को तैयार करने और चिकन भ्रूण के इंटरडिजिट में इन्हें प्रत्यारोपित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है।

Abstract

भ्रूण के विकास के दौरान आनुवंशिक कार्यक्रमों की एक भीड़ सक्रिय होती है जो दैहिक कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की एक आश्चर्यजनक विविधता उत्पन्न करने के लिए कोशिका भेदभाव को व्यवस्थित करती है। इन आनुवांशिक कार्यक्रमों की सटीक सक्रियता को मॉर्फोजेन, अलग-अलग अणुओं द्वारा विनियमित किया जाता है जो विभिन्न थ्रेसहोल्ड पर सेल भाग्य को निर्देशित करते हैं। यह समझना कि आनुवंशिक सक्रियण मॉर्फोजेनेसिस को कैसे समन्वयित करता है, विकास के दौरान मॉर्फोजेन द्वारा ट्रिगर किए गए स्थानीय इंटरैक्शन के अध्ययन की आवश्यकता होती है। भ्रूण के अलग-अलग क्षेत्रों में प्रत्यारोपित प्रोटीन या दवाओं में भिगोए गए मोतियों का उपयोग अंकों और अन्य विकास प्रक्रियाओं की स्थापना में विशिष्ट अणुओं की भूमिका का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। यह प्रयोगात्मक तकनीक सेल प्रेरण, सेल भाग्य और पैटर्न गठन के नियंत्रण के बारे में जानकारी प्रदान करती है। इस प्रकार, इस भिगोया मनका परख एक अत्यंत शक्तिशाली और मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण अन्य भ्रूण मॉडल के लिए लागू है.

Introduction

भ्रूण के विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र में सफलताओं ने हमें यह समझने की अनुमति दी है कि सेल भाग्य कैसे निर्धारित किया जाता है। विभिन्न सेल वंशों के लिए प्रतिबद्धता तब होती है जब कोशिकाएं प्रतिलेखन कारकों की आणविक अभिव्यक्ति शुरू करतीहैं 1। यह अभिव्यक्ति पैटर्न अंतरिक्ष और समय में अत्यधिक समन्वित है और इस तरह कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों 1,2,3,4,5 के आकार, स्थिति और पैटर्निंग को निर्देशित करता है। भ्रूण प्रेरण वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाओं को पदानुक्रम स्थापित करके विशिष्ट वंशों के लिए प्रतिबद्ध किया जाता है जो कोशिकाओं की क्षमता को प्रतिबंधित करते हैं, जिसमें मूल शरीर योजना की पीढ़ी भी शामिल होती है जैसा कि स्पेमैन आयोजक 6,7 के साथ होता है। ब्लास्टोपोर पृष्ठीय होंठ एक मेजबान भ्रूण 8,9 में एक दूसरे भ्रूण अक्ष को प्रेरित करता है। आज, आणविक दृष्टिकोण के साथ संयुक्त ग्राफ्टिंग और अन्य शास्त्रीय प्रयोगों की सहायता से, यह ज्ञात है कि विभिन्न प्रतिलेखन कारक और विकास कारक स्पेमैन आयोजक10 में भ्रूण प्रेरण को निर्देशित करने के लिए कार्य करते हैं। इस प्रकार, प्रयोगात्मक हेरफेर भ्रूणजनन के दौरान सेल भेदभाव, मॉर्फोजेनेसिस और पैटर्निंग प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

दिलचस्प बात यह है कि भ्रूण प्रणालियों में जहां ऊतक प्रत्यारोपण मुश्किल होता है या जब प्रेरक पहले से ही अच्छी तरह से ज्ञात होते हैं, तो वाहक का उपयोग अणुओं (जैसे, प्रोटीन, रसायन, विषाक्त पदार्थों, आदि) को वितरित करने के लिए किया जाता है ताकि सेल भेदभाव, मॉर्फोजेनेसिस और यहां तक कि पैटर्निंग को विनियमित किया जा सके। ऐसी एक वाहक प्रणाली में किसी भी प्रयोगात्मक मॉडल जीव में किसी भी विशिष्ट अणु में भिगोए गए मोतियों को किसी भी विकास के समय बिंदु पर प्रत्यारोपित करना शामिल है ताकि उक्त अभिकर्मक के प्रभाव को निर्धारित किया जा सके या उक्त मॉडल के भेदभाव को निर्देशित किया जा सके। उदाहरण के लिए, चिकन विंग अंग कली में रेटिनोइक एसिड (आरए) -भिगोए हुए मोतियों को प्रत्यारोपित करके, चेरिल टिकल एट अल (1985) ने प्रदर्शित किया कि आरए ध्रुवीकरण गतिविधि (जेडपीए) 11,12 के क्षेत्र में सोनिक हेजहोग की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। एक ही प्रयोगात्मक रणनीति का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया गया था कि आरए अंक विकास के दौरान अंग कली में सोमाइट्स और सेल मृत्यु की विषमता को नियंत्रित करता है और अन्य भ्रूण अंग क्षेत्रों में 13,14,15। अन्य कारक, मुख्य रूप से प्रोटीन (उदाहरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक [एफजीएफ], विकास कारक-बीटा [टीजीएफ-π]) को बदलने के लिए उपयोग किया गया है प्रारंभिक भ्रूण के फ्लैंक और इंटरडिजिटल क्षेत्र में नए अंकों में अंगों को प्रेरित करने के लिए क्रमशः 16,17,18,19,20,21 . ये प्रयोग अणुओं के संपर्क में आने वाले ऊतकों या कोशिकाओं के समूहों की प्रतिबद्धता या क्षमता के चरण को निर्धारित करने के लिए इस तकनीक की शक्ति और उपयोगिता का सबूत देते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, अंक गठन के चरण में चिक अंग ने प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में कार्य किया ताकि चरण-दर-चरण प्रस्तुत किया जा सके कि भिगोए हुए मोतियों को कैसे तैयार और प्रत्यारोपित किया जाए। हालांकि, यह प्रयोगात्मक उपकरण इस आवेदन तक सीमित नहीं है, लेकिन किसी भी प्रयोगात्मक पशु मॉडल और विट्रो में किसी भी टाइमपॉइंट में और विवो में प्रेरण, भेदभाव, सेल मृत्यु और पैटर्निंग का अध्ययन करने के लिए शोषण किया जा सकता है।

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Protocol

इस शोध की समीक्षा की गई थी और Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, मेक्सिको सिटी, मेक्सिको) के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अंडा इनक्यूबेशन और भ्रूण स्टेजिंग

नोट: निषेचित मुर्गी के अंडे स्थानीय खेतों से प्राप्त किए जा सकते हैं। निषेचित सफेद लेगहॉर्न चिकन अंडे सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं। ताजा निषेचित चिकन अंडे को इनक्यूबेशन से पहले 1 सप्ताह तक 15 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

  1. निषेचित चिकन अंडे को 38 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में नुकीले पक्ष के साथ लंबवत रूप से इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 28 एचएच चरण (हैमिल्टन और हैमबर्गर, 1 9 51 के अनुसार लगभग 5.5 दिन) तक नहीं पहुंच जाते। इनक्यूबेशन के दौरान अंडे घुमाएं ताकि भ्रूण को शेल झिल्ली का पालन करने से रोका जा सके।
    नोट: विकास के चरण की पसंद प्रयोगात्मक उद्देश्यों द्वारा सूचित किया जाता है। इस मामले में, 28 एचएच चरण एक अस्थानिक अंक को प्रेरित करने या सेल मृत्यु को बढ़ावा देने के लिए इंटरडिजिट मनका आरोपण के लिए इष्टतम है।
  2. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, उन्हें 70% इथेनॉल के साथ स्वैब करें, और उन्हें सूखने की अनुमति दें। 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र, माइक्रोस्कोप और उपकरणों को कीटाणुरहित करें।
  3. रक्त वाहिकाओं की पहचान करने और भ्रूण का पता लगाने के लिए अंडे को मोमबत्ती करें। उन अंडों को छोड़ दें जिनमें भ्रूण नहीं है।
  4. गैर-दांतेदार संदंश के अंत का उपयोग करते हुए, एक अंडे के कुंद छोर को टैप करके लगभग पांच अंडों में एक खिड़की खोलें, और संदंश के साथ खोल के 1-सेमी2 अनुभाग को हटा दें।
  5. अंडे को एक दफ़्ती या प्लास्टिक धारक में स्थानांतरित करें और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें। हवा की झिल्ली puncturing और ठीक सर्जिकल संदंश के साथ इसे बाहर खींचकर निकालें। अंडे के छिलके के किसी भी छोटे टुकड़े को हटा दें जो भ्रूण से संपर्क कर सकता है।
    नोट: हवा की झिल्ली सफेद, अपारदर्शी झिल्ली है जिसे अंडे को खिड़की के तुरंत बाद देखा जाता है।
  6. एमनियोटिक थैली को थोड़ा खोलते समय माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें, इसे ठीक सर्जिकल संदंश का उपयोग करके फाड़ दें। सावधान रहें कि कोरियोएल्लांटोइक झिल्ली के वास्कुलचर को नुकसान न पहुंचे।
    नोट: एमनियन भ्रूण के चारों ओर पारदर्शी झिल्ली है जो इसे एमनियोटिक द्रव में समाहित करता है।
  7. यह निर्धारित करने के लिए कि वे वांछित चरण में हैं या नहीं, ओवो में भ्रूण को चरण दें। पहले के चरणों में भ्रूण को टेप के साथ अंडे की खिड़की को सील करने के बाद इनक्यूबेटर में वापस किया जा सकता है।

2. मनका तैयारी

नोट: प्रश्न में प्रयोगात्मक उद्देश्य और उपचार के आधार पर, वैकल्पिक मनका प्रकार (जैसे, एफ्फी-जेल, एजी 1-एक्स 2, हेपरिन) अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। Affi-Gel मोती प्रोटीन के लिए इष्टतम हैं (उदाहरण के लिए, TGF-π1), जबकि हेपरिन मोती विकास कारकों (जैसे, FGFs, WNT) और AG1-X2 मोतियों के लिए आदर्श हैं जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, DMSO) में घुलनशील रसायनों के लिए हैं।

  1. एफ्फी-जेल और हेपरिन मनका तैयारी
    1. 45-मिमी पेट्री डिश फिट करने के लिए पैराफिल्म का एक वर्ग काटें। इसे कवर करने के लिए पेट्री डिश के नीचे पैराफिल्म रखें और गैर-दांतेदार संदंश के अंत का उपयोग करके प्रत्येक शीर्ष को धक्का देकर इसे पेट्री डिश के नीचे तक ठीक करें। अलग रख दें।
    2. एक पिपेट या स्पैटुला का उपयोग करके, मोतियों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें बसने और पिपेटिंग द्वारा 1x पीबीएस में दो बार धोएं।
    3. चरण 1 से पैराफिल्म्ड पेट्री डिश के केंद्र में एक माइक्रोपिपेट के साथ ~ 40-50 मोतियों को स्थानांतरित करें।
    4. माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, उपयोग के लिए व्यास में ~ 30 Affi-Gel या हेपरिन मोतियों ~ 100 μm का चयन करें। मोतियों को आकार देने के लिए एक माइक्रोस्कोप आईपीस रेटिकल का उपयोग करें या संदर्भ के रूप में एचएच 28 भ्रूण के तीसरे इंटरडिजिट का उपयोग करें; मनका interdigit से छोटा होना चाहिए.
    5. ध्यान से जितना संभव हो सके मोतियों के आसपास के अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें और उन्हें उपचार समाधान के 2-5 μL में भिगोएं। आश्वस्त करें कि समाधान पूरी तरह से मोतियों को कवर करता है।
    6. समानांतर में, एक समाधान में भिगोकर नियंत्रण मोतियों को तैयार करें जिसमें प्रयोगात्मक उपचार समाधान में उपयोग किए जाने वाले वाहन की समान मात्रा होती है।
      नोट: प्रयोग के अनुसार प्रत्येक उपचार के लिए सांद्रता की गणना करने की आवश्यकता है। संभावित रूप से हानिकारक अभिकर्मकों को संभालते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें।
    7. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान में मोतियों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान मोतियों को सूखने से रोकने के लिए, स्थानीय वातावरण को नम करने के लिए मोतियों के चारों ओर 1x पीबीएस या पानी की कुछ बूंदों को पिपेट करें और वाष्पीकरण को धीमा करने के लिए पैराफिल्म के साथ पकवान को कवर करें।
    8. पेट्री डिश को बर्फ पर रखें और उसी दिन के भीतर मोतियों को प्रत्यारोपित करें।
  2. एजी 1-X2 मनका तैयारी
    1. 45-मिमी पेट्री डिश फिट करने के लिए पैराफिल्म का एक वर्ग काटें। पैराफिल्म के साथ पेट्री डिश के निचले हिस्से को कवर करें और गैर-दांतेदार संदंश के अंत का उपयोग करके प्रत्येक शीर्ष को धक्का देकर चिपकाएं। अलग रख दें।
    2. एजी 1-X2 मोतियों को एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें। वांछित अंतिम एकाग्रता पर उपचार समाधान के 30-50 μL जोड़ें।
    3. समानांतर में, अकेले वाहन के साथ एक समाधान में नियंत्रण मोतियों को इनक्यूबेट करें, जो प्रयोगात्मक रसायन या ब्याज के प्रोटीन के बिना तैयार किया जाता है।
    4. कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे हिलाते हुए 20 मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें। सभी इनक्यूबेशन के दौरान प्रकाश से बचाने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पन्नी के साथ लपेटें, यह देखते हुए कि इनमें से कई अणु प्रकाश-संवेदनशील हैं
    5. एक पिपेट का उपयोग करके जितना संभव हो उतना समाधान निकालें और एक भंवर में हल्के आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पानी में घुले हुए 2% फिनोल लाल के साथ दाग।
      नोट: पारदर्शी एजी 1-X2 मोतियों को रंगने से भ्रूण में उनके आरोपण की सुविधा मिलती है।
    6. 2% फिनोल लाल निकालें और किसी भी अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए 1x पीबीएस में दो बार मोतियों को धोएं।
    7. एक micropipette टिप के साथ, स्थानांतरण ~ 40-50 एजी 1-X2 मोती पैराफिल्म के केंद्र में-कवर पेट्री पकवान चरण 1 में तैयार और 1x PBS के 5 μL में इन्हें भिगोने. माइक्रोस्कोप के तहत, लगभग 30 मोतियों का चयन करें जो आकार में ~ 100 μm व्यास हैं। अप्रयुक्त मोतियों को छोड़ दें।
    8. मोती प्रत्यारोपित करने के लिए तैयार हैं। सुनिश्चित करें कि मोती स्थानीय वातावरण को नम करने के लिए मोतियों के चारों ओर 1x पीबीएस या पानी की कुछ बूंदों को पिपेट करके आरोपण के दौरान पीबीएस में डूबे हुए हैं और / या वाष्पीकरण को धीमा करने के लिए पैराफिल्म के साथ पकवान को कवर करते हैं।

3. भ्रूण हेरफेर और interdigit आरोपण

  1. भ्रूण में हेरफेर करने से पहले, बेंचटॉप पर एक दूसरे के बगल में दो स्टीरियोमाइक्रोस्कोप की व्यवस्था करें। एक भ्रूण हेरफेर और मनका आरोपण के लिए है, और दूसरा भ्रूण में प्रत्यारोपित करने के लिए तैयार उपचारित मोतियों को बनाए रखने के लिए है।
  2. गैर-दांतेदार संदंश का उपयोग करके, शेष अंडे में एक खिड़की बनाएं जैसा कि अंडे के इनक्यूबेशन और भ्रूण स्टेजिंग अनुभाग में वर्णित है।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत, एमनियोटिक झिल्ली को दाईं ओर ठीक सर्जिकल संदंश के साथ फाड़कर एमनियोटिक थैली को खोलें, केवल प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक मात्रा से (यानी, जितना संभव हो उतना कम)।
  4. ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, सही हिंडलिंब को उजागर करने के लिए एमनियोटिक झिल्ली द्वारा भ्रूण को पकड़ो। एक ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग करके, हिंडलिंब के तीसरे इंटरडिजिट के डिस्टल-अधिकांश में केंद्रित एक छेद बनाएं।
  5. भ्रूण और उजागर हिंडलिंब को जारी किए बिना, संदंश की युक्तियों में से एक का उपयोग करके दूसरे माइक्रोस्कोप से एक उपचारित मनका लें। संदंश को संदंश टिप का पालन करने के लिए एक मनका के लिए खुली स्थिति में होना चाहिए।
  6. मनका को हिंडलिंब के पास चूजे के भ्रूण में स्थानांतरित करें और इसे इंटरडिजिट छेद के शीर्ष पर रखें।
  7. मनका पर दबाव लागू करने के लिए संदंश को तब तक बंद करें जब तक कि यह छेद में प्रवेश न कर जाए।
  8. भ्रूण को छोड़ दें और टेप के साथ एगशेल विंडो को सील करें।
  9. अंडे को इनक्यूबेटर में वापस कर दें जब तक कि वे आवश्यक चरण तक नहीं पहुंच जाते। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि हेरफेर किए गए भ्रूण की आवश्यक संख्या तक नहीं पहुंच जाता है। यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि मोती किसी भी बिंदु पर सूख न जाएं।
    नोट: एक पूर्ण अस्थानिक उंगली का निरीक्षण करने के लिए, मनका आरोपण के बाद ~ 72 ज के लिए इनक्यूबेट करें। इसके विपरीत, प्रारंभिक विभेदन जीन (उदाहरण के लिए, Sox9) को TGF-1-भिगोए हुए मनका के आरोपण के बाद ~ 30 मिनट तक व्यक्त किया जाता है।

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Representative Results

भ्रूण चूजे अंग में सेल व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए भिगोए हुए मोतियों का उपयोग करना
इस परख की प्रभावकारिता को आश्वस्त करने के लिए, मनका लगातार और ठीक सही स्थान में रखा जाना चाहिए; इस मामले में, एपिकल एक्टोडर्मल रिज एईआर (चित्रा 1 ए) के नीचे तीसरे इंटरडिजिट के डिस्टल-अधिकांश। यह स्थिति प्रश्न में अणु को इंटरडिजिटल ऊतक में समान रूप से फैलने की अनुमति देती है। इसके अलावा, एईआर के नीचे के क्षेत्र में अविभाजित कोशिकाएं होती हैं जो उपचार के लिए आसानी से उत्तरदायी होती हैं। सेल भेदभाव पर प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए, भ्रूण को कंकाल तत्वों के गठन का सबूत देने के लिए अल्सियान नीले और अलीज़ारिन लाल रंग के साथ दाग दिया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। भिगोया मनका परख भी अच्छी तरह से तटस्थ लाल (चित्रा 1 सी) और सीटू संकरण (चित्रा 1 डी) में जीन विनियमन के साथ सेल मौत का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल है। स्केल बार 250 μm पर सेट किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: चिक अंग के इंटरडिजिटल ऊतक में मनका आरोपण। ए) एक 28 एचएच हिंडलिंब में एईआर के नीचे भिगोए हुए मनका के लिए सही स्थान। (बी) Alcian नीले और Alizarin लाल कंकाल धुंधला सबूत एक अस्थानिक अंक के गठन के गठन के 4 दिन बाद प्रेरित एक TGF-1-भिगोया मनका प्रत्यारोपित करने के बाद. (सी) तटस्थ लाल धुंधला 28 एचएच चरण में इंटरडिजिटल ऊतक में आरए-भिगोए हुए मनका को प्रत्यारोपित करने के बाद सेल डेथ इंडक्शन (एरोहेड) 24 घंटे के बाद चिह्नित करता है। (डी) एक टीजीएफ-1-भिगोए हुए मनका को प्रत्यारोपित करने के बाद सीटू संकरण में Sox9 4 घंटे। स्केल बार 250 μm पर सेट किया गया है। बी और सी में दिखाई गई छवियों को डायज़-हर्नांडेज़ एट अल.23,24 से लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रयोगात्मक उपकरण का मुख्य लाभ किसी दिए गए प्रयोगात्मक अणु में भिगोए गए मोतियों के संपर्क में समय और स्थान को नियंत्रित करने में सक्षम होना है। सटीक विकास के समय के साथ सही स्थिति का संयोजन सेल भेदभाव प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भारी संभावनाएं प्रदान करता है। अविभाजित ऊतक में इन प्रयोगों का प्रदर्शन सेलुलर वंश में पहली महत्वपूर्ण घटनाओं की जांच करने में सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, भ्रूण अंगों के इंटरडिजिटल ऊतक में एक टीजीएफई-भिगोए हुए मनका को रखने के परिणामस्वरूप एक अस्थानिक अंक का निर्माण होता है जिसमें एक आणविक कैस्केड ट्रिगर होता है जो मास्टर जनरल सॉक्स 925 की आनुवंशिक अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। उल्लेखनीय रूप से, प्रेरित उपास्थि ऊतक भी फालांक्स गठन के साथ एक अंक में व्यवस्थित होता है।

दिलचस्प बात यह है कि आरए हड्डी के मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन की जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करके एक ही इंटरडिजिटल क्षेत्र में सेल मृत्यु को ट्रिगर करता है जो सेल मृत्यु10 की ओर अविभाजित कोशिकाओं के सेल भाग्य को निर्देशित करता है। इसलिए, सेल भेदभाव, सेल मृत्यु, मॉर्फोजेनेसिस, और पैटर्निंग को एक भ्रूण के एक ही क्षेत्र में समवर्ती रूप से जांच की जा सकती है और किसी भी क्षेत्र और ब्याज के आनुवंशिक मार्ग 8,9 के अनुरूप बनाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण तत्वों में भिगोए गए मोतियों को कभी भी सूखने न देना शामिल है (यानी, उन्हें हमेशा गीला रहना चाहिए)। इसके अलावा, उपयुक्त मोतियों का चयन करना आवश्यक है: एफी-जेल और हेपरिन मोती प्रोटीन के लिए हैं, जबकि एजी 1-एक्स 2 कार्बनिक सॉल्वैंट्स में भंग रसायनों के लिए हैं। एक और महत्वपूर्ण बिंदु मोतियों को भिगोने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान में निहित अणु की एकाग्रता है, जो आमतौर पर इन विट्रो अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाने की तुलना में 1000 गुना अधिक केंद्रित होता है। फिर भी, इस विधि की एक असुविधा यह है कि भिगोए हुए मोतियों से जारी अणुओं की अंतिम एकाग्रता अज्ञात है, साथ ही साथ रिहाई का वेग भी। प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है कि मोतियों -100 μm व्यास उपयोग के लिए अधिक सुविधाजनक है। इस पर विचार करें जब अंगों में हेरफेर किया जाता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, मोतियों के व्यास को आरोपण क्षेत्र के अनुसार चुना जाना चाहिए और प्रत्येक भ्रूण में लगातार बनाए रखा जाना चाहिए। हालांकि, प्रयोगों के बीच मनका के आकार में थोड़ी भिन्नता परिणामों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है।

अंत में, भिगोया मनका परख की क्षमता यहाँ उल्लिखित केवल शोधकर्ता की कल्पना पर निर्भर करता है. इस प्रोटोकॉल को ऑर्गेनोइड्स सहित किसी भी प्रयोगात्मक पशु, सेल संस्कृति, या ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृति मॉडल पर लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल छात्रों को बुनियादी विकासात्मक जीव विज्ञान अवधारणाओं और तकनीकी कौशल को पढ़ाने के लिए एक सहायक, सीधा शैक्षिक उपकरण है जो विकासात्मक जीव विज्ञान कक्षाओं में इस प्रयोगात्मक हेरफेर का अभ्यास करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम Dirección जनरल डी Asuntos del व्यक्तिगत Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [अनुदान संख्या IN211117 और IN213314] और Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [अनुदान संख्या 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] द्वारा समर्थित किया गया था, जो जेसी-एम को सम्मानित किया गया था। जेसी एम-एल Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप प्राप्त की। लेखक एलआईसी की मदद की सराहना करते हैं। इस पांडुलिपि की तैयारी के संदर्भ में Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM से लूसिया ब्रिटो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Affi-Gel Blue Gel beads Bio-Rad 153-7302
AG1-X2 beads Bio-Rad 1400123
Egg incubator Incumatic de Mexico Incumatic 1000
Fine surgical forceps Fine Science Tools 9115-10
Heparine Sepharose beads Abcam ab193268
Petri dish Nest 705001
Stereomicroscope Zeiss Stemi DV4
Tape NA NA
Tungsten needle GoodFellow E74-15096/01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 179 चिकन भ्रूण अंग विकास सेल भेदभाव morphogenesis पैटर्न गठन रासायनिक /
सेल भेदभाव का विश्लेषण, Morphogenesis, और चिकन Embryogenesis के दौरान पैटर्निंग भिगोया मनका परख का उपयोग कर
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Marín-Llera, J. C.,… More

Marín-Llera, J. C., Chimal-Monroy, J. Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay. J. Vis. Exp. (179), e63187, doi:10.3791/63187 (2022).

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