ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

Summary

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

Abstract

מספר רב של תוכניות גנטיות מופעל במהלך ההתפתחות העוברית אשר מתזמר את התמיינות התאים כדי ליצור מגוון מדהים של תאים, רקמות ואיברים סומטיים. ההפעלה המדויקת של תוכניות גנטיות אלה מווסתת על ידי מורפוג'נים, מולקולות מפוזרות המכוונות את גורל התא לסף שונה. הבנת האופן שבו הפעלה גנטית מתאמת מורפוגנזה דורשת מחקר של אינטראקציות מקומיות המופעלות על ידי מורפוגנס במהלך ההתפתחות. השימוש בחרוזים ספוגים בחלבונים או בתרופות המושתלים באזורים מובחנים של העובר מאפשר לחקור את תפקידן של מולקולות ספציפיות בביסוס ספרות ותהליכי התפתחות אחרים. טכניקה ניסיונית זו מספקת מידע על השליטה באינדוקציה של התא, בגורל התא ובהיווצרות תבניות. לפיכך, בדיקת חרוזים ספוגה זו היא כלי ניסיוני רב עוצמה ובעל ערך החל על מודלים עובריים אחרים.

Introduction

פריצות דרך במנגנונים המולקולריים השולטים בביטוי גנים במהלך ההתפתחות העוברית אפשרו לנו להבין כיצד נקבע גורל התא. מחויבות לשושלות תאים שונות מתרחשת ברגע שהתאים מתחילים בביטוי המולקולרי של גורמי שעתוק¹. תבנית ביטוי זו מתואמת מאוד במרחב ובזמן ובכך מכוונת את העיצוב, המיקום והדפוס של תאים, רקמות ואיברים ^1,2,3,4,5. אינדוקציה עוברית היא התהליך שבו תאים מחויבים לשושלות ספציפיות על ידי יצירת היררכיות המגבילות את הפוטנציאל של התאים, הכוללות אף את יצירת תוכנית הגוף הבסיסית כפי שקורה עם מארגן Spemann ^6,7. השפה הגבית של בלסטופור גורמת לציר עוברי שני בעובר מארח ^8,9. כיום, בעזרת השתלה וניסויים קלאסיים אחרים בשילוב עם גישות מולקולריות, ידוע כי גורמי שעתוק וגורמי גדילה שונים מתפקדים כדי לכוון אינדוקציה עוברית במארגן Spemann¹⁰. לפיכך, מניפולציה ניסיונית היא כלי חשוב להבנת התמיינות תאים, מורפוגנזה ותהליכי דפוס במהלך יצירת עוברים.

באופן מעניין, במערכות עובריות שבהן השתלת רקמות קשה או כאשר הגורמים כבר ידועים היטב, נשאים משמשים להעברת מולקולות (למשל, חלבונים, כימיקלים, רעלנים וכו') כדי לווסת התמיינות תאים, מורפוגנזה ואפילו דפוסים. מערכת נשאים אחת כזו כוללת השתלת חרוזים ספוגים במולקולה מסוימת בכל אורגניזם מודל ניסיוני בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לקבוע את השפעתו של המגיב האמור או לכוון את ההבחנה של המודל האמור. לדוגמה, על ידי השתלת חרוזים ספוגי חומצה רטינואית (RA) בניצן כנף הגפיים של העוף, Cheryl Tickle et al. (1985) הראו כי RA משרה ביטוי של קיפוד קולי באזור פעילות הקיטוב (ZPA)^11,12. אותה אסטרטגיה ניסיונית שימשה כדי לגלות כי RA שולט באסימטריה של סומיטים ומוות תאי בניצן הגפיים במהלך התפתחות ספרות ובאזורי גפיים עובריים אחרים 13,14,15. גורמים אחרים, בעיקר חלבונים (למשל, גורמי גדילה פיברובלסטים [FGF], המשנים את גורם הגדילה-בטא [TGF-ß]) שימשו להשראת גפיים באגפי העוברים המוקדמים ולספרות חדשות באזור הבין-דיגיטלי, בהתאמה 16,17,18,18,19,20,21 . ניסויים אלה מעידים על העוצמה והתועלת של טכניקה זו לקביעת שלב המחויבות או היכולת של רקמות או קבוצות של תאים שנחשפו למולקולות.

בפרוטוקול זה, איבר האפרוח בשלב היווצרות הספרות שימש כמודל הניסויי להצגת שלב אחר שלב כיצד להכין ולהשתיל את החרוזים הספוגים. עם זאת, כלי ניסיוני זה אינו מוגבל ליישום זה, אלא ניתן לנצלו בכל מודל של בעלי חיים ניסיוניים ובכל נקודת זמן במבחנה וב - in vivo כדי לחקור אינדוקציה, התמיינות, מוות תאי ודפוס.

Protocol

מחקר זה נסקר ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון לביומדיקה של המכון לביומדיקה של Investigaciones, אוניברסיטת נסיונל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM, מקסיקו סיטי, מקסיקו).

1. דגירה של ביצית והדבקת עוברים

הערה: ניתן להשיג ביצי תרנגולות מופרות מחוות מקומיות. ביצי תרנגולת לבנה מופרות של הלגהורן נמצאות בשימוש הנפוץ ביותר. אחסנו את ביצי העוף המופרות הטריות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני הדגירה.

1. הדגירה של ביצי העוף המופריות בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 70% עד שהן מגיעות לשלב של 28 HH (כ-5.5 ימים על פי המילטון והמבורגר, 1951)²². סובבו את הביציות במהלך הדגירה כדי למנוע מהעובר להידבק לקרום הקליפה.
   הערה: בחירת השלב ההתפתחותי מבוססת על מטרות הניסוי. במקרה זה, שלב 28 HH הוא אופטימלי עבור השתלת חרוזים interdigit כדי לגרום לספרה חוץ רחמית או לקדם מוות תאי.
2. מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מבשלים אותן ב-70% אתנול ומאפשרים להן להתייבש באוויר. יש לחטא את אזור העבודה, המיקרוסקופים והמכשירים באמצעות 70% אתנול.
3. נרות את הביצית כדי לזהות את כלי הדם ולאתר את העובר. השליכו ביציות שאין להן עובר.
4. בעזרת קצה המלקחיים שאינם משוננים, פתחו חלון לכ-5 ביצים על ידי הקשה על הקצה הקהה של הביצה, והסירו חלק בקוטר 1 ס"מ^של הקליפה עם המלקחיים.
5. מעבירים את הביצה לתוך קרטון או מחזיק פלסטיק ומניחים אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. הסר את קרום האוויר על ידי ניקוב ומשיכתו החוצה עם מלקחיים כירורגיים עדינים. הסר כל חתיכה קטנה של קליפת ביצה שיכולה ליצור קשר עם העובר.
   הערה: קרום האוויר הוא הממברנה הלבנה והאטומה שנצפתה מיד לאחר חלון הביצה.
6. התבוננו מתחת למיקרוסקופ תוך כדי פתיחת שק מי השפיר מעט, וקרעו אותו באמצעות המלקחיים הכירורגיים העדינים. היזהר לא לפגוע בכלי הדם של קרום chorioallantoic.
   הערה: השפיר הוא הממברנה השקופה המקיפה את העובר באופן הדוק, אשר עוטפת אותו בנוזל מי שפיר.
7. שלב את העוברים באובו כדי לקבוע אם הם נמצאים בשלב הרצוי. ניתן להחזיר עוברים בשלבים מוקדמים יותר לחממה לאחר איטום חלון קליפת הביצה בנייר דבק.

2. הכנת חרוזים

הערה: בהתאם למטרת הניסוי ולטיפול המדובר, סוגי חרוזים חלופיים (למשל, אפי-ג'ל, AG1-X2, הפרין) עשויים להיות מתאימים יותר. חרוזי אפי-ג'ל הם אופטימליים לחלבונים (למשל, TGF-ß1), בעוד שחרוזי הפרין אידיאליים לגורמי גדילה (למשל, FGFs, WNT) וחרוזי AG1-X2 עבור כימיקלים המבודדים בממסים אורגניים (למשל, DMSO).

1. הכנת אפי-ג'ל וחרוז הפרין
   1. חותכים ריבוע של פרפילם כך שיתאים לצלחת פטרי 45 מ"מ. מניחים את הפרפילם על פני החלק התחתון של צלחת הפטרי כדי לכסות אותה ומקבעים אותה לתחתית צלחת הפטרי על ידי דחיפת כל קודקוד באמצעות קצה המלקחיים שאינם משוננים. מניחים בצד.
   2. באמצעות פיפטה או מרית, מעבירים את החרוזים לצינור מיקרו-צנטריפוגה ושוטפים אותם פעמיים ב-1x PBS על ידי התיישבות וצנרת.
   3. מעבירים כ-40-50 חרוזים עם מיקרופיפט למרכז צלחת פטרי הפרפילמית משלב 1.
   4. באמצעות המיקרוסקופ, בחר ~30 חרוזי אפי-ג'ל או הפרין בקוטר של כ-100 מיקרומטר לשימוש. השתמש ברשתית של עינית מיקרוסקופ כדי להגדיל את החרוזים או השתמש באינטרדיגיט השלישי של עובר HH 28 כהפניה; החרוז חייב להיות קטן יותר מהאינטרדיגיט.
   5. יש להסיר בזהירות כמה שיותר מה-PBS העודפים המקיפים את החרוזים ולספוג אותם ב-2-5 μL של תמיסת הטיפול. הבטיחו שהפתרון מכסה לחלוטין חרוזים.
   6. במקביל, הכינו חרוזי בקרה על ידי השריית תמיסה המכילה את אותה כמות כלי רכב המשמשת בתמיסת הטיפול הניסיונית.
      הערה: יש לחשב את הריכוזים עבור כל טיפול בהתאם לניסוי. השתמש בציוד המגן האישי המתאים בעת טיפול בריאגנטים שעלולים להזיק.
   7. דגירה של החרוזים בתמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע מהחרוזים להתייבש במהלך הדגירה, פיפטו כמה טיפות של 1x PBS או מים סביב החרוזים כדי להלח את האטמוספירה המקומית ולכסות את המנה בפרפילם כדי להאט את האידוי.
   8. מניחים את צלחת הפטרי על הקרח ומשתילים את החרוזים באותו יום.
2. הכנת חרוזי AG 1-X2
   1. חותכים ריבוע של פרפילם כך שיתאים לצלחת פטרי 45 מ"מ. כסו את החלק התחתון של צלחת פטרי בפרפילם ובהצמדה על ידי דחיפת כל קודקוד באמצעות קצה המלקחיים שאינם משוננים. מניחים בצד.
   2. השתמש במרית כדי להעביר את חרוזי AG 1-X2 לתוך צינור microcentrifuge. הוסף 30-50 μL של תמיסת הטיפול בריכוז הסופי הרצוי.
   3. במקביל, דגירה של חרוזי הבקרה בתמיסה עם הרכב בלבד, שהוכנה ללא הכימיקל הניסיוני או החלבון המעניין.
   4. דגירו את החרוזים למשך 20 דקות תוך שהם רועדים לאיטם בטמפרטורת החדר. עוטפים את צינורות המיקרוצנטריפוגה בנייר כסף כדי להגן מפני אור במהלך כל הדגירה, בהתחשב בכך שרבות מהמולקולות הללו רגישות לאור
   5. הסר כמה שיותר מהתמיסה באמצעות פיפטה וכתם עם 2% פנול אדום מומס במים בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות עם תסיסה קלה במערבולת.
      הערה: צביעת חרוזי AG 1-X2 השקופים מקלה על השתלתם בעובר.
   6. הסירו את 2% אדום הפנול ושטפו את החרוזים פעמיים ב-1x PBS כדי להסיר כל צבע עודף.
   7. עם קצה מיקרופיפט, העבירו כ-40-50 חרוזי AG 1-X2 למרכז צלחת הפטרי המכוסה פרפילם שהוכנה בשלב 1 והשרו אותם ב-5 μL של 1x PBS. תחת המיקרוסקופ, בחר כ-30 חרוזים שגודלם כ-100 מיקרומטר. השליכו את החרוזים שאינם בשימוש.
   8. חרוזים מוכנים להשתלה. ודא שהחרוזים שקועים ב- PBS לאורך כל ההשתלה על ידי צנרת כמה טיפות של PBS 1x או מים סביב החרוזים כדי לחות את האטמוספירה המקומית ו / או לכסות את המנה בפרפילם כדי להאט את האידוי.

3. מניפולציה בעוברים והשתלת אינטרדיגיט

1. לפני ביצוע מניפולציה על העוברים, סדרו שני סטריאומיקרוסקופים זה ליד זה על ספסל. האחת היא למניפולציה של העובר והשתלת חרוזים, והשנייה היא לשמירה על החרוזים המטופלים מוכנים להשתלה בעובר.
2. באמצעות מלקחיים שאינם בעלי שיניים, יוצרים חלון בביציות הנותרות כמתואר בדגירה של הביציות ובקטע לכידת העוברים.
3. מתחת למיקרוסקופ, פתח את שק מי השפיר על ידי קריעת קרום מי השפיר עם מלקחיים כירורגיים עדינים ליד האחורי הימני רק בכמות הדרושה לביצוע ההליך (כלומר, כמה שפחות).
4. באמצעות מלקחיים עדינים, החזק את העובר על ידי קרום מי השפיר כדי לחשוף את החלק האחורי הימני. באמצעות מחט טונגסטן עדינה, צרו חור שמרכזו בדיסטלי - רוב האינטרדיגיט השלישי של החלק האחורי.
5. מבלי לשחרר את העובר ואת המלקחיים החשופים, קחו חרוז אחד מטופל מהמיקרוסקופ השני באמצעות אחד מקצות המלקחיים. המלקחיים חייבים להיות במצב פתוח כדי שחרוז אחד ייצמד לקצה המלקחיים.
6. מעבירים את החרוז לעובר האפרוח ליד האפרוח ליד האפרוח האחורי ומניחים אותו על גבי החור הבין-ממדי.
7. סגור את המלקחיים כדי להפעיל לחץ על החרוז עד שהוא נכנס לחור.
8. שחררו את העובר ואטמו את חלון קליפת הביצה בנייר דבק.
9. מחזירים את הביצים לחממה עד שהן מגיעות לשלב הנדרש. חזור על ההליך עד שיגיע למספר הנדרש של עוברים שעברו מניפולציה. חובה לוודא שהחרוזים לא יתייבשו בשום שלב.
   הערה: כדי לצפות באצבע חוץ רחמית שלמה, דגירה במשך כ-72 שעות לאחר השתלת חרוזים. לעומת זאת, גנים של התמיינות מוקדמת (למשל, Sox9) מבוטאים כ-30 דקות לאחר השתלת חרוז ספוג TGF-ß1.

Representative Results

שימוש בחרוזים ספוגים להערכת התנהגות התא באיבר האפרוח העוברי
כדי להבטיח את יעילותו של מבחן זה, יש למקם את החרוז באופן עקבי ומדויק במיקום הנכון; במקרה זה, הדיסטלי-רוב של האינטרדיגיט השלישי מתחת לרכס האקטודרמלי האפי AER (איור 1A). מיקום זה מאפשר למולקולה המדוברת להתפשט באופן שווה בכל הרקמה הבין-דיגיטלית. יתר על כן, האזור שמתחת ל-AER מכיל תאים לא מובחנים שמגיבים בקלות לטיפול. כדי להעריך את ההשפעות על התמיינות תאים, ניתן להכתים את העוברים בכחול אלקיאני ובאדום אליזרין כדי להעיד על היווצרותם של יסודות שלד (איור 1B). בדיקת החרוזים הספוגים מתאימה גם להערכת מוות של תאים באדום נייטרלי (איור 1C) וויסות גנים על ידי הכלאה באתרה (איור 1D). סרגל קנה המידה מוגדר על 250 מיקרומטר.

איור 1: השתלת חרוזים לתוך הרקמה הבין-דיגיטלית של איבר האפרוח.( A) המיקום הנכון עבור החרוז הספוג מתחת ל- AER ב- 28 HH אחורי. (B) צביעת שלד כחולה אלקיאנית ואדומה אליזארין מעידה על היווצרות של ספרה חוץ רחמית המושרה 4 ימים לאחר השתלת חרוז ספוג TGF-ß1. (C) צביעה אדומה ניטרלית מסמנת אינדוקציה של מוות תאי (ראש חץ) 24 שעות לאחר השתלת חרוז ספוג RA לתוך הרקמה הבין-דיגיטלית בשלב 28 HH. (D) Sox9 בהכלאה באתרה 4 שעות לאחר שהושתל חרוז ספוג TGF-ß1. סרגל קנה המידה מוגדר על 250 מיקרומטר. התמונות המוצגות ב-B וב-C נלקחו מ-Díaz-Hernández et ^al.23,24. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

היתרון העיקרי של הכלי הניסויי המפורט בפרוטוקול זה הוא היכולת לשלוט בזמן ובמיקום של החשיפה לחרוזים הספוגים במולקולה ניסיונית נתונה. שילוב המיקום הנכון עם תזמון התפתחותי מדויק מספק אפשרויות עצומות לחקור תהליכי התמיינות תאים. ביצוע ניסויים אלה ברקמות לא מובחנות מאפשר לחקור את האירועים המכריעים הראשונים בשושלת התאית. לדוגמה, הצבת חרוז ספוג TGFß ברקמה הבין-דיגיטלית של גפיים עובריות 28 HH גורמת להיווצרות ספרה חוץ רחמית שבה מופעל מפל מולקולרי המעורר את הביטוי הגנטי של דור המאסטר Sox9²⁵. למרבה הפלא, רקמת הסחוס המושרה גם מתארגנת לספרה עם היווצרות פלנקס.

באופן מעניין, RA גורם למוות של תאים באותו אזור בין-ממדי על ידי ויסות ביטוי הגנים של חלבונים מורפוגנטיים בעצמות המכוונים את גורל התא של תאים לא מובחנים לעבר מוות תאי¹⁰. לפיכך, התמיינות תאים, מוות תאי, מורפוגנזה ודפוסים יכולים להיחקר בו-זמנית באותו אזור של העובר ולהתאים אותם לכל אזור ומסלול גנטי בעל עניין ^8,9.

האלמנטים החיוניים להצלחת פרוטוקול זה כוללים לעולם לא לתת לחרוזים הספוגים להתייבש (כלומר, הם חייבים תמיד להישאר רטובים). כמו כן, בחירת החרוזים המתאימים היא חיונית: חרוזי אפי-ג'ל והפרין מיועדים לחלבונים, ואילו AG1-X2 מיועדים לכימיקלים המומסים בממסים אורגניים. נקודה קריטית נוספת היא ריכוז המולקולה הכלולה בתמיסה המשמשת להשריית החרוזים, שהיא בדרך כלל מרוכזת פי 1000 יותר ממה שמשמש למחקרים במבחנה . עם זאת, אי נוחות של שיטה זו היא כי הריכוז הסופי של מולקולות המשתחררות מן החרוזים ספוגים אינו ידוע, כמו גם את מהירות השחרור. בפרוטוקול מוזכר כי חרוזים-100 μm קוטר הוא נוח יותר לשימוש. שקול את זה כאשר איברים הם מניפולציה. והכי חשוב, יש לבחור את קוטר החרוזים על פי אזור ההשתלה ולשמור באופן עקבי בכל עובר. עם זאת, שינוי קל בגודל החרוזים בין הניסויים לא צפוי להשפיע על התוצאות.

לסיכום, הפוטנציאל של בדיקת החרוזים הספוגים המתוארת כאן תלוי רק בדמיונו של החוקר. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, תרביות תאים או תרביות אורגנוטיפיות, כולל אורגנואידים. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא כלי חינוכי מועיל וישיר להוראת התלמידים מושגים בסיסיים בביולוגיה התפתחותית ומיומנויות טכניות על ידי תרגול מניפולציה ניסיונית זו בשיעורי ביולוגיה התפתחותית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01