Analyse av celledifferensiering, morfogenese og mønster under kyllingembryogenese ved hjelp av den gjennomvåte perleanalysen

Summary

Den gjennomvåte perleanalysen innebærer målrettet levering av testreagens på ethvert utviklingsmessig tidspunkt for å studere reguleringen av celledifferensiering og morfogenese. En detaljert protokoll, som gjelder for enhver eksperimentell dyremodell, for å forberede tre forskjellige typer gjennomvåt perler og implantere disse i mellombarn av et kyllingembryo, presenteres.

Abstract

En rekke genetiske programmer aktiveres under embryonal utvikling som orkestrerer celledifferensiering for å generere et forbløffende mangfold av somatiske celler, vev og organer. Den nøyaktige aktiveringen av disse genetiske programmene er regulert av morfogene, diffusible molekyler som styrer celle skjebne på forskjellige terskler. Å forstå hvordan genetisk aktivering koordinerer morfogenese krever studiet av lokale interaksjoner utløst av morfogenes under utvikling. Bruken av perler gjennomvåt i proteiner eller legemidler implantert i forskjellige områder av embryoet gjør det mulig å studere rollen som spesifikke molekyler i etableringen av sifre og andre utviklingsprosesser. Denne eksperimentelle teknikken gir informasjon om kontroll av celleinduksjon, celle skjebne og mønsterdannelse. Dermed er denne gjennomvåte perleanalysen et ekstremt kraftig og verdifullt eksperimentelt verktøy som gjelder for andre embryonale modeller.

Introduction

Gjennombrudd i molekylære mekanismer som kontrollerer genuttrykk under embryonal utvikling har gjort det mulig for oss å forstå hvordan celle skjebne bestemmes. Forpliktelse til forskjellige celleavledninger oppstår når cellene begynner molekylært uttrykk for transkripsjonsfaktorer¹. Dette uttrykksmønsteret er svært koordinert i rom og tid og styrer dermed forming, posisjonering og mønster av celler, vev og organer 1,2,3,4,5. Embryonal induksjon er prosessen der celler er forpliktet til spesifikke avstamninger ved å etablere hierarkier som begrenser cellenes potensial, som til og med inkluderer genereringen av den grunnleggende kroppsplanen som følger med^{Spemann-arrangøren 6,7}. Blastopore dorsal leppe induserer en annen embryonal akse i en vert embryo ^8,9. I dag, ved hjelp av podning og andre klassiske eksperimenter kombinert med molekylære tilnærminger, er det kjent at forskjellige transkripsjonsfaktorer og vekstfaktorer fungerer for å lede embryonal induksjon i^{Spemann-arrangøren 10}. Dermed er eksperimentell manipulasjon et viktig verktøy for å forstå celledifferensiering, morfogenese og mønsterprosesser under embryogenese.

Interessant, i embryonale systemer der vevstransplantasjon er vanskelig eller når induserne allerede er godt kjent, brukes bærere til å levere molekyler (f.eks. proteiner, kjemikalier, giftstoffer, etc.) for å regulere celledifferensiering, morfogenese og til og med mønster. Et slikt bærersystem innebærer implantering av perler gjennomvåt i et bestemt molekyl i enhver eksperimentell modellorganisme på et hvilket som helst utviklingstidspunkt for å bestemme effekten av nevnte reagens eller lede differensiering av nevnte modell. For eksempel, ved å implantere retinoinsyre (RA)-gjennomvåte perler i kyllingfløyens lemknopp, viste Cheryl Tickle et al. (1985) at RA induserer uttrykket av sonisk pinnsvin i sonen av polariserende aktivitet (ZPA) ^11,12. Den samme eksperimentelle strategien ble brukt til å oppdage at RA kontrollerer asymmetrien av somitter og celledød i lemknoppen under sifferutvikling og i andre embryonale lemregioner 13,14,15. Andre faktorer, hovedsakelig proteiner (f.eks. fibroblast vekstfaktorer [FGF], transformering av vekstfaktor-beta [TGF-ß]) har blitt brukt til å indusere lemmer i tidlige embryoers flanker og nye sifre i den interdigitale regionen, henholdsvis 16,17,18,19,20,21 . Disse eksperimentene viser kraften og nytten av denne teknikken for å bestemme scenen for engasjement eller kompetanse av vev eller grupper av celler utsatt for molekylene.

I denne protokollen fungerte kyllinglemmen på scenen av sifferdannelse som eksperimentell modell for å presentere trinnvis hvordan man forbereder og implanterer de gjennomvåte perlene. Dette eksperimentelle verktøyet er imidlertid ikke begrenset til denne applikasjonen, men kan utnyttes i enhver eksperimentell dyremodell og ethvert tidspunkt in vitro og in vivo for å studere induksjon, differensiering, celledød og mønster.

Protocol

Denne forskningen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review Board for care and use of Laboratory Animals of the Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexico City, Mexico).

1. Egginkubasjon og embryooppsamling

MERK: Befruktede høneegg kan fås fra lokale gårder. Befruktede hvite leghorn kyllingegg er mest brukt. Oppbevar de nybefruktede kyllingeggene ved 15 °C i opptil 1 uke før inkubasjon.

1. Inkuber de befruktede kyllingeggene vertikalt med den spisse siden ned i en fuktet inkubator ved 38 °C og 70 % relativ luftfuktighet til de når 28 HH-trinnet (ca. 5,5 dager i henhold til Hamilton og Hamburger, 1951)²². Roter eggene under inkubasjonen for å forhindre at embryoet holder seg til skallmembranen.
   MERK: Valget av utviklingsstadiet er informert av de eksperimentelle målene. I dette tilfellet er 28 HH-scenen optimal for interdigit perleimplantasjon for å indusere et ektopisk siffer eller fremme celledød.
2. Fjern eggene fra inkubatoren, vattpinne dem med 70% etanol, og la dem lufttørke. Desinfiser arbeidsområdet, mikroskopene og instrumentene med 70% etanol.
3. Stearinlys egget for å identifisere blodkar og finne embryoet. Kast egg som ikke har et embryo.
4. Bruk enden av ikke-tannede tang, åpne et vindu i rundt fem egg ved å trykke på den stumpe enden av et egg, og fjern en 1 cm² del av skallet med tangene.
5. Overfør egget til en kartong eller plastholder og legg det under stereomikroskopet. Fjern luftmembranen ved å punktere og trekke den ut med fine kirurgiske tang. Fjern et lite stykke eggeskall som kan kontakte embryoet.
   MERK: Luftmembranen er den hvite, ugjennomsiktige membranen som observeres umiddelbart etter at egget er ventilert.
6. Vær litt oppmerksom under mikroskopet mens du åpner fostersekken, og riv den med de fine kirurgiske tangene. Vær forsiktig så du ikke skader vaskulaturen i den chorioallantoiske membranen.
   MERK: Amnion er den gjennomsiktige membranen som omgir embryoet som innkapsler det i fostervann.
7. Stadium embryoene i ovo for å avgjøre om de er i ønsket stadium. Embryoer i tidligere stadier kan returneres til inkubatoren etter å ha forseglet eggeskallvinduet med tape.

2. Bead forberedelse

MERK: Avhengig av det aktuelle eksperimentelle målet og behandlingen, kan alternative perletyper (f.eks. Affi-Gel perler er optimale for proteiner (f.eks. TGF-ß1), mens heparinperler er ideelle for vekstfaktorer (f.eks. FGFer, WNT) og AG1-X2 perler for kjemikalier som er solubilisert i organiske løsningsmidler (f.eks. DMSO).

1. Affi-Gel og heparin perle forberedelse
   1. Klipp en firkant med parafilm for å passe til en 45 mm Petri-tallerken. Plasser parafilmen over bunnen av petriskålen for å dekke den og fest den til bunnen av Petri-parabolen ved å skyve hvert toppunkt ved hjelp av enden av ikke-tannede tang. Sette.
   2. Bruk en pipette eller spatel, overfør perlene til et mikrosenterrør og vask dem to ganger i 1x PBS ved å bosette seg og pipettere.
   3. Overfør ~40-50 perler med en mikropipette til midten av den parafilmede Petri-parabolen fra trinn 1.
   4. Bruk mikroskopet til å velge ~30 Affi-Gel- eller heparinperler ~100 μm i diameter for bruk. Bruk et mikroskop okular retitel for å endre størrelsen på perlene eller bruke det tredje interdigit av et HH 28 embryo som referanse; perlen må være mindre enn interdigit.
   5. Fjern forsiktig så mye av overflødig PBS rundt perlene som mulig og suge dem i 2-5 μL av behandlingsløsningen. Forsikre deg om at løsningen helt dekker perler.
   6. Parallelt forbereder du kontrollperler ved å suge i en løsning som inneholder samme mengde kjøretøy som brukes i den eksperimentelle behandlingsløsningen.
      MERK: Konsentrasjoner må beregnes for hver behandling i henhold til eksperimentet. Bruk riktig personlig verneutstyr ved håndtering av potensielt skadelige reagenser.
   7. Inkuber perlene i løsningen i 30 min ved romtemperatur. For å forhindre at perlene tørker ut under inkubasjonen, pipette noen dråper 1x PBS eller vann rundt perlene for å fukte den lokale atmosfæren og dekke parabolen med parafilm for å bremse fordampning.
   8. Legg Petri-retten på is og implanter perlene i løpet av samme dag.
2. AG 1-X2 perle forberedelse
   1. Klipp en firkant med parafilm for å passe til en 45 mm Petri-tallerken. Dekk bunnen av Petri-parabolen med parafilm og festet ved å skyve hvert toppunkt ved hjelp av enden av ikke-tannede tang. Sette.
   2. Bruk en slikkepott til å overføre AG 1-X2 perler til et mikrosenterrør. Tilsett 30-50 μL av behandlingsløsningen ved ønsket sluttkonsentrasjon.
   3. Parallelt inkuberer du kontrollperlene i en løsning med kjøretøyet alene, tilberedt uten det eksperimentelle kjemikaliet eller proteinet av interesse.
   4. Inkuber perlene i 20 minutter mens du sakte rister ved romtemperatur. Pakk mikrosentrifugerørene med folie for å beskytte mot lys under all inkubasjon, gitt at mange av disse molekylene er lysfølsomme
   5. Fjern så mye av løsningen som mulig ved hjelp av en pipette og flekk med 2% fenolrød oppløst i vann ved romtemperatur i 2 minutter med mild agitasjon i en virvel.
      MERK: Farging av gjennomsiktige AG 1-X2 perler letter implantasjonen i embryoet.
   6. Fjern 2% fenol rød og vask perlene to ganger i 1x PBS for å fjerne overflødig fargestoff.
   7. Med en mikropipettespiss, overfør ~ 40-50 AG 1-X2 perler til midten av den parafilmdekkede Petri-parabolen tilberedt i trinn 1 og suge disse i 5 μL 1x PBS. Under mikroskopet velger du rundt 30 perler som er ~ 100 μm diameter i størrelse. Kast de ubrukte perlene.
   8. Perler er klare til å implanteres. Forsikre deg om at perlene er nedsenket i PBS gjennom implantasjonen ved å pipettere noen dråper 1x PBS eller vann rundt perlene for å fukte den lokale atmosfæren og / eller dekke parabolen med parafilm for å bremse fordampning.

3. Embryomanipulering og interdigit implantasjon

1. Før du manipulerer embryoene, ordne to stereomikroskop ved siden av hverandre på en benkeplate. Den ene er for embryomanipulering og perleimplantasjon, og den andre er for å opprettholde de behandlede perlene som er klare til å implantere inn i embryoet.
2. Bruk ikke-tannede tang, lag et vindu i de resterende eggene som beskrevet i egginkubasjons- og embryooppsamlingsdelen.
3. Under mikroskopet åpner du fostersekken ved å rive fostermembranen med fine kirurgiske tang nær høyre bakben bare med mengden som trengs for å utføre prosedyren (dvs. så lite som mulig).
4. Bruk fine tang, hold embryoet ved fostermembranen for å eksponere høyre bakben. Bruk en fin wolfram nål, lage et hull sentrert i distal-mest av den tredje interdigit av bakbenet.
5. Uten å frigjøre embryoet og det eksponerte bakbenet, ta en behandlet perle fra det andre mikroskopet ved hjelp av en av spissene på tangene. Tangene må være i åpen stilling for at en perle skal holde seg til tangspissen.
6. Overfør perlen inn i kyllingembryoet nær bakbenet og plasser den på toppen av det interdigit hullet.
7. Lukk tangene for å legge trykk på perlen til den kommer inn i hullet.
8. Slipp embryoet og forsegle eggeskallvinduet med tape.
9. Returner eggene til inkubatoren til de har nådd ønsket stadium. Gjenta prosedyren til det nødvendige antall manipulerte embryoer er nådd. Det er viktig å sikre at perlene ikke tørker ut på noe tidspunkt.
   MERK: For å observere en komplett ektopisk finger, inkuber i ~ 72 timer etter perleimplantasjon. I motsetning til dette uttrykkes tidlige differensieringsgener (f.eks. Sox9) ~30 min etter implantasjon av en TGF-ß1-gjennomvåt perle.

Representative Results

Bruke gjennomvåt perler for å evaluere celleadferd i embryonal kylling lem
For å sikre effekten av denne analysen, må perlen plasseres konsekvent og presist på riktig sted; i dette tilfellet er det distale mest av det tredje interdigit under den apikale ektodermale åsen AER (figur 1A). Denne posisjoneringen tillater det aktuelle molekylet å spre seg likt gjennom det interdigitale vevet. Videre inneholder sonen under AER ubeskyttede celler som er lett lydhøre for behandling. For å evaluere effektene på celledifferensiering kan embryoene farges med alcianblå og alizarinrød for å bevise dannelsen av skjelettelementer (figur 1B). Den gjennomvåte perleanalysen er også velegnet til å evaluere celledød med nøytral rød (figur 1C) og genregulering ved in situ hybridisering (figur 1D). Skalalinjen er satt til 250 μm.

Figur 1: Perleimplantasjon i kyllingens interdigitale vev. A) Riktig sted for den gjennomvåte perlen under AER i en 28 HH bakben. (B) Alcian blå og Alizarin rød skjelettfarging bevis dannelsen av et ektopisk siffer indusert 4 dager etter implantering av en TGF-ß1-gjennomvåt perle. (C) Nøytral rød farging markerer celledødsinduksjon (pilspiss) 24 timer etter implantering av en RA-gjennomvåt perle i det interdigitale vevet på 28 HH-stadiet. (D) Sox9 in situ hybridisering 4 h etter at en TGF-ß1-gjennomvåt perle ble implantert. Skalalinjen er satt til 250 μm. Bildene vist i B og C ble tatt fra Díaz-Hernández et ^al.23,24. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den største fordelen med det eksperimentelle verktøyet som er beskrevet i denne protokollen, er å kunne kontrollere tiden og plasseringen av eksponeringen for perler gjennomvåt i et gitt eksperimentelt molekyl. Å kombinere riktig posisjonering med presis utviklingstid gir enorme muligheter til å studere celledifferensieringsprosesser. Å utføre disse eksperimentene i undifferentiated vev gjør det mulig å undersøke de første viktige hendelsene i cellulær avstamning. For eksempel, å plassere en TGFß-gjennomvåt perle i det interdigitale vevet av embryonale lemmer 28 HH resulterer i dannelsen av et ektopisk siffer der en molekylær kaskade utløses som induserer det genetiske uttrykket til master gen Sox9²⁵. Bemerkelsesverdig organiserer det induserte bruskvevet også i et siffer med phalanxdannelse.

Interessant nok utløser RA celledød i samme interdigitale region ved å regulere genuttrykket til benmorfogenetiske proteiner som styrer celle skjebnen til uavklarte celler mot celledød¹⁰. Derfor kan celledifferensiering, celledød, morfogenese og mønster undersøkes samtidig i samme region av et embryo og skreddersys til enhver region og genetisk vei av interesse ^8,9.

Elementene som er avgjørende for suksessen til denne protokollen inkluderer aldri å la de gjennomvåte perlene tørke ut (dvs. de må alltid forbli våte). Det er også viktig å velge de riktige perlene: Affi-Gel og heparinperler er for proteiner, mens AG1-X2 er for kjemikalier oppløst i organiske løsningsmidler. Et annet kritisk punkt er konsentrasjonen av molekylet som finnes i løsningen som brukes til å suge perlene, som vanligvis er 1000 ganger mer konsentrert enn det som ville bli brukt til in vitro-studier . Likevel er en ulempe med denne metoden at den endelige konsentrasjonen av molekyler frigjort fra de gjennomvåte perlene er ukjent, samt frigjøringshastigheten. I protokollen er nevnt at perler-100 μm diameter er mer praktisk for bruk. Tenk på dette når lemmer manipuleres. Viktigst av alt, diameteren på perlene må velges i henhold til implantasjonssonen og konsekvent opprettholdes i hvert embryo. Imidlertid er det ikke sannsynlig at en liten variasjon i perlestørrelse mellom eksperimenter vil påvirke resultatene.

Til slutt avhenger potensialet til den gjennomvåte perleanalysen som er skissert her, bare av forskerens fantasi. Denne protokollen kan brukes på et hvilket som helst eksperimentelt dyr, cellekultur eller organotypisk kulturmodell, inkludert organoider. Videre er denne protokollen et nyttig, greit pedagogisk verktøy for å lære studentene grunnleggende utviklingsbiologiske konsepter og tekniske ferdigheter ved å praktisere denne eksperimentelle manipulasjonen i utviklingsbiologiske klasser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel beads	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 beads	Bio-Rad	1400123
Egg incubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fine surgical forceps	Fine Science Tools	9115-10
Heparine Sepharose beads	Abcam	ab193268
Petri dish	Nest	705001
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Tungsten needle	GoodFellow	E74-15096/01