En metode til at genaktivere stillestående neurale stamceller i dyrkede Drosophila hjerne explants er blevet etableret. Ved hjælp af denne metode kan systemiske signalers rolle afkobles fra vævs-iboende signaler i reguleringen af neurale stamceller quiescence, ind- og udgang.
Neurale stamceller (NSC’er) har evnen til at sprede sig, differentiere, gennemgå apoptose og endda komme ind og ud af stilhed. Mange af disse processer styres af det komplekse samspil mellem NSC’s indre genetiske programmer med NSC’s ydre faktorer, lokale og systemiske. I den genetiske modelorganisme skifter Drosophila melanogaster, NSC’er, kendt som neuroblaster (NB’er), fra quiescens til spredning under den embryonale til larveovergang. I løbet af denne tid kommer larver ud af deres æggeskaller og begynder at kravle og søge kostnæringsstoffer. Som reaktion på dyrefoder producerer fedtlegemet, et endokrint organ med lipidlagringskapacitet, et signal, som frigives systemisk i den cirkulerende hæmolymfe. Som reaktion på det fede kropsafledte signal (FBDS) produceres og frigives Drosophila insulinlignende peptider (Dilps) fra hjernens neurosekretoriske neuroner og glia, hvilket fører til nedstrøms aktivering af PI3-kinase vækstsignalering i NB’er og deres glial- og trakeal niche. Selv om dette er den nuværende model for, hvordan NB’er skifter fra quiescens til spredning, forbliver arten af FBDS-ekstrinsisk cue undvigende. For bedre at forstå, hvordan NB ydre systemiske signaler regulerer udgang fra quiescence, blev der udviklet en metode til dyrkning af tidlige larvehjerner in vitro før dyrefoder. Med denne metode kan eksogene faktorer leveres til kulturmedierne og NB-udgang fra quiescence assayed. Vi fandt ud af, at eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere NB’er fra stilhed i helhjerneeksplanter. Da denne metode er velegnet til store skærme, sigter vi mod at identificere yderligere ydre signaler, der regulerer NB-quiescens versus spredningsbeslutninger. Fordi de gener og veje, der regulerer NSC-spredningsbeslutninger, er evolutionært bevaret, kan resultaterne fra dette assay give indsigt i forbedring af regenerative terapier i klinikken.
Stamceller er af stor interesse på grund af deres potentiale til brug i regenerativ medicin 1,2. Mange dyr, især dem, der er langlivede, opretholder stamceller i deres voksne væv. Disse hjemmehørende stamceller fungerer til at opretholde vævshomeostase og bruges til reparation efter fysisk skade eller sygdom 3,4. De fleste stamceller hos voksne dyr er stillestående, en relativt sovende tilstand karakteriseret ved cellecyklusstop og inaktivering af vækstsignalering5. Som reaktion på ydre signaler forlader stamceller fra stilhed, går ind i cellecyklussen og begynder at generere datterafkom, der er specifikke for deres vævstype. For eksempel, for at montere et effektivt immunrespons, inducerer antigenpræsenterende celler quiescent naive T-celler til at komme ind i cellecyklus og klonalt udvide6. Som reaktion på skeletmuskelskader kommer muskelsatellitstamceller ind i cellecyklussen og genererer datter myoblaster til erstatning for beskadigede myofibriller 5,7. Selvom det er klart, at stillestående stamceller reagerer på ydre signaler, forbliver arten af det ydre signal i mange tilfælde uklart såvel som mekanismen for cue-induceret stamcelleaktivering. At få en bedre forståelse af, hvordan stillestående stamceller reagerer på ydre signaler og kommer ind i cellecyklussen, vil hjælpe med udviklingen af bedre stamcelleterapier i klinikken og øge den videnskabelige viden.
I årtier er modelorganismer blevet brugt til at afdække de gener og cellesignalveje, der regulerer stamcelleproliferation under udvikling og i voksenalderen. I Drosophila deler neurale stamceller (NSC’er), kendt som neuroblaster (NB’er), sig gennem hele udviklingen for at generere alle neuroner og glia, der i sidste ende integreres og danner det neurale kredsløb, der kræves til hjernefunktion 8,9. Ligesom andre stamceller deler NB’er sig asymmetrisk for at forny sig selv og i nogle tilfælde symmetrisk for at udvide stamcellepuljen. NB’er specificeres under embryogenese, og de fleste går ind i stilhed mod slutningen, sammenfaldende med faldende maternelle næringsstoflagre (figur 1). Efter embryogenese er afsluttet, lukker larverne og begynder at fodre. Som reaktion på dyrefodring genaktiverer NB’er fra stilhed og genoptager celledelinger 10,11,12,13,14,15,16. Fordi Drosophila CNS er relativt enkel, og fordi NB’er går ind og ud af quiescence på definerede tidspunkter, viser det sig ideelt at bruge Drosophila til at undersøge reguleringen af quiescence, ind- og udrejse.
Figur 1: Relativ spredning af CB NB’er (centrale hjerneneuroblaster, rød) og MB NB’er (svampekropsneuroblaster, blå) over udviklingstid. Ved afslutningen af embryogenese ophører de fleste NB’er (rød linje) med spredning og går ind i quiescence. Quiescence fortsætter, indtil friskklækkede larver spiser deres første komplette måltid. Tidspunkterne for denne metode betegnes i røde cirkler (1, quiescence og 2, reaktivering). MB NB’er (blå) er en delmængde af centrale hjerne-NB’er, der opdeles kontinuerligt gennem hele udviklingen (4 pr. Hjernehalvdel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Som reaktion på dyrefoder bliver PI3-kinase og TOR vækstsignalveje aktive i NB’er og i deres glial- og trakealniche 10,11,15,16. Når næringsstoffer i kosten trækkes tilbage, eller når niveauet af PI3-kinase reduceres, undlader NB’er at genaktivere, og væksten af glia og luftrør reduceres også 10,11,15,16. Den nuværende model postulerer, at NB-reaktivering er koblet til larvevækst af fedtlegemet, som frigiver et systemisk signal som reaktion på dyrefoder 12,17,18. Dette signal, som forbliver undvigende, fremmer sandsynligvis ekspressionen og frigivelsen af Drosophila insulinlignende peptid (Dilps) i hjernen, hvilket fører til nedstrøms aktivering af PI3-kinase i NB’er og deres glial- og trakeal niche. For bedre at forstå arten af de systemiske signaler udviklede vi en metode til at genaktivere quiescent NB’er i dyrkede hjerneforplantninger. Med denne metode kan reaktivering af NB’er analyseres i fravær af hele dyrs systemiske signaler. Eksogene faktorer kan genforsynes på kulturmedierne og NB-reaktiveringsassayed baseret på inkorporeringen af thymidinanalogen, EdU. Ved hjælp af denne metode fastslog vi, at eksogent insulin er tilstrækkeligt til at genaktivere quiescent NB’er i hjerneeksplanter. Fremtidigt arbejde vil være rettet mod at identificere yderligere faktorer, der, når de tilføjes tilbage, enten positivt eller negativt regulerer NB-quiescens i hjerneforplantninger.
Den her beskrevne metode til dyrkning af hjerneudsendelser kan udføres i de fleste laboratoriemiljøer. De nødvendige værktøjer samt proceduren og dataindsamlingen er enkle og ligetil. Med denne metode kan man teste en række hypoteser, herunder dem, der er relateret til cellesignalkaskader og ydre faktorer, der regulerer NB-reaktivering og proliferation. Her fandt vi ved hjælp af vildtype OregonR-dyr, at eksogent insulin var tilstrækkeligt til at genaktivere NB’er fra quiescens uafhængigt af andre dyrespecifikke …
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender LSAMP Bridges to Doctorate-programmet for finansiering (CNK) samt NIH / NIGMS (R01-GM120421 og R35-GM141886). Vi er taknemmelige for Dr. Conor Sipe for figur 1. Vi takker også alle Siegrist lab medlemmer for deres fortsatte støtte og mentorskab. Vi takker især Chhavi Sood og Gary Teeters for deres omhyggelige læsning af manuskriptet og for at give kommentarer.
10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
63x Objective | Lecia | ||
Active dry yeast | Most supermarkets | ||
Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Superglue | Most supermarkets | ||
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |