Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados
Summary
Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.
Abstract
Las células madre neurales (NSC) tienen la capacidad de proliferar, diferenciarse, sufrir apoptosis e incluso entrar y salir de la inactividad. Muchos de estos procesos están controlados por la compleja interacción entre los programas genéticos intrínsecos del NSC con los factores extrínsecos del NSC, locales y sistémicos. En el organismo modelo genético, Drosophila melanogaster, las NSC, conocidas como neuroblastos (NB), cambian de la inactividad a la proliferación durante la transición embrionaria a larvaria. Durante este tiempo, las larvas emergen de sus cáscaras de huevo y comienzan a gatear, buscando nutrientes dietéticos. En respuesta a la alimentación animal, el cuerpo graso, un órgano endocrino con capacidad de almacenamiento de lípidos, produce una señal, que se libera sistémicamente en la hemolinfa circulante. En respuesta a la señal derivada del cuerpo graso (FBDS), los péptidos similares a la insulina Drosophila (Dilps) se producen y liberan de las neuronas neurosecretoras cerebrales y la glía, lo que lleva a la activación posterior de la señalización de crecimiento de PI3-quinasa en NB y su nicho glial y traqueal. Aunque este es el modelo actual de cómo los NB cambian de la inactividad a la proliferación, la naturaleza de la señal extrínseca FBDS sigue siendo difícil de alcanzar. Para comprender mejor cómo las señales sistémicas extrínsecas NB regulan la salida de la inactividad, se desarrolló un método para cultivar cerebros larvarios tempranos in vitro antes de la alimentación animal. Con este método, se pueden suministrar factores exógenos a los medios de cultivo y se puede ensayar la salida de NB de la inactividad. Encontramos que la insulina exógena es suficiente para reactivar los NB de la inactividad en los explantes de todo el cerebro. Debido a que este método es adecuado para pantallas a gran escala, nuestro objetivo es identificar señales extrínsecas adicionales que regulen la inactividad NB frente a las decisiones de proliferación. Debido a que los genes y las vías que regulan las decisiones de proliferación de NSC se conservan evolutivamente, los resultados de este ensayo podrían proporcionar información sobre la mejora de las terapias regenerativas en la clínica.
Introduction
Las células madre son de gran interés por su potencial de uso en medicina regenerativa 1,2. Muchos animales, especialmente aquellos que son de larga vida, mantienen células madre dentro de sus tejidos adultos. Estas células madre residentes funcionan para mantener la homeostasis tisular y se utilizan para la reparación después de una lesión física o enfermedad 3,4. La mayoría de las células madre en animales adultos están inactivas, un estado relativamente latente caracterizado por la detención del ciclo celular y la inactivación de la señalización del crecimiento5. En respuesta a las señales extrínsecas, las células madre salen de la inactividad, entran en el ciclo celular y comienzan a generar una progenie hija específica para su tipo de tejido. Por ejemplo, para montar una respuesta inmune efectiva, las células presentadoras de antígenos inducen a las células T ingenuas inactivas a entrar en el ciclo celular y expandirse clonalmente6. En respuesta al daño del músculo esquelético, las células madre satélite musculares entran en el ciclo celular y generan mioblastos hijos para reemplazar las miofibrillas dañadas 5,7. Si bien está claro que las células madre inactivas responden a las señales extrínsecas, en muchos casos, la naturaleza de la señal extrínseca sigue sin estar clara, así como el mecanismo de activación de las células madre inducida por la señal. Obtener una mejor comprensión de cómo las células madre inactivas responden a las señales extrínsecas y entran en el ciclo celular ayudará en el desarrollo de mejores terapias con células madre en la clínica y aumentará el conocimiento científico.
Durante décadas, los organismos modelo se han utilizado para descubrir los genes y las vías de señalización celular que regulan la proliferación de células madre durante el desarrollo y en la edad adulta. En Drosophila, las células madre neurales (NSC), conocidas como neuroblastos (NB), se dividen a lo largo del desarrollo para generar todas las neuronas y la glía que finalmente se integran, formando el circuito neuronal requerido para la función cerebral 8,9. Al igual que otras células madre, las NB se dividen asimétricamente para autorrenovarse y, en algunos casos, simétricamente para expandir el grupo de células madre. Los NB se especifican durante la embriogénesis y la mayoría entran en reposo hacia el final, coincidiendo con la disminución de las reservas maternas de nutrientes (Figura 1). Después de que se completa la embriogénesis, las larvas eclosionan y comienzan a alimentarse. En respuesta a la alimentación animal, los NB se reactivan de la inactividad y reanudan las divisiones celulares 10,11,12,13,14,15,16. Debido a que el SNC de Drosophila es relativamente simple y debido a que los NB entran y salen de la inactividad en momentos definidos, el uso de Drosophila para investigar la regulación de la inactividad, la entrada y la salida, resulta ideal.
Figura 1: Proliferación relativa de CB NB (neuroblastos cerebrales centrales, rojo) y MB NB (neuroblastos del cuerpo de hongos, azul) durante el tiempo de desarrollo. Al final de la embriogénesis, la mayoría de los NB (línea roja) cesan la proliferación y entran en reposo. La inactividad continúa hasta que las larvas recién eclosionadas consumen su primera comida completa. Los puntos temporales de enfoque para esta metodología se denotan en círculos rojos (1, inactividad y 2, reactivación). Los NB MB (azules) son un subconjunto de NB cerebrales centrales que se dividen continuamente a lo largo del desarrollo (4 por hemisferio cerebral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En respuesta a la alimentación animal, las vías de señalización de crecimiento pi3-quinasa y TOR se activan en los NB y en su nicho glial y traqueal 10,11,15,16. Cuando se retiran los nutrientes dietéticos o cuando se reducen los niveles de PI3-quinasa, los NB no se reactivan y el crecimiento de la glía y la tráquea también se reduce 10,11,15,16. El modelo actual postula que la reactivación de NB se acopla al crecimiento larvario por parte del cuerpo graso, que libera una señal sistémica en respuesta a la alimentación animal 12,17,18. Esta señal, que sigue siendo esquiva, probablemente promueve la expresión y liberación del péptido similar a la insulina Drosophila (Dilps) en el cerebro, lo que conduce a la activación aguas abajo de la PI3-quinasa en nbes y su nicho glial y traqueal. Para comprender mejor la naturaleza de las señales sistémicas, desarrollamos un método para reactivar los NB quiescentes en explantes cerebrales cultivados. Con este método, la reactivación de los NB se puede ensayar en ausencia de señales sistémicas animales completas. Los factores exógenos pueden ser reabastecidos a los medios de cultivo y la reactivación de NB ensayada en base a la incorporación del análogo de timidina, EdU. Usando este método, determinamos que la insulina exógena es suficiente para reactivar los NB quiescentes en los explantes cerebrales. El trabajo futuro estará dirigido a identificar factores adicionales que, cuando se agregan de nuevo, regulan positiva o negativamente la inactividad NB en los explantes cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí para cultivar explantes cerebrales se puede llevar a cabo en la mayoría de los entornos de laboratorio. Las herramientas requeridas, así como el procedimiento y la recopilación de datos, son simples y directas. Con este método, se pueden probar una variedad de hipótesis, incluidas las relacionadas con las cascadas de señalización celular y los factores extrínsecos que regulan la reactivación y proliferación de NB. Aquí, utilizando animales OregonR de tipo salvaje, encontramos que la i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el programa LSAMP Bridges to Doctorate para la financiación (CNK), así como NIH / NIGMS (R01-GM120421 y R35-GM141886). Agradecemos al Dr. Conor Sipe por la Figura 1. También agradecemos a todos los miembros del laboratorio Siegrist por su continuo apoyo y tutoría. Agradecemos especialmente a Chhavi Sood y Gary Teeters por su cuidadosa lectura del manuscrito y por proporcionar comentarios.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
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