Summary

Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas

Published: May 18, 2022
doi:

Summary

Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.

Abstract

As células-tronco neurais (NSCs) têm a capacidade de proliferar, diferenciar, sofrer apoptose, e até mesmo entrar e sair da quiescência. Muitos desses processos são controlados pela complexa interação entre programas genéticos intrínsecos do NSC com fatores extrínsecos do NSC, locais e sistêmicos. No organismo modelo genético, Drosophila melanogaster, NSCs, conhecidos como neuroblastos (NBs), mudam de quiescência para proliferação durante a transição embrionária para larval. Durante esse tempo, as larvas emergem de suas cascas de ovos e começam a engatinhar, buscando nutrientes dietéticos. Em resposta à alimentação animal, o corpo gordo, um órgão endócrino com capacidade de armazenamento lipídico, produz um sinal, que é liberado sistematicamente no hemoglifo circulante. Em resposta ao sinal derivado do corpo gordo (FBDS), peptídeos semelhantes à insulina drosophila (Dilps) são produzidos e liberados de neurônios neurosecretores cerebrais e glia, levando à ativação a jusante da sinalização de crescimento PI3-quinase em NBs e seu nicho glial e traqueial. Embora este seja o modelo atual de como os NBs mudam da quiescência para a proliferação, a natureza da sugestão extrínseca da FBDS permanece indescritível. Para entender melhor como as pistas sistêmicas extrínsecas da NB regulam a saída da quiescência, um método foi desenvolvido para cultivar cérebros larvais precoces in vitro antes da alimentação animal. Com este método, fatores exógenos podem ser fornecidos aos meios de comunicação cultural e à saída do NB da quiescência avaliada. Descobrimos que insulina exógena é suficiente para reativar NBs de quiescência em explantas cerebrais inteiras. Como este método é adequado para telas de grande escala, pretendemos identificar pistas extrínsecas adicionais que regulam as decisões de quiescência versus proliferação da NB. Como os genes e caminhos que regulam as decisões de proliferação do NSC são evolutivamente conservados, os resultados deste ensaio poderiam fornecer insights sobre a melhoria das terapias regenerativas na clínica.

Introduction

As células-tronco são de grande interesse devido ao seu potencial de uso na medicina regenerativa 1,2. Muitos animais, especialmente aqueles que são de longa duração, mantêm células-tronco dentro de seus tecidos adultos. Essas células-tronco residentes funcionam para manter a homeostase tecidual e são utilizadas para reparo após lesões físicas ou doença 3,4. A maioria das células-tronco em animais adultos são quiescentes, um estado relativamente adormecido caracterizado pela parada do ciclo celular e pela inativação da sinalização de crescimento5. Em resposta a sinais extrínsecos, as células-tronco saem da quiescência, entram no ciclo celular e começam a gerar progêneria filha específica ao seu tipo de tecido. Por exemplo, a fim de montar uma resposta imune eficaz, as células que apresentam antígenos induzem células T ingênuas quiescentes a entrar no ciclo celular e expandir clonalmente6. Em resposta à lesão muscular esquelética, células-tronco de satélite muscular entram no ciclo celular e geram myoblasts da filha para substituir myofibrils danificados 5,7. Embora esteja claro que as células-tronco quiescentes respondem a sinais extrínsecos, em muitos casos, a natureza da sugestão extrínseca permanece incerta, bem como o mecanismo de ativação de células-tronco induzidas por sinais. Obter uma melhor compreensão de como as células-tronco quiescentes respondem a sinais extrínsecos e entram no ciclo celular ajudará no desenvolvimento de melhores terapias com células-tronco na clínica e aumentarão o conhecimento científico.

Há décadas, organismos modelo têm sido usados para descobrir os genes e caminhos de sinalização celular que regulam a proliferação de células-tronco durante o desenvolvimento e na idade adulta. Em Drosophila, as células-tronco neurais (NSCs), conhecidas como neuroblastos (NBs), se dividem ao longo do desenvolvimento para gerar todos os neurônios e glia que finalmente se integram, formando o circuito neural necessário para a função cerebral 8,9. Como outras células-tronco, os NBs se dividem assimetricamente para se auto-renovar e, em alguns casos, simetricamente para expandir o pool de células-tronco. Os NBs são especificados durante a embriogênese e a maioria entra na quiescência no final, coincidentemente com o declínio dos estoques de nutrientes maternos (Figura 1). Depois que a embriogênese estiver completa, as larvas eclodem e comecem a se alimentar. Em resposta à alimentação animal, os NBs reativam a partir da quiescência e retomam as divisões celulares 10,11,12,13,14,15,16. Porque o CNS de Drosophila é relativamente simples e porque os NBs entram e saem da quiescência em horários definidos, usar drosophila para investigar a regulação da quiescência, entrada e saída, prova o ideal.

Figure 1
Figura 1: Proliferação relativa de NBs CB (neuroblastos cerebrais centrais, vermelho) e MB NBs (neuroblastos do corpo de cogumelos, azul) ao longo do tempo de desenvolvimento. No final da embriogênese, a maioria dos NBs (linha vermelha) cessam a proliferação e entram na quiescência. A quiescência continua até que larvas recém-eclodidas consumam sua primeira refeição completa. Os pontos de foco desta metodologia são denotados em círculos vermelhos (1, quiescência e 2, reativação). MB NBs (azul) são um subconjunto de NBs cerebrais centrais que se dividem continuamente durante o desenvolvimento (4 por hemisfério cerebral). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em resposta à alimentação animal, as vias de sinalização de crescimento PI3-quinase e TOR tornam-se ativas em NBs e em seu nicho glial e traqueal 10,11,15,16. Quando os nutrientes dietéticos são retirados ou quando os níveis de PI3-quinase são reduzidos, os NBs não reativam e o crescimento da glia e traqueia também são reduzidosem 10,11,15,16. O modelo atual afirma que a reativação da NB está acoplada ao crescimento larval pelo corpo de gordura, que libera um sinal sistêmico em resposta à alimentação animal 12,17,18. Este sinal, que permanece indescritível, provavelmente promove a expressão e liberação de peptídeo semelhante à insulina Drosophila (Dilps) no cérebro, o que leva à ativação a jusante de PI3-kinase em NBs e seu nicho glial e traqueal. Para entender melhor a natureza das deixas sistêmicas, desenvolvemos um método para reativar NBs quiescentes em explantas cerebrais cultivadas. Com este método, a reativação de NBs pode ser avaliada na ausência de pistas sistêmicas animais inteiras. Fatores exógenos podem ser reabastecidos aos meios de cultura e à reativação de NB conforme a incorporação do analógico de timmidina, EdU. Usando este método, determinamos que a insulina exógena é suficiente para reativar NBs quiescentes em explantas cerebrais. O trabalho futuro será direcionado para identificar fatores adicionais que, quando adicionados de volta, regulam positiva ou negativamente a quiescência de NB em explantas cerebrais.

Protocol

1. Coleta de larvas de Drosophila NOTA: Prepare a placa de levedura, a pasta de uva e o condomínio Fly antes de iniciar: Pasta de levedura: Em um recipiente pequeno, misture 5 g de levedura seca ativa com 10 mL de água para formar uma pasta que tenha a consistência de manteiga de amendoim. Cubra a pasta de levedura com plástico e use um elástico para fixá-lo firmemente ao recipiente.NOTA: A pasta de levedura fresca se expandirá em seu recipiente e…

Representative Results

Cérebros selvagens recém-eclodidos do OregonR foram dissecados e cultivados por 24 h na mídia de Schneider (SSM) com insulina. Os tecidos foram fixados e manchados de acordo com o protocolo. Foram utilizados anticorpos primários gerados contra Deadpan (Dpn) para detectar NBs e Rabiscos para rotular membranas celulares. O analógico timmidina 5-Ethynyl-2′-desoxyuridina (Edu) foi adicionado para detectar a entrada da fase S e a reativação de NB. Encontramos NBs edu positivos de grande porte e DPN positivo após 24 …

Discussion

O método descrito aqui para cultivar explanações cerebrais pode ser realizado na maioria dos ambientes de laboratório. As ferramentas necessárias, bem como o procedimento e a coleta de dados, são simples e simples. Com este método, pode-se testar uma variedade de hipóteses, incluindo aquelas relacionadas às cascatas de sinalização celular e fatores extrínsecos que regulam a reativação e proliferação do RN. Aqui, usando animais oregonr de tipo selvagem, descobrimos que a insulina exógena era suficiente pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos o programa LSAMP Bridges to Doctorate para financiamento (CNK) e o NIH/NIGMS (R01-GM120421 e R35-GM141886). Somos gratos ao Dr. Conor Sipe pela Figura 1. Agradecemos também a todos os membros do laboratório Siegrist por seu apoio contínuo e mentoria. Agradecemos especialmente a Chhavi Sood e Gary Teeters por sua leitura cuidadosa do manuscrito e por fornecer comentários.

Materials

10 µL Pipette tips Denville Sci P2102
1000 µL Pipette tips Denville Sci P2103-N
1000 µL Pipettor Gilson P1000
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) Electron Microscopy Sciences 2912.60.0000 Used for Fixation of Larval Brains
20 µL Pipette Gilson P20
200 µL Pipette tips Gilson P200
200 µL Pipette tips Denville Sci 1158U56
24-well multiwell culture plates Fisher Scientific 50-197-4477
35 mm Petri dishes Fisher Scientific 08-757-100A Grape Plate Ingredients
4 °C refrigerator Fisher Scientific Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution
63x Objective Lecia
Active dry yeast Most supermarkets
Agarose Fisher Scientific 214010 Grape Plate Ingredients
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye Thermo Fisher Scientific C10340 to label proliferating cells
Confocal Microscope Leica SP8
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz Fisher Scientific 12-544-10 Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged.
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm Fisher Scientific 12-545E The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging.
Dissecting microscope Zeiss Stemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle Fisher Scientific 2701 Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium
Fetal Bovine Serum (10%) Sigma F4135-100ML Supplement for cell culture media.
Fine forceps for dissection Fine Science Tools 11295-20 Forcepts used in disections. They work best when sharpened.
Fly Bottles for Crossing Genessee Scientific 32-130 This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate.
Glass Dissection Dish (3 well) These are no longer available
Glutathione Sigma G6013 Provides oxidative protection during cell culture.
Goat Serum Sigma G9023- 10ML Blocking Agent
Grape Plates Made in house Made in house Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs
Image J Imagej.net/fiji/downloads Free Download:  https://fiji.sc Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation
Incubator Thermo Fisher Scientific Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Insulin Sigma I0516 Independant variable of the experiment
Laminar flow hood For aliquoting culture media
L-Glutamine Sigma G7513 Provides support during cell culture
Nunc 72-well Microwell Mini Trays Fisher Scientific 12-565-154 Immunostaining steps are performed in this tray
Parafilm Fisher Scientific S37440 Film used to seal plates in order to prevent evaporation
Pen-Strep Sigma P4458-100ml Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
Phosphate Buffer, pH7.4 Made in house Made in house Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps
Pick Fine Science Tools 10140-01 Used to pick larvae off of the grape plate
Propionic acid Fisher Scientific A-258 Grape Plate Ingredients
Rabbit 405 Abcam ab175653 Antibodies used for immunostaining
Rat 555 Abcam ab150166 Antibodies used for immunostaining
Rb Scribble A Gift from Chris Doe Antibodies used for immunostaining
Rt Deadpan Abcam ab195173 Antibodies used for immunostaining
Schneiders Culture Medium Life Tech 21720024 Contains nutrients that help the cells grow and proliferate
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) Life Tech S36963 Reagent that provides protection against fading fluorophores
Sterile Water Autoclave Milli-Q water made in house Needed for Solutions
Sucrose Fisher S2-12 Grape Plate Ingredients
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Superglue Most supermarkets
Tegosept Genesee Scientific 20-259 Grape Plate Ingredients
Triton-X 100 Sigma T9284-100ML PBT
Welch's 100% grape grape juice Most supermarkets Grape Plate Ingredients

References

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Cite This Article
Naomi Keliinui, C., Doyle, S. E., Siegrist, S. E. Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants. J. Vis. Exp. (183), e63189, doi:10.3791/63189 (2022).

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