Summary

Реактивация нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы

Published: May 18, 2022
doi:

Summary

Установлен метод реактивации покоящихся нервных стволовых клеток в культивируемых эксплантах мозга дрозофилы . Используя этот метод, роль системных сигналов может быть отделена от тканевых внутренних сигналов в регуляции покоя, входа и выхода нервных стволовых клеток.

Abstract

Нервные стволовые клетки (НСК) обладают способностью пролиферировать, дифференцироваться, подвергаться апоптозу и даже входить и выходить из покоя. Многие из этих процессов контролируются сложным взаимодействием между внутренними генетическими программами НСК с внешними факторами НБК, локальными и системными. В генетическом модельном организме , Drosophila melanogaster, NSC, известные как нейробласты (NB), переключаются с покоя на пролиферацию во время эмбрионального перехода к личиночному. За это время личинки выходят из своей яичной скорлупы и начинают ползать, ища диетические питательные вещества. В ответ на кормление животных жировое тело, эндокринный орган с емкостью для хранения липидов, вырабатывает сигнал, который системно высвобождается в циркулирующую гемолимфу. В ответ на сигнал, полученный из жирового тела (FBDS), инсулиноподобные пептиды Drosophila (Dilps) производятся и высвобождаются из нейросекреторных нейронов мозга и глии, что приводит к последующей активации сигналов роста PI3-киназы в NB и их глиальной и трахеальной нише. Хотя это текущая модель того, как НБ переключаются с покоя на распространение, природа внешнего сигнала FBDS остается неуловимой. Чтобы лучше понять, как внешние системные сигналы NB регулируют выход из покоя, был разработан метод культивирования раннего личиночного мозга in vitro перед кормлением животных. С помощью этого метода экзогенные факторы могут подаваться в культуральную среду и выходить NB из анализа покоя. Мы обнаружили, что экзогенного инсулина достаточно для реактивации NB из покоя в эксплантах всего мозга. Поскольку этот метод хорошо подходит для крупномасштабных экранов, мы стремимся выявить дополнительные внешние сигналы, которые регулируют NB по сравнению с решениями о распространении. Поскольку гены и пути, которые регулируют решения о пролиферации НСК, эволюционно сохраняются, результаты этого анализа могут дать представление об улучшении регенеративной терапии в клинике.

Introduction

Стволовые клетки представляют большой интерес из-за их потенциала для использования в регенеративной медицине 1,2. Многие животные, особенно долгоживущие, поддерживают стволовые клетки во взрослых тканях. Эти резидентные стволовые клетки функционируют для поддержания тканевого гомеостаза и используются для восстановления после физической травмы или заболевания 3,4. Большинство стволовых клеток у взрослых животных находятся в состоянии покоя, относительно спящем состоянии, характеризующемся остановкой клеточного цикла и инактивацией сигналов роста5. В ответ на внешние сигналы стволовые клетки выходят из покоя, входят в клеточный цикл и начинают генерировать дочернее потомство, специфичное для их типа ткани. Например, чтобы установить эффективный иммунный ответ, антигенпрезентирующие клетки индуцируют покоящиеся наивные Т-клетки входить в клеточный цикл и клонально расширяться6. В ответ на повреждение скелетных мышц мышечные сателлитные стволовые клетки входят в клеточный цикл и генерируют дочерние миобласты для замены поврежденных миофибрилл 5,7. Хотя ясно, что покоящиеся стволовые клетки реагируют на внешние сигналы, во многих случаях природа внешнего сигнала остается неясной, а также механизм активации стволовых клеток, индуцированных сигналом. Получение лучшего понимания того, как покоящиеся стволовые клетки реагируют на внешние сигналы и входят в клеточный цикл, поможет в разработке лучших методов лечения стволовыми клетками в клинике и увеличит научные знания.

На протяжении десятилетий модельные организмы использовались для выявления генов и клеточных сигнальных путей, которые регулируют пролиферацию стволовых клеток во время развития и во взрослой жизни. У дрозофилы нервные стволовые клетки (НСК), известные как нейробласты (НБ), делятся на протяжении всего развития, чтобы генерировать все нейроны и глию, которые в конечном итоге интегрируются, образуя нейронную цепь, необходимую для функции мозга 8,9. Как и другие стволовые клетки, NB делятся асимметрично для самообновления и, в некоторых случаях, симметрично для расширения пула стволовых клеток. NB определяются во время эмбриогенеза, и большинство из них входят в состояние покоя к концу, что совпадает с уменьшением запасов питательных веществ у матери (рисунок 1). После завершения эмбриогенеза личинки вылупляются и начинают питаться. В ответ на кормление животных NB реактивируются из покоя и возобновляют деление клеток 10,11,12,13,14,15,16. Поскольку дрозофила ЦНС относительно проста и поскольку NB входят и выходят из покоя в определенное время, использование дрозофилы для исследования регуляции покоя, входа и выхода оказывается идеальным.

Figure 1
Рисунок 1: Относительная пролиферация CB NB (центральные нейробласты головного мозга, красный) и MB NBs (нейробласты грибного тела, синий) в течение времени развития. В конце эмбриогенеза большинство НБ (красная линия) прекращают пролиферацию и вступают в состояние покоя. Покой продолжается до тех пор, пока свежевылупившиеся личинки не съедят свой первый полноценный прием пищи. Временные точки фокусировки для этой методологии обозначены красными кругами (1, покоя и 2, реактивация). MB NB (синий) представляют собой подмножество центральных NB мозга, которые постоянно делятся на протяжении всего развития (4 на полушарие мозга). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В ответ на кормление животных сигнальные пути роста PI3-киназы и TOR становятся активными в NB и в их глиальной и трахеальной нише 10,11,15,16. Когда диетические питательные вещества выводятся или когда уровни PI3-киназы снижаются, NB не могут реактивироваться, и рост глии и трахеи также снижаетсяна 10,11,15,16. Текущая модель утверждает, что реактивация NB связана с ростом личинок жировым телом, которое высвобождает системный сигнал в ответ на кормление животных 12,17,18. Этот сигнал, который остается неуловимым, вероятно, способствует экспрессии и высвобождению инсулиноподобного пептида Drosophila (Dilps) в мозге, что приводит к последующей активации PI3-киназы в NB и их глиальной и трахеальной нише. Чтобы лучше понять природу системных сигналов, мы разработали метод реактивации покоящихся NB в культивируемых эксплантах мозга. С помощью этого метода реактивация NB может быть проанализирована при отсутствии системных сигналов всего животного. Экзогенные факторы могут поступать в культуральную среду, а реактивация NB анализируется на основе включения аналога тимидина, EdU. Используя этот метод, мы определили, что экзогенного инсулина достаточно для реактивации покоящихся NB в эксплантах мозга. Будущая работа будет направлена на выявление дополнительных факторов, которые при добавлении обратно либо положительно, либо отрицательно регулируют состояние NB в мозговых эксплантах.

Protocol

1. Коллекция личинок дрозофилы ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте дрожжевую тарелку, виноградную пасту и кондоминиум Fly перед началом: Дрожжевая паста: В небольшой емкости смешайте 5 г активных сухих дрожжей с 10 мл воды, чтобы сформировать пасту, которая имеет кон?…

Representative Results

Свежевылупившиеся мозги дикого типа OregonR были рассечены и культивированы в течение 24 ч в дополненной среде Шнайдера (SSM) инсулином. Ткани фиксировались и окрашивались согласно протоколу. Использовались первичные антитела, генерируемые против Deadpan (Dpn) для обнаружения NB и Scribble для маркир?…

Discussion

Описанный здесь способ культивирования эксплантов мозга может быть выполнен в большинстве лабораторных сред. Необходимые инструменты, а также процедура и сбор данных просты и понятны. С помощью этого метода можно проверить различные гипотезы, в том числе связанные с клеточными сигнал…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы приветствуем программу LSAMP Bridges to Doctorate для финансирования (CNK), а также NIH / NIGMS (R01-GM120421 и R35-GM141886). Мы благодарны доктору Конору Сайпу за рисунок 1. Мы также благодарим всех членов лаборатории Siegrist за их постоянную поддержку и наставничество. Мы особенно благодарим Чхави Суда и Гэри Титерса за внимательное прочтение рукописи и за предоставленные комментарии.

Materials

10 µL Pipette tips Denville Sci P2102
1000 µL Pipette tips Denville Sci P2103-N
1000 µL Pipettor Gilson P1000
16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) Electron Microscopy Sciences 2912.60.0000 Used for Fixation of Larval Brains
20 µL Pipette Gilson P20
200 µL Pipette tips Gilson P200
200 µL Pipette tips Denville Sci 1158U56
24-well multiwell culture plates Fisher Scientific 50-197-4477
35 mm Petri dishes Fisher Scientific 08-757-100A Grape Plate Ingredients
4 °C refrigerator Fisher Scientific Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution
63x Objective Lecia
Active dry yeast Most supermarkets
Agarose Fisher Scientific 214010 Grape Plate Ingredients
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye Thermo Fisher Scientific C10340 to label proliferating cells
Confocal Microscope Leica SP8
Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz Fisher Scientific 12-544-10 Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged.
Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm Fisher Scientific 12-545E The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging.
Dissecting microscope Zeiss Stemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle Fisher Scientific 2701 Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium
Fetal Bovine Serum (10%) Sigma F4135-100ML Supplement for cell culture media.
Fine forceps for dissection Fine Science Tools 11295-20 Forcepts used in disections. They work best when sharpened.
Fly Bottles for Crossing Genessee Scientific 32-130 This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate.
Glass Dissection Dish (3 well) These are no longer available
Glutathione Sigma G6013 Provides oxidative protection during cell culture.
Goat Serum Sigma G9023- 10ML Blocking Agent
Grape Plates Made in house Made in house Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs
Image J Imagej.net/fiji/downloads Free Download:  https://fiji.sc Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation
Incubator Thermo Fisher Scientific Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Insulin Sigma I0516 Independant variable of the experiment
Laminar flow hood For aliquoting culture media
L-Glutamine Sigma G7513 Provides support during cell culture
Nunc 72-well Microwell Mini Trays Fisher Scientific 12-565-154 Immunostaining steps are performed in this tray
Parafilm Fisher Scientific S37440 Film used to seal plates in order to prevent evaporation
Pen-Strep Sigma P4458-100ml Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
Phosphate Buffer, pH7.4 Made in house Made in house Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps
Pick Fine Science Tools 10140-01 Used to pick larvae off of the grape plate
Propionic acid Fisher Scientific A-258 Grape Plate Ingredients
Rabbit 405 Abcam ab175653 Antibodies used for immunostaining
Rat 555 Abcam ab150166 Antibodies used for immunostaining
Rb Scribble A Gift from Chris Doe Antibodies used for immunostaining
Rt Deadpan Abcam ab195173 Antibodies used for immunostaining
Schneiders Culture Medium Life Tech 21720024 Contains nutrients that help the cells grow and proliferate
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) Life Tech S36963 Reagent that provides protection against fading fluorophores
Sterile Water Autoclave Milli-Q water made in house Needed for Solutions
Sucrose Fisher S2-12 Grape Plate Ingredients
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7
Superglue Most supermarkets
Tegosept Genesee Scientific 20-259 Grape Plate Ingredients
Triton-X 100 Sigma T9284-100ML PBT
Welch's 100% grape grape juice Most supermarkets Grape Plate Ingredients

References

  1. Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  3. Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
  4. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
  5. van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
  6. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
  7. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  9. Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
  10. Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
  11. Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
  12. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  13. Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
  14. Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
  15. Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
  16. Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
  17. Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
  18. Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
  19. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
  20. Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
  21. Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
  22. Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).

Play Video

Cite This Article
Naomi Keliinui, C., Doyle, S. E., Siegrist, S. E. Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants. J. Vis. Exp. (183), e63189, doi:10.3791/63189 (2022).

View Video